CN111406106A - 多嵌合细胞以及移植疗法与免疫缺陷和遗传病症的治疗 - Google Patents

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Abstract

提供了通过来自三个或更多个不同供体的三个或更多个造血干细胞、间充质干细胞、成肌细胞、周细胞或卫星细胞或其组合的离体融合而产生的多嵌合细胞，以及这些细胞在移植疗法和治疗免疫缺陷和遗传病症中的用途。

Description

多嵌合细胞以及移植疗法与免疫缺陷和遗传病症的治疗
介绍
本申请要求享有于2017年11月28日提交的美国临时专利申请序列号62/591,397的优先权的权益，所述美国临时专利申请的内容通过引用整体并入本文。
本发明是以国防部授予号W81XWH-13-2-0053在政府的支持下完成的。政府拥有本发明的某些权利。
背景技术
干细胞移植是治疗许多人类病症的有前途的新策略。造血干细胞(HSC)移植物是基于干细胞疗法的治疗潜力的最具指导意义的示例。尽管自体的HSC可能不是许多血液病的治疗选择，但由于缺乏匹配的相关供体，同种异体干细胞移植物的可用性受到限制。此外，匹配的不相关的HSC移植物常常因由于调理方案和移植物抗宿主病(GvHD)的毒性作用而导致的过高的死亡率和发病率而受阻。在没有GvHD风险的情况下，跨组织相容性障碍来实施移植的植入率或效果和能力的改善将极大地增加HSC移植作为针对许多通常无法治愈的疾病的新治疗手段选择的应用。
已通过多种离体融合方法开发了嵌合细胞(Siemionow,等人(2012)Ann.Plast.Surg.69(5):575-9；Cwykiel&Siemionow(2015)Plastic and ReconstructiveSurgery:Experimental Models and Research Design,Siemionow(编辑),施普林格出版社伦敦有限公司(Springer-Verlag London,Ltd.),第71-72章)。已经描述了在不同实验模型中应用的嵌合细胞疗法，包括血管化复合同种异体移植(VCA)、放射线疗法和肌营养不良动物模型(Arslan,等人(2007)Microsurgery 27:190-9；Kulahci,等人(2010)Transplantation 90(8):843-52；Hivelin,等人(2016)Arch.Immunol.Ther.Exp.(Warsz).64(4):299-310；Siemionow,等人(2016)Microsurgery 36(8):676-683)。
发明内容
本发明是一种多嵌合细胞，其由来自三个或更多个不同供体的三个或更多个造血干细胞、间充质干细胞、成肌细胞、周细胞、卫星细胞或其组合的融合体组成。在某些实施方式中，造血干细胞分离自骨髓、脐带血、外周血或其组合。在其它实施方式中，供体是相关的供体、不相关的供体或其组合。在一些实施方式中，融合体是造血干细胞与独立地选自造血干细胞和间充质干细胞的两个或更多个细胞的组合。在其它实施方式中，融合体是造血干细胞与独立地选自造血干细胞、间充质干细胞和周细胞的两个或更多个细胞的组合。在其它实施方式中，融合体是成肌细胞与独立选自间充质干细胞、成肌细胞和卫星细胞的两个细胞的组合。在特定的实施方式中，融合体是如下的组合：造血干细胞、间充质干细胞和周细胞；三个造血干细胞；成肌细胞、间充质干和卫星细胞；或三个成肌细胞。还提供了试剂盒，所述试剂盒包括融合剂，以及选自来自三个或更多个不同供体的造血干细胞、间充质干细胞、成肌细胞、周细胞，卫星细胞的三个或更多个供体细胞。
本发明还提供了通过向需要治疗的受试者中的受试者施用有效量的本发明的多嵌合细胞来治疗免疫缺陷或遗传病症的方法。在一些实施方式中，多嵌合细胞通过骨内注射、静脉内注射或肌内注射施用。在其它实施方式中，免疫缺陷或遗传病症选自骨髓衰竭、腺苷脱氨酶(ADA)缺陷、重症联合免疫缺陷(SCID)、迪乔治综合症(DiGeorge Syndrome)、共济失调毛细血管扩张症，肌肉萎缩症、I型糖尿病，戈谢病、白血病、再生障碍性贫血，镰状细胞性贫血，淋巴瘤和多发性骨髓瘤。在涉及肌肉萎缩症的治疗的实施方式中，优选地，多嵌合细胞由成肌细胞和独立地选自间充质干细胞、成肌细胞和卫星细胞的两个或更多个细胞的融合体组成。在涉及镰状细胞性贫血的治疗的实施方式中，优选地，多嵌合细胞是造血干细胞与独立地选自造血干细胞和间充质干细胞的两个或更多个细胞的融合体。
本发明还提供了通过向接受同种异体造血干细胞移植物或器官移植物的受试者施用有效量的本发明的多嵌合细胞来预防受试者中的GvHD的发展或降低GvHD的严重性的方法。根据本发明的这一方面，优选地，多嵌合细胞是造血干细胞与独立地选自造血干细胞和间充质干细胞的两个或更多个细胞的融合体。
附图说明
图1示出了用于产生人多嵌合细胞(MCC)的离体融合过程。从至少三个或更多个相关的和/或不相关的供体获得人造血干细胞(HSC)。融合之前，将细胞分别用PKH26(红色)或PKH67(绿色)或eFluor670(品红色)染料进行荧光标记。使用聚乙二醇(PEG)对荧光标记的细胞进行细胞融合。通过荧光激活细胞分选(FACS)选择经过融合的三重(PKH26、PKH67和eFluor670)染色细胞。将多嵌合(三重)细胞通过全身性骨内注射递送至移植物或免疫缺陷患者体内。
具体实施方式
现已开发出用于移植疗法和治疗免疫缺陷和遗传病症患者的多嵌合细胞。本发明的多嵌合细胞是通过来自至少三个(三重嵌合体)或更多个(四重嵌合体和多代嵌合体等)相关和/或不相关的供体(图1)的人造血干细胞(自体型和/或同种异体型)的融合而产生的。具体而言，通过如下造血起源细胞的PEG介导的体外融合产生了多代嵌合细胞：造血干细胞(HSC)，或脐带血(UCB)细胞，或骨髓(BM)细胞，或HSC和/或UCB和/或BM的组合。所得的多嵌合细胞在其表面上表达对各自多细胞供体具有特异性的HLA抗原。由多嵌合细胞建立的微环境减轻了免疫抑制和调理方案的副作用并增强了HSC植入而不存在GvHD。本方法将允许治疗多种免疫病症和遗传病症。
因此，本发明是一种多嵌合细胞，其是来自三个或更多个不同供体的三个或更多个造血干细胞、间充质干细胞、成肌细胞、周细胞或卫星细胞或其组合的离体融合的产物，其中所述融合在外源融合剂的存在下进行。为了本发明的目的，“多嵌合细胞”是由三个或更多个生物细胞(亲本细胞)的细胞融合或杂交(全细胞杂交)构建的细胞。尽管本发明的多嵌合细胞被称为“多嵌合细胞”，但是所述嵌合细胞旨在表示单个细胞或细胞群。
“造血干细胞”或“HSC”是指能够最终分化为造血系统所有细胞类型的克隆源性自我更新多能细胞，包括B细胞、T细胞、NK细胞、淋巴树突细胞、髓样树突细胞、粒细胞、巨噬细胞、巨核细胞和红系细胞。用于鉴定HSC的标志物表型是本领域公知的。对于人HSC，细胞标志物表型优选包括CD34+CD38-CD90(Thy1)+Lin-。对于小鼠HSC，示例性细胞标志物表型是Sca-1+CD90+(参见，例如，Spangrude等人(1988)Science 1:661-673)或c-kit+Thylo Lin-Sca-1+(参见,Uchida,等人(1998)J.Clin.Invest.101(5):961-966)。可替代HSC标志物，例如醛脱氢酶(参见Storms,等人(1999)Proc.Nat'l Acad.Sci.96:9118-23)、AC133(参见Yin,等人(1997)Blood 90:5002-12)和CD150(SLAM)(参见Kiel(2005)Cell121(7):1109-21)也可以找到有利的用途。在某些实施方式中，所述造血干细胞分离自骨髓、脐带血和/或外周血。
“间充质干细胞”或“MSC”是可以产生结缔组织、骨骼、软骨以及循环系统和淋巴系统中的细胞的细胞。间充质干细胞存在于间充质中，间充质是由松散堆积的梭形或星形非特异性细胞组成的胚胎中胚层的部分。间充质干细胞可以通过常规方法获得，并且可以通过以下标志物中的一个或多个鉴定：CD29、CD31–、CD34–、CD44、CD45–、CD51、CD73、CD90/Thy-1、CD105、CD166、整合蛋白α1、PDGF Rα、巢蛋白、Sca-1+、SCF R/c-试剂盒、STRO-1、和VCAM-1。在一些实施方式中，间充质干细胞源自或获自骨髓(BM)或脂肪组织(ASC)。在特定的实施方式中，间充质干细胞源自或获自人骨髓。
如本领域中常规的，“成肌细胞”是指具有发展成肌纤维的潜力的原始肌细胞。成肌细胞的特征在于肌间线蛋白和CD56的表达，并且可以使用本领域已知的方法从胎儿或成人组织获得。参见，例如，WO 93/03768，其公开了通过流式细胞术(例如,FAC)从粗细胞群中分离成肌细胞。可替代地，可通过在培养物中生长和繁殖源自肌肉活检的成肌细胞来获得成肌细胞。参见,例如,Springer,等人(1997)In:Current Human Genetics.单元13.4,Boyle编辑.John Wiley&Sons,NY。
如本文所用，“周细胞”是与小血管的壁相关的多能细胞。先前的研究表明，周细胞可以分化为各种细胞类型，例如脂肪细胞、软骨细胞、纤维母细胞和巨噬细胞。周细胞的特征在于以下标志物中的一个的表达：波形蛋白、神经胶质2(NG2)、血小板源性的生长因子受体β(PDGFR-β)和α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)。
“卫星细胞”是成熟肌纤维的单核成肌细胞，负责出生后肌肉的生长和体内再生。用于表征卫星细胞的标志物包括但不限于，M-钙粘蛋白，CD34和c-met。卫星细胞可以通过已知方法从肌肉组织分离(参见,例如,US 2007/0224168)。
如本文所用，供体是提供用于本发明的多嵌合细胞的制备中的细胞的受试者。供体优选是健康的供体，即，不患有遗传病症或疾病的个体。此外，供体可以是任何哺乳动物，包括人、小鼠、大鼠、狗、猫、马等。在特定的实施方式中，供体是人。
供体可以是受试者或细胞库供体的遗传亲属(例如父母或兄弟姐妹)。因此，在一些实施方式中，用于生成多嵌合细胞的一个或多个细胞是自体的。在其它实施方式中，用于生成多嵌合细胞的所有细胞都是自体的。在另外的实施方式中，用于生成多嵌合细胞的一个或多个细胞是同种异体的。在又一些其它实施方式中，用于生成多嵌合细胞的所有细胞都是同种异体的。
如本文所用，“自体的”，当其涉及细胞的分离和移植时是指其中供体和受体是同一个体的细胞。因此，从受试者收获自体的细胞，然后返回至同一受试者。相反，“同种异体的”细胞是其中供体和受体是来自同一物种的遗传学上不同的个体的细胞。相比之下，“异种异体的”细胞是其中供体和受体属于不同物种的细胞。
如所指出的，本发明的多嵌合干细胞是三个或更多个造血干细胞、间充质干细胞、成肌细胞、周细胞或卫星细胞或其组合的融合体。在一些实施方式中，多嵌合干细胞是包含选自造血干细胞、间充质干细胞、成肌细胞、周细胞和卫星细胞的三个细胞或由选自造血干细胞、间充质干细胞、成肌细胞、周细胞和卫星细胞的三个细胞组成的融合体。在其它实施方式中，多嵌合干细胞是融合体，其包含选自造血干细胞、间充质干细胞、成肌细胞、周细胞和卫星细胞的四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个细胞或由选自造血干细胞、间充质干细胞、成肌细胞、周细胞和卫星细胞的四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个细胞组成。在涉及三个细胞融合的实施方式中，表1中提供了细胞的特定组合。
表1
细胞1 细胞2 细胞3
HSC HSC HSC
HSC HSC MSC
HSC MSC MSC
HSC HSC 周细胞
HSC MSC 周细胞
HSC 周细胞 周细胞
成肌细胞 成肌细胞 成肌细胞
成肌细胞 成肌细胞 MSC
成肌细胞 MSC MSC
成肌细胞 MSC 卫星细胞
成肌细胞 成肌细胞 卫星细胞
成肌细胞 卫星细胞 卫星细胞
在涉及四个细胞融合的实施方式中，表2中提供了四个细胞的组合。
表2
细胞1 细胞2 细胞3 细胞4
HSC HSC HSC HSC
HSC HSC MSC MSC
HSC MSC MSC 周细胞
HSC HSC 周细胞 周细胞
HSC MSC 周细胞 周细胞
HSC 周细胞 周细胞 周细胞
成肌细胞 成肌细胞 成肌细胞 成肌细胞
成肌细胞 成肌细胞 MSC MSC
成肌细胞 MSC MSC MSC
成肌细胞 MSC 卫星细胞 卫星细胞
成肌细胞 成肌细胞 卫星细胞 卫星细胞
成肌细胞 卫星细胞 卫星细胞 卫星细胞
在一些实施方式中，多嵌合干细胞是造血干细胞和独立地选自造血干细胞、间充质干细胞和周细胞的两个细胞的离体融合体。在特定的实施方式中，多嵌合干细胞是造血干细胞和独立地选自造血干细胞和间充质干细胞的两个细胞的离体融合体。在另一个实施方式中，多嵌合干细胞是造血干细胞、间充质干细胞和周细胞的离体融合体。在另一个特定的实施方式中，多嵌合干细胞是三个造血干细胞的离体融合体。
在其它实施方式中，多嵌合干细胞是成肌细胞和独立地选自间充质干细胞、成肌细胞和卫星细胞或其组合的两个细胞的离体融合体。在特定的实施方式中，多嵌合干细胞是成肌细胞、间充质干细胞和卫星细胞的离体融合体。在另一个特定的实施方式中，多嵌合干细胞是三个成肌细胞的离体融合体。
能够分离并任选地纯化用于制备本发明的多嵌合干细胞的细胞。如本文所用，术语“分离”旨在描述处于与天然存在该元素的环境不同的环境中的所关注的细胞。如本文所用，“纯化”是指从产生细胞的环境中移出并至少60％游离，优选75％游离，最优选90％游离于其他组分的细胞，所述其他组分是与细胞天然相关的，或者在产生期间与细胞相关的其他组分。
所关注的细胞的纯化和/或鉴定可以通过本领域已知的任何方式例如免疫学上的方式来实现。可以使用组织化学染色、流式细胞术、荧光激活细胞分选(FACS)、蛋白质印迹分析、酶联免疫吸附测定(ELISA)、密度梯度分离(例如，
Figure BDA0002508590890000081
聚蔗糖400)、免疫磁珠分离及其组合。流式免疫细胞化学法可用于检测细胞表面标志物，免疫组织化学法(例如，固定细胞的免疫组织化学法)可用于检测细胞内或细胞表面标志物。可以对细胞提取物进行蛋白质印迹分析。酶联免疫吸附测定可用于分泌到培养基中的细胞提取物或产物。用于鉴定干细胞标志物的抗体可以从商业来源获得，例如从Chemicon International(特曼库拉，加拿大)获得。
本发明的多嵌合干细胞通过如下制备：使来自三个或更多个不同供体的三个或更多个细胞与外源融合剂离体接触，从而促进了三个或更多个不同供体细胞的离体融合。“离体”是指细胞在体外被操纵。细胞融合是其中三个或更多个细胞通过融合其质膜而融合为一个的过程。可以使用融合剂和本领域已知的方法来制备多嵌合干细胞，包括但不限于将细胞暴露于促进融合的化学物质例如聚乙二醇(PEG)中；使用灭活病毒，例如仙台病毒；以及使用电刺激。参见,例如,Kennett(1979)Methods Enzymol.58：345-359综述了基于仙台病毒诱导的细胞融合或聚乙二醇(PEG)诱导的细胞融合的常用方法。简而言之，将待融合的细胞与融合剂例如仙台病毒或PEG一起温育。离心或搅动可用于促进细胞膜的凝集和紧密并置。诸如时间、温度、细胞浓度和融合剂浓度的变量可针对每个细胞组合进行优化。相对于电融合，短的电脉冲穿过细胞混合物以刺激融合。参见,例如,Neil&Zimmermann(1993)Methods Enzymol.220:174–196。在某些实施方式中，通过聚乙二醇细胞融合制备多嵌合干细胞。
在融合之前，可以培养或可以不培养供体细胞以增加其数量。此外，可以对供体细胞进行标记或可以不对其进行标记(例如，用膜染料)以监测供体细胞的融合。作为说明，将来自第一供体的HSC用PKH26(在567nm发射)标记，将来自第二供体的MSC用eFluor670(在670nm发射)标记，并将来自第三供体的周细胞用PKH67(在502nm发射)标记，使得融合后，融合的细胞在502nm、567nm和670nm发出荧光(图1)。为了鉴定本发明的多嵌合细胞，通过细胞分选例如荧光激活细胞分选(FACS)选择融合细胞。一旦鉴定，就可以将多嵌合细胞冷藏保存、储存和库存为细胞系。或者，可以通过形态表征、表型表征或遗传型表征来评估三个或更多个细胞的成功融合。
本发明的多嵌合干细胞特别用于治疗免疫缺陷和遗传病症。因此，本发明还提供了用于通过将有效用于治疗免疫缺陷或遗传病症的量的本发明的多嵌合干细胞或含有所述多嵌合干细胞的组合物施用于需要治疗的受试者来治疗受试者的免疫缺陷或遗传病症的方法。“治疗”患有疾病或病症的受试者是指实现以下中的一项或多项：(a)减轻疾病的严重性；(b)阻止疾病或病症的发展；(e)抑制疾病或病症的恶化；(d)限制或预防先前患有该疾病或病症的患者的该疾病或病症的复发；(e)使疾病或病症消退；(f)改善或消除疾病或病症的症状；和(g)提高生存率。在一些实施方式中，在本发明的方法中使用的多嵌合干细胞是来自三个或更多个不同供体的三个或更多个造血干细胞、间充质干细胞或成肌细胞的融合体。
可以根据本发明治疗的免疫缺陷和遗传病症包括骨髓衰竭、腺苷脱氨酶(ADA)缺陷、重症联合免疫缺陷(SCID)、迪乔治综合症、共济失调毛细血管扩张症、肌肉萎缩症、I型糖尿病、戈谢病、白血病、再生障碍性贫血、淋巴瘤和多发性骨髓瘤。在某些实施方式中，免疫缺陷和遗传疾病选自骨髓衰竭、肌肉萎缩症、镰状细胞性贫血、白血病和I型糖尿病。在其它实施方式中，遗传疾病是肌肉萎缩症。
肌肉萎缩症是一组遗传疾病，其特征是控制运动的骨骼肌进行性无力和退化。肌肉萎缩症的示例包括杜氏肌肉萎缩症、贝克尔肌肉萎缩症、肢带肌肉萎缩症、肌强直性肌肉萎缩症、面肩胛肱型肌肉萎缩症、眼咽型肌肉萎缩症、Emery-Dreifuss肌肉萎缩症、福山型先天性肌肉萎缩症、三好型远端型肌病、Ullrich先天性肌肉萎缩症、Steinert肌肉萎缩症。在某些实施方式中，所述肌肉萎缩症是杜氏肌肉萎缩症(DMD)。在特定的实施方式中，肌肉萎缩症用多嵌合细胞进行治疗，所述多嵌合细胞是成肌细胞和独立地选自间充质干细胞、成肌细胞和卫星细胞的两个或更多个细胞的融合体。
在另一个实施方式中，免疫缺陷或遗传病症是镰状细胞性贫血。根据该实施方式，所述镰状细胞性贫血用多嵌合细胞进行治疗，所述多嵌合细胞是造血干细胞与独立地选自造血干细胞和间充质干细胞的两个或更多个细胞的融合体。
就本发明的多嵌合细胞在器官和HSC移植的情况下提供致耐受性和免疫调节作用而言，本发明还包括在接受同种异体造血干细胞移植物或器官移植物的受试者中预防GvHD的发展或降低GvHD的严重性的方法。如本领域中已知的，“移植物抗宿主反应”或“GVH”或“GVHD”是指当将不同MHC类别的淋巴细胞引入宿主中而导致淋巴细胞针对宿主的反应时发生细胞反应。按照该方法，向接受同种异体造血干细胞移植物或器官移植物的受试者施用有效量的多嵌合细胞，以防止GvHD的发展或降低其严重性。
多嵌合细胞可以被单独施用于受试者和/或被包括作为造血干细胞移植物或器官移植物的一部分。用本发明的多嵌合细胞进行治疗能够显著降低GvHD的发病率及其严重性，并预防同种异体移植物排斥，减轻免疫反应和/或减少/消除移植患者中终身免疫抑制的需要。在这方面，本发明的多嵌合细胞用于预防各种器官和系统(包括皮肤、指甲、嘴、眼、女性生殖器、胃肠道、肝脏、肺、肌肉、筋膜、关节等)的GvHD相关症状和征兆的发展。在特定的实施方式中，GvHD用多嵌合细胞进行治疗，所述多嵌合细胞是造血干细胞和独立地选自造血干细胞和间充质干细胞的两个或更多个细胞的融合体。
根据本文的治疗方法，将多嵌合细胞或包含其的组合物施用于需要治疗的受试者。在一些实施方式中，可以施用本发明的多嵌合细胞的组合。多嵌合细胞或细胞的组合可通过植入来施用，其中将细胞例如通过静脉内、肌内、动脉内、骨内等注射入受试者。在特定的实施方式中，通过骨内注射、静脉内注射或肌内注射施用多嵌合干细胞。在某些实施方式中，施用涉及植入约102、104、106、107、108、109、1010、1012或更多个细胞。可以基于施用途径和/或植入细胞用来治疗的病况的严重性来选择植入细胞的数量。有利地，本发明的多嵌合干细胞将成功植入并补充遗传/免疫原性缺陷，并在器官和HSC移植的情况下提供致耐受性和免疫调节作用。
包含多嵌合细胞或多嵌合细胞的组合的组合物可以通过将细胞或细胞的组合与药学上可接受的载体或水性介质混合来制备。短语“药学上或药理学上可接受的”是指当施用于动物或人时不会产生不利、过敏或其它不良反应的分子实体和组合物。如本文所用，“药学上可接受的载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂等。此类介质和试剂用于药学活性物质的用途是本领域众所周知的。除非任何常规介质或试剂与本公开的细胞不相容，否则考虑其在治疗组合物中的用途。药物组合物可以由本领域技术人员根据例如预期的施用途径、递送形式和所需剂量来确定。参见，例如，Remington,The Science and Practice of Pharmacy,第22版本,2012。
本发明的组合物可以被掺入可注射制剂中。该制剂还可以包括必需的生理上可接受的载体材料、赋形剂、润滑剂、缓冲剂、表面活性剂、抗菌剂、填充剂(例如甘露醇)、抗氧化剂(抗坏血酸或亚硫酸氢钠)等。
可接受的制剂材料优选在所采用的剂量和浓度下对于受体是无毒的。药物组合物可以包含用于修饰、维持或保持例如组合物的pH、摩尔渗透压浓度、粘度、透明度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释放速率、吸附或渗透的制剂材料。合适的制剂材料可以包括但不限于氨基酸(例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸)；抗菌剂；抗氧化剂(例如抗坏血酸、亚硫酸钠或亚硫酸氢钠)；缓冲液(例如硼酸盐、碳酸氢盐、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐或其它有机酸)；填充剂(例如甘露醇或甘氨酸)；螯合剂(例如乙二胺四乙酸(EDTA)；络合剂(例如咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精或羟丙基-β-环糊精)；填料；单糖、二糖和其它碳水化合物(例如葡萄糖、甘露糖或糊精)；蛋白质(例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)；着色剂、调味剂和稀释剂；乳化剂；亲水性聚合物(例如聚乙烯吡咯烷酮)；低分子量多肽；成盐的抗衡离子(例如钠)；防腐剂(例如苯扎氯铵、苯甲酸、水杨酸、硫汞撒、苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、洗必泰、山梨酸或过氧化氢)；溶剂(例如甘油、丙二醇或聚乙二醇)；糖醇(例如甘露醇或山梨糖醇)；悬浮剂；表面活性剂或润湿剂(例如PEG、脱水山梨糖醇酯、聚山梨醇酯(例如聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80)、TRITON(表面活性剂)、三甲胺、卵磷脂、胆固醇或泰洛沙泊(tyloxapal))；稳定性增强剂(如蔗糖或山梨糖醇)；紧张性增强剂(例如碱金属卤化物，优选氯化钠或氯化钾、甘露醇或山梨糖醇)；递送媒介物；稀释剂；赋形剂和/或药物佐剂。参见，例如，Remington,TheScience and Practice of Pharmacy,Id。
药物组合物中的主要媒介物或载体本质上可以是水性或非水性的。例如，合适的媒介物或载体可以是注射用水、生理盐水溶液或人工脑脊髓液，可能补充有肠胃外施用组合物中常见的其它材料。中性缓冲盐水或与血清白蛋白混合的盐水是其它示例性媒介物。药物组合物可以包含约pH 7.0-8.5的三羟甲基氨基甲烷缓冲液，或约pH 4.0-5.5的乙酸盐缓冲液，其可以还包含山梨糖醇或其合适的替代物。本发明的药物组合物可以通过将具有所需纯度的所选组合物与冻干饼或水溶液形式的任选的制剂试剂(Remington,TheScience and Practice of Pharmacy,Id.)混合来制备以进行储存。
细胞或组合物可以通过缓释体系、通过包封或通过移植装置来提供。所述组合物可以通过弹丸式注射或连续地通过输注或通过移植装置来施用。所述组合物也可以通过移植已吸收或包封有细胞的膜、海绵或另一种合适的材料来局部施用。在使用移植装置的情况下，可以将该装置移植入任何合适的组织或器官中。可以作为一次性治疗，重复(每天、每周、每月、每年等)进行注射，以达到所需的治疗效果。
先前已经描述了允许将包封的细胞移植用于帕金森氏病(Tresco,等人(1992)ASAIO J.38:17-23)或肌萎缩性侧索硬化(Aebischer,等人(1996)Hum.Gene Ther.7:851-860)的治疗中的细胞包封方法。根据该实施方式，通过形成微孔膜的化合物包封细胞。可以使用由聚醚砜(PES)制成的中空微孔膜制备包含所关注细胞的例如长度为约1cm的胶囊(阿克苏诺贝尔法瑟公司(Akzo Nobel Faser AG)，伍珀塔尔，德国；Déglon,等人(1996)Hum.Gene Ther.7:2135-2146)。
这些组合物还可包含佐剂，例如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。可以通过包含各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚山梨酸等来确保防止微生物的作用。还可能需要包括等渗剂，例如糖、氯化钠等。
也可以将补充活性成分掺入组合物中。本公开的活性组合物可以包含经典药物制备物。根据本公开的这些组合物的施用将通过任何常用途径进行，只要靶组织可通过该途径可获得即可。
如本文所用，术语“有效用于…的量”、“有效量”或“治疗有效量”是指足以实现所需结果的本发明的细胞或组合物的量。构成“有效量”或“治疗有效量”的细胞或组合物的量可以根据疾病的严重性；待治疗患者的病况、体重或年龄；定量给药频率或施用途径而变化，但是可以由本领域普通技术人员常规确定。临床医生可以设定施用剂量或途径以获得最佳治疗效果。
本发明还涉及用于治疗免疫缺陷或遗传病症和/或预防或减轻GvHD的试剂盒。所述试剂盒可用于实践本文所述的本发明方法。所述试剂盒是包括至少一种本发明组合物的材料或组分的组件。因此，在一些实施方式中，所述试剂盒包含用于进行离体细胞融合的融合剂，以及选自来自不同供体的造血干细胞、间充质干细胞、成肌细胞、周细胞、卫星细胞的三个或更多个供体细胞(例如，来自细胞库的供体细胞)，以及任选的用于获得供体细胞的材料，如上所述。
本发明试剂盒中配置的组分的确切性质取决于其预期目的。例如，一些实施方式被配置用于治疗肌肉萎缩症的目的。在一个实施方式中，所述试剂盒被特别配置用于治疗人受试者的目的。在另一个实施方式中，所述试剂盒被特别配置用于治疗成人、人受试者的目的。在另一个实施方式中，所述试剂盒被特别配置用于治疗儿童的目的。在另一个实施方式中，所述试剂盒被特别配置用于治疗DMD的目的，并且可以包含成肌细胞和独立地选自间充质干细胞、成肌细胞和卫星细胞的两个或更多个细胞。在另一个实施方式中，所述试剂盒被特别配置用于治疗GvHD的目的，并且可以包含造血干细胞和独立地选自造血干细胞和间充质干细胞的两个或更多个细胞。在另一个实施方式中，所述试剂盒被特别配置用于治疗镰状细胞性贫血，并且可以包含造血干细胞和独立地选自造血干细胞和间充质干细胞的两个或更多个细胞。在另一个实施方式中，所述试剂盒被特别配置用于提供连续的每日使用剂量的目的。在另一个实施方式中，所述试剂盒被特别配置用于提供所需使用剂量的目的。在另外的实施方式中，所述试剂盒被配置用于兽医应用，以治疗例如但不限于农场动物、家畜和实验动物的受试者。
试剂盒中可以包含使用说明。“使用说明”通常包括描述要在使用试剂盒的组件以实现所需结果(例如用于治疗肌肉萎缩症、用于治疗镰状细胞性贫血或用于治疗GvHD)中使用的技术的有形的表达。任选地，试剂盒还包含其它有用的组分，例如稀释剂、缓冲剂、药学上可接受的载体、注射器、导管、涂药器、移液或测量工具、包扎材料或其它有用的用具，如将被本领域技术人员容易地认识到的。
试剂盒中组装的材料或组分能够以保持其可操作性和实用性的任何方便且合适的方式提供给从业人员。例如，组分可以是以溶解的、脱水的或冻干的形式；它们可以在室温、冷藏或冷冻温度被提供。组分通常被包含在合适的包装材料中。如本文所用，短语“包装材料”是指用于容纳试剂盒内容物的一种或多种物理结构。包装材料通过众所周知的方法构造，优选地用于提供无菌、无污染物的环境。试剂盒中使用的包装材料是通常用于治疗的包装材料。如本文所用，术语“包装”是指能够容纳各个试剂盒组分的合适的固体基质或材料，例如玻璃、塑料、纸、箔等。包装材料通常具有外部标签，该外部标签指示试剂盒和/或其组分的内容物和/或目的。
提供以下非限制性实施例以进一步说明本发明。
实施例1：人多嵌合细胞的离体生成
多嵌合细胞(MCC)通过人造血细胞的离体细胞融合而产生，人造血细胞来自三个或更多个相关和/或不相关的供体，以及来自一个或多个造血干细胞来源(即骨髓(“BM”)、外周血(“PB”)和/或脐带血(“UCB”))，例如，来自市售来源。
从三个无关的供体中分离并纯化单核细胞。随后，将来自三个供体的单核细胞各自用不同的荧光细胞膜染料(即PKH 26和PKH 67和
Figure BDA0002508590890000162
Claret(深红色荧光染料)；西格玛奥德里奇公司)进行预染色。将荧光标记的细胞以1:1:1的比例混合，并使用聚乙二醇进行融合。基于三重染色，对MCC进行分选(纯度80-90％)。
为了确认融合，使用共聚焦显微镜和流式细胞仪评价了三重标记的(PKH26、PKH67和
Figure BDA0002508590890000163
Claret)嵌合细胞。使用标准测定法评价多嵌合细胞的存活力、基因型稳定性和表型稳定性。特别地，将短串联重复PCR用于基因型表征。这些分析的结果呈现于表3。
表3
Figure BDA0002508590890000161
当前不存在没有免疫抑制和GvHD发展的副作用的用于支持器官和HSC移植物的可用疗法。多嵌合细胞疗法将对消除防止器官和HSC移植物排斥所需的免疫调节方案的副作用产生巨大影响。这种疗法将显著增加移植患者的寿命和生活质量。在用多嵌合细胞治疗的患者中，将大大降低作为HSC移植的最限制性且最危险的并发症的GvHD的风险。用免疫特权性嵌合细胞的疗法将提供更有效的HSC植入和骨髓(BM)隔室重构，从而导致移植物受体和免疫缺陷患者的耐受性诱导和更好结果。
MCC的独特特征包括它们表达亲本细胞的造血标志物和/或其它标志物(例如成肌细胞)的能力以及致耐受性细胞因子的能力。此外，可以对嵌合细胞进行冷冻保存、储存和库存，使其可立即用于急性以及加强和长期治疗。由于这些独特的性质，与其它基于干细胞的策略相比，MCC疗法具有重要的优势。
实施例2：人脐带血细胞的融合和表型表征
如图1所示，进行了来自三个不相关供体的人UCB细胞的三十次个体融合。共聚焦显微镜和流式细胞仪通过存在三重(PKH26/PKH67/eFluor 670)荧光标记的MCC证实发生了离体融合。还评价了MCC的另外的表型表征。特别地，发现当与对照(即eFluor670增殖染料标记的UCB细胞)相比时，离体融合过程不改变MCC的CD4、CD90、CD45和CD19表达。此外，如通过台盼蓝染色确定的，90-95％的MCC是存活的，并且通过体内菌落形成单位测定(包括多中心集落形成单位、多能粒细胞集落形成单位、红系细胞集落形成单位、巨噬细胞集落形成单位、巨核细胞集落形成单位(CFU-GEMM)、粒细胞集落形成单位(CFU-G)、粒细胞-巨噬细胞集落形成单位(CFU-GM)、巨噬细胞集落形成单位(CFU-M)和红系细胞爆发形成单位(BFU-E)的测定)，证明了增殖特性。使用血清学HLA分型对MCC进行的基因型分析，证实了在MCC遗传物质中存在对3个不相关供体中每一个具有特异性的等位基因(表4)。
表4
Figure BDA0002508590890000181
使用STR PCR对MCC进行基因型分析，进一步证实了在MCC遗传物质中存在对三个不相关供体中每一个具有特异性的标志物(表5)。
表5
Figure BDA0002508590890000182
还评价了NSG小鼠模型中MCC的致瘤性。通过骨内(IO)或静脉内(IV)途径向小鼠施用MCC，如表6所概括。
表6
Figure BDA0002508590890000183
注射后第90天对NSG小鼠的临床观察表明，包括在通过触诊确认的注射部位处，这些动物活跃，体重增加正常，毛发正常，并且没有肿瘤样生长。此外，细胞递送后90天，NSG小鼠的磁共振成像(MRI)表明，在接受源自3个不相关供体的未融合人脐带血细胞混合物的小鼠或接受融合MCC的小鼠中，没有肿瘤样结构。

Claims (20)

1.一种多嵌合细胞，所述多嵌合细胞包含来自三个或更多个不同供体的三个或更多个造血干细胞、间充质干细胞、成肌细胞、周细胞、卫星细胞或其组合的离体融合体。
2.根据权利要求1所述的多嵌合细胞，所述多嵌合细胞由造血干细胞与独立地选自造血干细胞和间充质干细胞的两个或更多个细胞的离体融合体组成。
3.根据权利要求1所述的多嵌合细胞，其中所述造血干细胞分离自骨髓、脐带血、外周血或其组合。
4.根据权利要求1所述的多嵌合细胞，其中所述供体是相关的供体、不相关的供体或其组合。
5.根据权利要求1所述的多嵌合细胞，所述多嵌合细胞由造血干细胞与独立地选自造血干细胞、间充质干细胞和周细胞的两个或更多个细胞的离体融合体组成。
6.根据权利要求5所述的多嵌合细胞，所述多嵌合细胞由造血干细胞、间充质干细胞和周细胞的离体融合体组成。
7.根据权利要求5所述的多嵌合细胞，所述多嵌合细胞由三个造血干细胞的离体融合体组成。
8.根据权利要求1所述的多嵌合细胞，所述多嵌合细胞由成肌细胞与独立地选自间充质干细胞、成肌细胞和卫星细胞的两个细胞的离体融合体组成。
9.根据权利要求8所述的多嵌合细胞，所述多嵌合细胞由成肌细胞、间充质干细胞和卫星细胞的离体融合体组成。
10.根据权利要求8所述的多嵌合细胞，所述多嵌合细胞由三个成肌细胞的离体融合体组成。
11.一种治疗免疫缺陷或遗传病症的方法，所述方法包括向需要治疗的受试者施用有效量的根据权利要求1所述的多嵌合细胞，从而治疗所述受试者的免疫缺陷或遗传病症。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述多嵌合细胞通过骨内注射、静脉内注射或肌内注射施用。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述免疫缺陷或遗传病症选自骨髓衰竭、腺苷脱氨酶(ADA)缺陷、重症联合免疫缺陷(SCID)、迪乔治综合症、共济失调毛细血管扩张症、肌肉萎缩症、I型糖尿病、戈谢病、白血病、再生障碍性贫血、镰状细胞性贫血、淋巴瘤和多发性骨髓瘤。
14.根据权利要求11所述的方法，其中所述遗传病症是肌肉萎缩症。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述多嵌合细胞包含成肌细胞与独立地选自间充质干细胞、成肌细胞和卫星细胞的两个或更多个细胞的离体融合体。
16.根据权利要求11所述的方法，其中所述免疫缺陷或遗传病症是镰状细胞性贫血。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述多嵌合细胞包含造血干细胞与独立地选自造血干细胞和间充质干细胞的两个或更多个细胞的离体融合体。
18.一种在接受同种异体造血干细胞移植物或器官移植物的受试者中预防GvHD的发展或降低GvHD的严重性的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求1所述的多嵌合细胞，从而在受试者中预防GvHD的发展或降低GvHD的严重性。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述多嵌合细胞包含造血干细胞与独立地选自造血干细胞和间充质干细胞的两个或更多个细胞的离体融合体。
20.一种试剂盒，所述试剂盒包含：
(a)融合剂，和
(b)选自来自三个或更多个不同供体的造血干细胞、间充质干细胞、成肌细胞、周细胞、卫星细胞的三个或更多个供体细胞。
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