CN103550784A - 通过人成肌细胞移植的疾病预防和缓解 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了使用成肌细胞转移用于疾病的人基因组预防和治疗的方法和材料。这些方法导致多条途径中基因转录物的改变。结合从DMD、心肌病和II型糖尿病的成肌细胞转移技术的发展，成肌细胞转移通过正常的成肌细胞细胞核的转移明确地介导其作用，所述正常的成肌细胞细胞核的转移除了只是补充缺失的一个或多个基因或异常的一个或多个基因之外，还提供完整的人基因组。替换基因随后转录来产生对于基因修复必要的蛋白或因子。描述了此技术的多种用途，包括用于疾病治疗、疾病预防、药物发现和选择用于治疗的优秀细胞和克隆的用途。

Description

通过人成肌细胞移植的疾病预防和缓解
发明领域
实施方案涉及使用成肌细胞转移治疗的疾病的人基因组治疗。
发明背景
Peter K. Law先前证明在Duchenne型肌肉营养不良(DMD)肌肉中的成肌细胞转移产生肌养蛋白(一种蛋白)，并且心肌中的成肌细胞转移产生重肌球蛋白(另一种蛋白)。相关专利和出版物包括Ye等2009 (Diabetologia 52:1925-1934 “Skeletal myoblast transplantation …”)关注确定治疗肌肉营养不良、心肌退化和糖尿病的安全性和有效性。
这些工作依赖于增加的肌肉强度、更多肌纤维、更好的细胞结构和蛋白补充作为监测终点。然而，他们没有鉴定任何潜在的遗传/生化机制，所述遗传/生化机制可以用来改善治疗或用作工具用于预防性或治疗性试剂诸如细胞移植剂或先导药物化合物的鉴定和选择。相反，这些研究指示它们的作用经由供体细胞存活、发育和行使功能本身起作用。在疾病的临床预防和治疗中尚未认真地解决导向基因修复的基因转录和翻译。
一种重要的疾病是糖尿病。糖尿病是在世界上成人中肾衰竭和非创伤性下肢截肢的主要原因。在2010年，估计美国已经在糖尿病治疗上花费了1980亿美元1。估计2.85亿成人患有II型糖尿病，占2010年中糖尿病病例的约90%2。糖尿病影响~25%的西方人群，稳定增加3，并且是重要的心血管疾病风险因素4。流行病学和双生子研究已经清楚地指示在胰岛素抵抗的发展中主要的多源发生因素，II型糖尿病的关键特征，其也受环境因素影响5,6。
先前的研究证明了胰岛素抵抗的发展中骨骼肌的重要性。肌肉特异性Glut-4敲除的小鼠从幼年起即为胰岛素抵抗和葡萄糖不耐受的7。肌肉中蛋白激酶C-λ单独的缺陷将诱发腹部肥胖和其它代谢异常8。相反，肌肉特异性的LKB1(一种丝氨酸/苏氨酸激酶，其是胰岛素敏感性的负调节蛋白)敲除增加胰岛素敏感性并改善葡萄糖稳态9。这些研究暗示骨骼肌葡萄糖转运中的缺陷可以是胰岛素抵抗的发展中的关键因素。
KK小鼠的减弱的高血糖和高胰岛素血症以及改善的葡萄糖耐受随人骨骼肌成肌细胞(hSkMs)的异种移植而发生10。骨骼肌成肌细胞是单核的肌肉前体细胞，其能够与不同类型的肌纤维融合并发育成宿主表型11。通过与KK小鼠骨骼肌纤维的自然融合，植入的人成肌细胞在KK小鼠中形成杂交肌纤维。
虽然对糖尿病已完成此工作，但尚无人鉴定出多基因或基因组任何潜在的基因转录物的改变。事实上，那些工作的教导和结论表明，所发现的任何改善都可以是无基因修复的情况下供体细胞存活、发育和行使功能的结果。因此，此领域内超出此基本知识的任何新的信息和治疗形式可以为疾病的临床预防和治疗提供不可估量的益处。
发明概述
开始于Peter K. Law的起始性工作，多年来，在肌肉移植治疗中已经有一些进展。然而，一直没有具体认识或理解各种疾病的疾病症状可以通过在多个基因的直接转录物的质量和数量中的变化来缓解。在本文所述的实施方案中，第一次惊人地显示使用II型糖尿病遗传异常的动物模型在多个基因的直接转录物的数量和质量中的变化可以导致疾病减轻。
令人惊讶地发现，在II型糖尿病肌肉中的成肌细胞的转移在胰岛素抵抗相关的多种途径中产生基因转录物(而不是蛋白质)的变化。结合从DMD、心肌病和II型糖尿病的成肌细胞转移技术的发展，该发现无法预料地证明，成肌细胞转移通过正常的成肌细胞细胞核的转移介导其作用，所述正常的成肌细胞细胞核的转移除了只是补充缺少的一个或多个基因或异常的一个或多个基因之外，还供应完整的人基因组。替换的基因然后转录来产生对于基因修复必要的蛋白或因子。发现了此发现的多种用途，包括用于疾病治疗、疾病预防、药物发现和选择用于治疗的优秀细胞和克隆。
附图简述
图1. 空腹状态下在KK hSkM、KK对照和KK成纤维细胞组中胰岛素信号传递途径基因转录物水平的比较。
图2.空腹状态下在KK hSkM、KK对照和KK成纤维细胞组中线粒体基因转录物水平的比较。
疾病治疗和预防
一个实施方案预防或缓解DMD症状。另一个实施方案预防或缓解心肌病症状。仍另一个实施方案预防或缓解II型糖尿病症状。
根据一个优选的实施方案，提供治疗需要其的患者中II型糖尿病的方法，包括：确定或验证患者的II型糖尿病状态；通过成肌细胞细胞核的转移为患者供应完整的人基因组，包括步骤：a. 培养来自关于胰岛素敏感性遗传正常的供体的肌肉活组织检查样品的成肌细胞的供应物；b. 向患者施用治疗有效剂量的免疫抑制剂；c. 之后对患者的至少一种肌肉从供应物选择并施用治疗有效剂量的成肌细胞；d. 允许供体成肌细胞将其细胞核(其每一个都包含正常基因的完整互补物)插入患者的遗传异常的肌细胞以进行基因互补修复；和e. 允许供体成肌细胞彼此融合以形成遗传正常的肌纤维；由此肌肉介导的葡萄糖稳态得到改善，并通过测定患者的II型糖尿病状态的改善而得到检测。
在一个实施方案中，培养的成肌细胞是与患者组织不相容的，并且来源于遗传正常的供体。在另一个实施方案中，供体选自遗传正常的组，包括但不限于宿主的父亲或男性同胞。
在仍另一实施方案中，在患者已经发展II型糖尿病之前，从患者肌肉活组织检查样品中获得培养的成肌细胞。在仍另一实施方案中，通过检测提供疾病症状减轻的多个基因的直接转录物的数量或质量的变化进行患者的II型糖尿病状态的改善的测定。
在仍另一实施方案中，培养的成肌细胞的治疗有效剂量对于II型糖尿病是约500亿个细胞，并且此剂量以每毫升约1亿个细胞施用。在另一个实施方案中，免疫抑制剂包括以每天5至7mg/Kg体重口服施用的环孢菌素，其在成肌细胞植入前五天开始，并且在手术后三周完全断药。可以每周监测环孢菌素全血谷的水平，并且环孢菌素剂量根据需要重新调整以保持约250ng/mL的血液水平直至断药开始时前一周。
一个实施方案提供预防患者中II型糖尿病的方法，包括：检查患者的II型糖尿病潜在状态；通过成肌细胞细胞核的转移为患者供应完整的人基因组，包括步骤：a. 培养来自关于胰岛素敏感性遗传正常的供体的肌肉活组织检查样品的成肌细胞的供应物；b. 向患者施用治疗有效剂量的免疫抑制剂；和c. 之后对患者的至少一种肌肉从供应物选择并施用治疗有效剂量的成肌细胞；d. 允许供体成肌细胞将其细胞核(其每一个都包含正常基因的完整互补物)插入患者的异常肌细胞以进行遗传互补预防；和e. 允许供体成肌细胞彼此融合以形成遗传正常的肌纤维；由此肌肉介导的葡萄糖稳态得到改善，并通过测定患者的II型糖尿病状态的改善而得到检测。仍另一个实施方案提供测定在患者的II型糖尿病状态中的改善。
仍另一个实施方案提供治疗宿主中遗传疾病的方法，其通过经由成肌细胞细胞核的转移供应宿主物种的完整的基因组而实现，包括步骤：a. 培养来自遗传正常的供体的肌肉活组织检查样品的遗传正常的成肌细胞的供应物；b. 向宿主施用治疗有效剂量的免疫抑制剂；和c. 之后对宿主的至少一种肌肉从所述供应物选择并施用治疗有效剂量的成肌细胞；d. 允许供体成肌细胞将其细胞核(其每一个都包含正常基因的完整互补物)插入患者的异常肌细胞以进行基因互补修复；和e. 允许供体成肌细胞彼此融合以形成遗传正常的肌纤维；由此进行宿主中改善的检测，包括肌肉功能改善、运动能力增加、血液喷射/血管化、和生化物质或离子跨肌细胞膜的转移的测定的至少一种。
药物发现中的用途
仍另一实施方案提供了药物发现测定，其包括检测参与胰岛素信号传递途径的22个基因的组中的一个或多个的增加的基因转录。在一个实施方案中，测定RNA转录物并且使用RNA转录的存在或数量以选择用于临床前景或在疾病(诸如糖尿病)预防或症状缓解中使用的先导药物化合物。在另一个实施方案中，使用基因转录产物活性的生物测定来选择先导药物化合物。在一个优选的实施方案中，基因是选自Acaca、Aebp1、Cfd、Gpd-1、Jun、PPARgamma、Ptpn1和UCP1的一个或多个基因。
这些基因、基因转录物和由它们产生的蛋白可以通过如技术人员将容易地理解的很多种方法检测。药物发现和开发涉及鉴定和选择关键标志物。虽然多种基因已知参与胰岛素信号传递途径，但实施方案提供了一组更有价值的基因，令人惊讶地发现其在成肌细胞治疗的背景下更有价值并且是优选的。上面所列基因的优先表达对选择在预防或治疗II型糖尿病和其它遗传疾病诸如粘多糖贮积症的药物发现中的先导化合物是尤其优选的。
仍另一实施方案提供了药物发现测定，其包括检测参与线粒体生物合成和功能的27个基因的组中的一个或多个的增加的基因转录。在一个实施方案中，测定RNA转录物并且使用RNA转录的存在或数量以选择用于临床前景或在疾病(诸如糖尿病)预防或症状缓解中使用的先导药物化合物。在另一个实施方案中，使用基因转录产物活性的生物测定来选择先导药物化合物。在一个优选的实施方案中，基因是选自Bcl211、Cox10、Cpt1b、Slc25a22、Slc25a25、Stard3、Timm17b和Tomm40的一个或多个基因。
这些基因、基因转录物和由它们产生的蛋白可以通过如技术人员将容易地理解的很多种方法检测。药物发现和开发涉及鉴定和选择关键标志物。虽然多种基因已知参与线粒体生物合成和功能，但实施方案提供了一组更有价值的基因，令人惊讶地发现其在成肌细胞治疗的背景下更有价值并且是优选的。上面所列基因的优先表达对选择在预防或治疗II型糖尿病、肥胖和其它由于异常线粒体生物合成和功能导致的遗传疾病的药物发现中的先导化合物是尤其优选的。
另一个实施方案提供发现用于糖尿病治疗的药物化合物或细胞治疗候选物的方法，包括将试验化合物暴露于细胞的体外、先体外后体内(ex vitro)或体内的组，测定选自Bcl211、Cox10、Cptlb、Slc25a22、Slc25a25、Stard3、Timm17b和Tomm40的基因的一个或多个的基因活性，并使用阳性基因活性结果以确定用于糖尿病治疗的试验化合物的值。在一个实施方案中，所述方法包括检测基因转录物。在一个实施方案中，所述方法包括检测从转录的基因翻译的蛋白的活性。在一个实施方案中，所述方法包括免疫检测从转录的基因翻译的蛋白。在一个实施方案中，所述方法包括将试验化合物暴露于细胞的体外、先体外后体内或体内的组，测定选自Acaca、Aebp1、Cfd、Gpd-1、Jun、PPARγ、Ptpn1和UCP1的基因的一个或多个的基因活性，并使用阳性基因活性结果以确定用于糖尿病治疗的试验化合物的值。
经由细胞注射供应基因组
此前，本领域技术人员总是使用盐溶液和其它确定的或部分确定的介质作为载体溶液在患者中注射细胞。本发明人令人惊讶地发现使用宿主的血清注射成肌细胞促进细胞存活和发育。虽然也考虑添加血管生成因子的血清和使用患者血浆作为介质用于注射的细胞，但由于易于制备，因此优选凝结的血清。
发现注射液的高细胞浓度(每毫升1亿个细胞)在注射后增强了细胞融合和发育。优选的技术是对年幼患者诸如年龄在5至12岁之间的DMD男孩的下身治疗，和对于年长患者诸如年龄在12至18岁之间的DMD男孩的上身治疗。最优选的是对于年龄在5至18岁之间的患者的全身治疗(“WBT”)。对于所有年龄的II型糖尿病患者而言，WBT均是最优选的。WBT涉及将500亿个成肌细胞注射入患者的80个大肌肉群中。
在一个实施方案中，使用更小体积大小的细胞注射，以提供更大的DNA对细胞质量比。在一个实施方案中，优选的平均直径细胞大小是7到10μm。在一个实施方案中，平均细胞大小是12μm或更小并且可以小至7μm。在一个实施方案中，提供在患者血液蛋白介质诸如血清或血浆中的细胞悬液，用于治疗需要其的患者中的II型糖尿病的方法，所述方法包括：确定或验证患者的II型糖尿病状态；通过成肌细胞细胞核的转移为患者供应完整的人基因组，包括步骤：a. 培养来自关于胰岛素敏感性遗传正常的供体的肌肉活组织检查样品的成肌细胞的供应物；b. 向患者施用治疗有效剂量的免疫抑制剂；和c. 之后对患者的至少一种肌肉从供应物选择并施用治疗有效剂量的成肌细胞；d. 允许供体成肌细胞将其细胞核(其每一个都包含正常基因的完整互补物)插入患者的遗传异常的肌细胞以进行基因互补修复；和
e. 允许供体成肌细胞彼此融合以形成遗传正常的肌纤维；由此肌肉介导的葡萄糖稳态得到改善，并通过测定患者的II型糖尿病状态的改善而得到检测。在其它实施方案中，供应该细胞悬液用于如本文详述的其它方法。
用于选择在移植治疗中使用的细胞的标志物
在另一个实施方案中，令人惊讶地发现，对某些基因表现出异常高的转录活性的细胞为疾病诸如糖尿病的细胞治疗提供优越的益处。具体而言，该基因表达可以用于细胞选择，其用于克隆和用于培养以提供用于治疗的增强的细胞制剂。在一个实施方案中，使用基因转录产物活性的检测以选择更好的细胞或细胞培养物。在一个优选的实施方案中，基因是选自Bcl211、Cox10、Cpt1b、Slc25a22、Slc25a25、Stard3、Timm17b和Tomm40的一个或多个基因。在另一个优选的实施方案中，基因是选自Acaca、Aebp1、Cfd、Gpd-1、Jun、PPARgamma、Ptpn1和UCP1的一个或多个基因。这些基因、基因转录物和由它们产生的蛋白可以通过如技术人员将容易地理解的很多种方法检测。
进一步地，本发明还提供下列方面：
1. 组合物，其用于治疗宿主中的II型糖尿病，包含：
供应量的培养的来自供体的遗传正常的成肌细胞，其以治疗有效剂量向宿主的至少一种肌肉施用；和
治疗有效剂量的向所述宿主施用的免疫抑制剂，
由此通过成肌细胞细胞核转移向患者供应完整的人基因组，导致所述患者的基因转录物改变、肌肉介导的葡萄糖稳态改善和症状减轻。
2. 方面1的组合物，其中所述培养的成肌细胞获自选自遗传正常组的供体，包括但不限于所述宿主的父亲或男性同胞。
3. 方面1的组合物，其中对于II型糖尿病，所述培养的成肌细胞的所述选择的治疗有效剂量是约500亿个细胞，并且其中所述剂量以每毫升患者血清约1亿个细胞施用。
4. 方面1的组合物，其中所述免疫抑制剂包含环孢菌素，所述环孢菌素在成肌细胞植入前5天开始以每天5到7mg/Kg体重口服施用，并且其中每周监测环孢菌素全血谷水平，并且所述环孢菌素剂量根据需要重新调整以保持约250 ng/mL的血液水平，直至断药开始时第三周的开始，在操作后第三周的结束时完全断药。
5. 方面1的组合物，其中通过检测提供疾病症状减轻的多个基因的直接转录物的数量或质量的变化进行所述患者的II型糖尿病状态的改善的测定。
6. 方面1的组合物，用于预防宿主中II型糖尿病症状的发生，由此通过成肌细胞细胞核的转移向所述患者供应完整的人基因组，导致基因转录物改变、正常葡萄糖稳态的保持和糖尿病症状的缺失。
7. 供应量的培养的来自供体的遗传正常的成肌细胞和治疗有效剂量的向宿主施用的免疫抑制剂在制备用于治疗所述宿主中II型糖尿病的药剂中的用途，所述遗传正常的成肌细胞以治疗有效剂量向所述宿主的至少一种肌肉施用，由此通过成肌细胞细胞核转移向所述患者供应完整的人基因组，导致所述患者的基因转录物改变、肌肉介导的葡萄糖稳态改善和症状减轻。
8. 方面7的用途，其中所述培养的成肌细胞获自选自遗传正常组的供体，包括但不限于所述宿主的父亲或男性同胞。
9. 方面7的用途，其中对于II型糖尿病，所述培养的成肌细胞的所述治疗有效剂量是约500亿个细胞，并且其中所述剂量以每毫升患者血清约1亿个细胞施用。
10. 方面7的用途，其中所述免疫抑制剂包含环孢菌素，所述环孢菌素在成肌细胞植入前5天开始以每天5到7mg/Kg体重口服施用，并且其中每周监测环孢菌素全血谷水平，并且所述环孢菌素剂量根据需要重新调整以保持约250 ng/mL的血液水平，直至断药开始时第三周的开始，在操作后第三周的结束时完全断药。
11. 方面7的用途，其中通过检测提供疾病症状减轻的多个基因的直接转录物的数量或质量的变化进行所述患者的II型糖尿病状态的改善的测定。
12. 方面7的用途，用于预防宿主中II型糖尿病症状的发生，由此通过成肌细胞细胞核的转移向所述患者供应完整的人基因组，导致基因转录物改变、正常葡萄糖稳态的保持和糖尿病症状的缺失。
13. 组合物，其用于治疗宿主中的遗传疾病，包含：
供应量的培养的来自供体的遗传正常的成肌细胞，其以治疗有效剂量向宿主的至少一种肌肉施用；和
治疗有效剂量的向所述宿主施用的免疫抑制剂，
由此通过成肌细胞细胞核的转移向所述宿主供应完整的人基因组，导致下列至少一种：基因转录物改变、肌肉生化改善、肌肉功能改善、肌肉结构改善、运动能力增加、血液喷射/血管化增加、和生化物质或离子跨肌细胞膜的转移增加。
14. 方面13的组合物，其中所述培养的成肌细胞与所述宿主是组织不相容的，其来源于选自遗传正常组的供体，包括但不限于所述宿主的父亲或男性同胞。
15. 方面13的组合物，其中通过检测提供疾病症状减轻的多个基因的直接转录物的数量或质量的变化进行所述宿主中改善的检测。
16. 方面13的组合物，其中对于肌肉营养不良，所述培养的成肌细胞的所述治疗有效剂量是约500亿个细胞，对于心肌病约10亿个细胞，和对于II型糖尿病约500亿个细胞，所述剂量以每毫升宿主血清约1亿个细胞的剂量施用。
17. 方面13的组合物，其中所述免疫抑制剂包含环孢菌素，所述环孢菌素在成肌细胞植入前五天开始以每天5至7mg/Kg体重口服施用，并且在操作后三周完全断药。
18. 方面13的组合物，其中每周监测环孢菌素全血谷水平，并且如果需要重新调整环孢菌素剂量以保持约250ng/mL直至断药开始时前一周。
19. 供应量的培养的来自供体的遗传正常的成肌细胞和治疗有效剂量的向宿主施用的免疫抑制剂在制备用于治疗所述宿主中遗传疾病的药剂中的用途，所述遗传正常的成肌细胞以治疗有效剂量向宿主的至少一种肌肉施用，由此通过成肌细胞细胞核的转移向所述患者供应完整的正常基因组，导致下列至少一种：基因转录物改变、肌肉生化改善、肌肉功能改善、肌肉结构改善、运动能力增加、血液喷射/血管化增加、和生化物质或离子跨肌细胞膜的转移增加。
20. 方面19的用途，其中所述培养的成肌细胞与所述宿主是组织不相容的，其来源于选自遗传正常组的供体，包括但不限于所述宿主的父亲或男性同胞。
21. 方面19的用途，其中通过检测提供疾病症状减轻的多个基因的直接转录物的数量或质量的变化进行所述宿主中改善的检测。
22. 方面19的用途，其中对于肌肉营养不良，所述培养的成肌细胞的所述治疗有效剂量是约500亿个细胞，对于心肌病约10亿个细胞，和对于II型糖尿病约500亿个细胞，所述剂量以每毫升宿主血清约1亿个细胞的剂量施用。
23. 方面19的用途，其中所述免疫抑制剂包含环孢菌素，所述环孢菌素在成肌细胞植入前五天开始以每天5至7mg/Kg体重口服施用，并且在操作后三周完全断药。
24. 方面19的用途，其中每周监测环孢菌素全血谷水平，并且如果需要重新调整环孢菌素剂量以保持约250ng/mL直至断药开始时前一周。
25. 组合物，其用于通过成肌细胞细胞核的转移供应宿主物种的全基因组而治疗或预防宿主中遗传疾病的症状的发生，包含：供应量的培养的遗传正常的成肌细胞，其以治疗有效剂量向所述宿主的至少一种肌肉施用。
26. 方面25的组合物，其中对于肌肉营养不良，所述培养的成肌细胞的所述选择的治疗有效剂量是约500亿个细胞，对于心肌病约10亿个细胞，和对于II型糖尿病约500亿个细胞，所述剂量以每毫升宿主血清约1亿个细胞的剂量施用。
27. 方面25的组合物，其中所述培养的成肌细胞与所述宿主是组织不相容的，其来源于选自遗传正常组的供体，包括但不限于所述宿主的父亲或男性同胞。
28. 方面25的组合物，其中所述培养的成肌细胞与所述宿主是组织相容的，供体肌肉活组织检查样品在成为肌病之前已从所述宿主中获得。
29. 供应量的培养的遗传正常的成肌细胞在制备药剂中的用途，所述遗传正常的成肌细胞以治疗有效剂量向所述宿主的至少一种肌肉施用，所述药剂用于通过经成肌细胞细胞核转移供应宿主物种的完整基因组而治疗或预防所述宿主中遗传疾病的症状发生。
30. 方面29的用途，其中对于肌肉营养不良，所述培养的成肌细胞的所述选择的治疗有效剂量是约500亿个细胞，对于心肌病约10亿个细胞，和对于II型糖尿病约500亿个细胞，所述剂量以每毫升宿主血清约1亿个细胞的剂量施用。
31. 方面29的用途，其中所述培养的成肌细胞与所述宿主是组织不相容的，其来源于选自遗传正常组的供体，包括但不限于所述宿主的父亲或男性同胞。
32. 方面29的用途，其中所述培养的成肌细胞与所述宿主是组织相容的，供体肌肉活组织检查样品在成为肌病之前已从所述宿主中获得。
33. 发现用于糖尿病治疗的药物化合物或细胞治疗候选物的方法，包括将试验化合物暴露于细胞的体外、先体外后体内或体内的组，测定选自Bcl211、Cox10、Cptlb、Slc25a22、Slc25a25、Stard3、Timm17b和Tomm40的基因的一个或多个的基因活性，并使用阳性基因活性结果以确定用于糖尿病治疗的试验化合物的值。
34. 方面33的方法，其中所述方法包括检测基因转录物。
35. 方面33的方法，其中所述方法包括检测从转录的基因翻译的蛋白的活性。
36. 方面33的方法，其中所述方法包括免疫检测从转录的基因翻译的蛋白。
37. 发现用于糖尿病治疗的药物化合物或细胞治疗候选物的方法，包括将试验化合物暴露于细胞的体外、先体外后体内或体内的组，测定选自Acaca、Aebp1、Cfd、Gpd-1、Jun、PPARγ、Ptpn1和UCP1的基因的一个或多个的基因活性，并使用阳性基因活性结果以确定用于糖尿病治疗的试验化合物的值。
38. 方面37的方法，其中所述方法包括检测基因转录物。
39. 方面37的方法，其中所述方法包括检测从转录的基因翻译的蛋白的活性。
40. 方面37的方法，其中所述方法包括免疫检测从转录的基因翻译的蛋白。
实施例：人骨骼肌成肌细胞(hSkM)的肌内植入
此实施例显示胰岛素信号传递途径、线粒体生物合成和功能的潜在基因表达概况分析，并表明如本文实施方案中所声称的实施效果。
将糖尿病KK小鼠分为三组：用基本培养基(M199)注射的KK对照组；用人成纤维细胞移植的KK成纤维细胞组；用hSkM移植的KK成肌细胞组。C57BL小鼠接受hSkM移植作为正常对照。将细胞移植入后肢的肌肉中。将所有动物用环孢菌素治疗仅6周。进行葡萄糖耐受检测。在细胞移植后12周，将小鼠在空腹状态下处死。将植入的肌肉移除并进行基因表达概况分析研究。
动物和饮食——KK小鼠购自Jax Lab, Maine, USA。它是II型糖尿病的遗传肥胖动物模型，并且表征具有高血糖、高胰岛素血症和葡萄糖不耐受12。在14-16周龄，它们比C57BL小鼠重约34%10。将小鼠分别安置在25℃下空调房间中的塑料笼中，具有12小时光照和12小时黑暗循环(光：上午9:00至下午9:00)，并且自由获取食物(5K52 PMI Nutrition International LLC, USA)和水(自来水)。将14-16周龄的小鼠筛选高血糖并用于实验。使用符合下列标准的KK小鼠：(1)空腹血糖>6.5 mmol/L并且(2)在GTT期间在30分钟或60分钟时血糖> 20 mmol/L和在2小时时血糖>11 mmol/L10。
葡萄糖耐受检测(GTT)——研究中使用的所有小鼠进行GTT。过夜空腹(约16小时)后，将小鼠用1g/kg体重的稀释在蒸馏水中的葡萄糖(100mg/ml)腹膜内(i.p.)注射。在葡萄糖注射后0(葡萄糖注射前)、30、60和120分钟收集来自尾静脉的血液样品。通过Accu-Chek Advantage血糖仪(Roche, Germany)测定血糖浓度。
hSkM和人成纤维细胞的培养——在37℃下在5％CO2培养箱中，将人骨骼成肌细胞在225mm2的组织培养瓶中培养和增殖，并用添加有10％胎牛血清、10 ng/ml FGF的M199(10％ M199)维持直到汇合。如先前所述，评价hSkM培养物的纯度和均匀性用于结蛋白和CD56表达10, 13。人成纤维细胞获得自Toan Thang Phan副教授的实验室, Department of Surgery, NUS, Singapore。
细胞标记和移植——在细胞移植前，将细胞用4，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)(Sigma, USA)标记过夜10。
将符合糖尿病标准的KK小鼠随机分配到3组中：KK对照组(n=8)：仅接受1.5ml M199，KK成纤维细胞组(n=8)：接受含3x107个人成纤维细胞的1.5ml M199，和KK成肌细胞组(n=8)：接受含3x107个hSkMs的1.5ml M199。将C57BL小鼠用作正常对照以确定hSKM移植相关的任何副作用并接受含3x107 个hSkMs的1.5ml M199。在麻醉下，将共计20次注射注射入小鼠的大腿的前内侧的两侧肌肉、腿后侧的肌肉和臀区的肌肉。注射后，小鼠回到其笼中进行恢复。所有动物在治疗前三天接受环孢菌素治疗(10 mg/kg/天)直至治疗后6周。血液取样后，动物在12周处死。
免疫组织化学研究——将来自在细胞移植后12周外植的小鼠骨骼肌的DAPI+冷冻切片进行肌养蛋白表达的免疫染色，以确定hSkM细胞核整合入小鼠骨骼肌纤维10。简而言之，将组织切片在100％的甲醇中在-20℃下固定20分钟，然后与0.1％的Triton-100在4℃下孵育10分钟。封闭后，在样品上施加含以1:50稀释的兔抗肌养蛋白(Sc-15376, Santa Cruz, USA)抗体的一抗溶液，并在室温下孵育1小时。在此之后，施加以1:200稀释的缀合有异硫氰酸荧光素(FITC)(F-4890，Sigma，USA)的山羊抗兔IgG 1小时。彻底清洗后，将样品用碘化丙啶复染并在奥林巴斯BX41(Olympus, Japan)荧光显微镜下观察，并使用带有Olympic Micro Image (Olympus, Japan)的数码相机记录图像。
肌肉组织的分离和总RNA的制备——处死后，将大腿前内侧的小鼠骨骼肌立即分离、收集并储存在液氮中。根据制造商的说明用Trizol试剂(Invitrogen，USA)从冷冻肌肉样品中提取总RNA。通过Nanodrop测定RNA的浓度和纯度。用DNA酶I(Fermentas，USA)从总RNA中去除DNA污染。使用Maxima®第一链cDNA合成试剂盒(Fermentas，USA)从1μg总RNA中合成cDNA。对于一个阵列板使用1 µL (~1 µg) cDNA。按照 RT² Profiler™ PCR Array用户手册按照说明进行实时PCR循环。基因表达水平改变≥2倍将被认为是在组之间显著升高，而基因表达水平改变≤0.5倍将被认为是组之间显著降低。通过定量PCR(QPCR)利用cDNA将进一步确认和量化基因表达水平。为了确认基因表达水平，使用Maxima® SYBR Green qPCR Master Mix (2X) (Fermentas, USA)。使用Primer Premier 5软件(Premier Biosoft, USA)设计引物。序列能够根据要求获得。40个循环的QPCR热循环方案如下编程：初始变性10分钟的1个循环，然后在95℃变性15秒，退火30秒并在72℃延伸30秒。
用于小鼠胰岛素途径和线粒体生物合成和功能的骨骼肌中基因表达概况的PCR分析试剂盒购自 SABiosciences, USA。小鼠胰岛素信号传递途径RT² Profiler™ PCR Array (Cat PAMM-030, QIAGEN-SAbiosciences, USA)显示涉及胰岛素应答基因作用的84个基因的表达概况。胰岛素介导与葡萄糖摄取、糖原、脂质和蛋白合成、转录激活、细胞生长和分化相关的广谱的生物应答。
小鼠线粒体RT² Profiler™ PCR Array (PAMM-087, QIAGEN-SAbiosciences, USA)显示参与细胞能量站细胞器的生物合成和功能的84个基因的表达概况。通过此阵列监测的基因包括不仅电子传递链和氧化磷酸化所需的代谢产物，还有维持对ATP合成重要的线粒体膜的极化和电位所需的离子的线粒体分子转运的调节蛋白和介导蛋白。代谢和能量产生不是线粒体的唯一功能。由细胞内损伤信号传递活化的内在凋亡途径基因也包括在此阵列中。
统计学分析：—使用SPSS 20进行统计学分析。所有数据表示为平均值±标准误差含义。将4-点葡萄糖测定的曲线下面积用于通过ANOVA比较三组间的差异。将p<0.05的概率值认为是组间显著性差异。
结果：细胞移植后12周hSkM在宿主肌肉中广泛存活。葡萄糖耐受检验显示在KK成肌细胞组的小鼠中的血糖相比KK对照和成纤维细胞组显著下降。胰岛素信号传递途径的转录模式显示相比于KK对照组(23个基因)、KK成纤维细胞组(8个基因)和C57BL组(8个基因)在KK成肌细胞组中的改变。线粒体生物合成和功能的转录模式也显示相比于KK对照组(27个基因)、KK成纤维细胞组(9个基因)和C57BL组(6个基因)在KK成肌细胞组中的改变。
令人惊讶地并且第一次发现，hSKM移植导致参与胰岛素信号传递途径和线粒体生物合成和功能的多个基因的基因转录物的变化。这伴有在糖尿病KK小鼠中葡萄糖耐受的改善和降低的高血糖。
体重—在治疗后12周四个动物组的平均体重为：KK对照组=32.3±1.3克，KK成纤维细胞=33.1±1.7克，和KK成肌细胞组=30.4±1.2克，和C57BL组=22.9±0.5克。KK小鼠的体重比C57BL小鼠的体重显著更重(对于所有，p<0.05)。虽然在KK成肌细胞组中有体重下降的趋势，但在任何两个KK组间没有发现任何显著性差异。
葡萄糖稳态和细胞整合分析—在治疗后12周小鼠的葡萄糖稳态结果：KK成肌细胞组的HbA1c相比KK对照和KK成纤维细胞显著降低。但是，它仍然显著高于C57BL组(其用作正常对照)的。GTT显示KK成肌细胞组在GTT期间具有显著降低的血浆葡萄糖浓度，并且与C57BL组的类似。(相比KK对照和成纤维细胞p<0.05，并且相比任何KK组：p<0.05)。
hSkM细胞核整合入宿主肌肉纤维：hSkM细胞核的DAPI标记显示100%标记效率。确定在小鼠骨骼肌中的肌养蛋白表达的免疫染色的DAPI阳性的hSkM的存活。同样的组织用碘化丙啶复染以显示所有细胞核。这两个条件的图像的叠加显示hSkM细胞核整合入小鼠骨骼肌中。
HbA1c和葡萄糖耐受检验的改善—糖基化血红蛋白测定表明KK成肌细胞组的小鼠在hSkM移植后取得了显著更好的葡萄糖控制。在治疗后12周，KK成肌细胞组的HbA1c显著低于KK对照和成纤维细胞组的HbA1c(对于两者，p<0.05)。C57BL组的HbA1c显著低于任何KK组(对于所有，p<0.05)。
在KK成肌细胞组中观察到血糖浓度显著下降。在移植后12周，KK对照和成纤维细胞组动物具有严重的高血糖和葡萄糖不耐受。通过对比，KK成肌细胞组小鼠显示相比于KK对照和成纤维细胞组的血糖显著下降(对于两者，p<0.05)，并且达到与C57BL组几乎相似的水平(p>0.05)。
hSkMs在宿主小鼠骨骼肌中的存活和整合—hSkMs的标记效率对于DAPI是100％。在细胞移植后12周在小鼠骨骼肌中发现如DAPI+细胞核所示hSkM的广泛存活。
对于肌养蛋白表达的DAPI+组织的免疫染色显示，hSkM细胞核与宿主细胞核在相同的肌纤维中共定位，暗示hSkM整合入宿主骨骼肌纤维中以形成杂交肌纤维，这是因为肌养蛋白连线出了骨骼肌纤维边界。
在大腿前内侧肌肉中胰岛素信号传递途径的基因表达的阵列分析
KK 成肌细胞组相比于 KK 对照组
KK成肌细胞组中的小鼠与KK对照组相比，有22个基因转录物升高和1个降低，其为筛选的84个基因的27.4％(图1)。22个升高的基因的大部分属于蛋白代谢(13)、细胞生长与分化(9)、MAPK途径(6)、和胰岛素受体相关蛋白(6)、转录因子和调节蛋白(4)、碳水化合物代谢(4)功能组。转录物降低的唯一基因是过氧化物酶体增殖子激活受体γ(PPARγ)的靶基因。这是新的和有趣的发现。
KK 成肌细胞组相比于 KK 成纤维细胞组
KK成肌细胞组中的小鼠与KK成纤维细胞组相比，有8个(84的9.5%)基因转录物升高(图1)。这8个基因属于蛋白代谢(3)、细胞生长与分化(2)、胰岛素受体相关蛋白(1)、转录因子和调节蛋白(3)和PPARγ的靶基因(3)功能组。
KK 成肌细胞组相比于 C57BL 组
与C57BL组相比，KK成肌细胞组中的小鼠有8个基因转录物改变(图1)。在这些中，7个基因转录物升高，1个降低。7个升高的基因的大部分属于蛋白代谢(4)、MAPK途径(2)、碳水化合物代谢(3)和PI-3激酶途径(2)功能组。转录降低的唯一基因是Glut-1。PPARy基因转录物中没有变化。
在大腿前内侧肌肉中线粒体生物合成和功能的基因表达的阵列分析
KK 成肌细胞组相比于 KK 对照组
与KK对照组相比，KK成肌细胞组有27个(84的32.1%)基因转录物升高(图2)。27个基因的大部分属于小分子转运(7)、线粒体转运(7)、内膜易位(5)、对线粒体的靶向蛋白(4)、线粒体蛋白输入(4)、线粒体分裂和融合(4)、线粒体定位(3个升高)、和外膜易位(2)、和膜的极化与电位(2)功能组。
KK 成肌细胞组相比于 KK 成纤维细胞组
与KK成纤维细胞组相比，KK成肌细胞组仅有9个(84的10.7%)基因转录物升高(图2)。9个基因的大部分属于小分子转运(2)、线粒体转运(4)、内膜易位(1)、对线粒体的靶向蛋白(1)、线粒体蛋白输入(2)、线粒体分裂和融合(1)、外膜易位(1)，和膜的极化与电位(2)功能组。属于线粒体定位功能组的基因在KK成肌细胞和KK成纤维细胞组之间没有显示任何显著性差异。
KK 成肌细胞组相比于 C57BL 组
与C57BL组相比，KK成肌细胞组有更少的线粒体基因转录物改变(图2)。5个基因转录物升高并且1个基因转录物降低。5个基因属于小分子转运(1)、线粒体转运(2)、内膜易位(1)、对线粒体的靶向蛋白(4)、线粒体蛋白输入(4)、线粒体分裂和融合(1)、线粒体定位(1个升高)、和外膜易位(2)、和膜的极化与电位(2)功能组。转录降低的唯一基因是Slc25a25，其是小分子转运基因。
属于对线粒体的靶向蛋白、线粒体蛋白输入和外膜易位等功能组的基因在KK成肌细胞和C57BL组之间没有显示任何显著性差异。
实施例令人惊讶地显示hSkM移植后，胰岛素信号传递途径和线粒体生物合成和功能的基因概况在KK小鼠的骨骼肌中发生改变，如同基因转录物证明的改变。hSkM移植后与KK对照小鼠相比，KK小鼠骨骼肌中胰岛素信号传递途径和线粒体生物合成和功能分别有23个(27.4％)和27个(32.1％)基因转录物改变。但是，与KK成纤维细胞组相比基因数目降低到8(9.5%)和9(10.7%)，并且与C57BL组相比降低到8(9.5%)和6(7.1%)。这些表明hSkM 移植入KK小鼠骨骼肌中改变了参与胰岛素信号传递途径和线粒体生物合成和功能的基因的表达水平。不希望被任何理论或此实施方案中的“要点”所限制，认为这些改变直接地或间接地有助于降低的高血糖和改善的葡萄糖耐受。
这些结果显示，hSkM移植实现了更好的葡萄糖稳态和改善的葡萄糖耐受，其伴有在使用短期免疫抑制治疗在细胞移植后12周时hSkMs在KK小鼠骨骼肌中广泛的存活。hSkM细胞核整合入宿主骨骼肌纤维。供体成肌细胞和宿主骨骼肌纤维之间的融合形成杂交肌纤维。不希望被任何理论或本实施方案的“要点”所约束，认为这可以帮助供体hSkM在环孢菌素治疗停药后逃避宿主的免疫排斥，因为成熟的骨骼肌纤维不表达主要组织相容性复合物1类抗原14。供体细胞核还可以在杂交肌纤维中共表达外源基因连同宿主基因。实施例的结果进一步证明正常hSkM的植入可以升高参与胰岛素信号传递途径的22个基因和参与线粒体生物合成和功能的27个基因的表达水平。
发现与KK对照组相比，在KK成肌细胞组中胰岛素信号传递途径的23个基因发生改变：22个升高和1个降低。除了胰岛素信号传递功能组的二次效应物靶基因之外，所有其它功能组均有基因显著地改变。尤其是，这些基因的一半(23个基因的56.55%)参与蛋白代谢。它们的大部分是多功能的并且参与其它功能组。例如，Cebpa、Frs2、Hras1、Jun、Leptin、Raf和Shc1不仅参与细胞生长和分化，而且还参与蛋白代谢。
与KK成纤维细胞组相比，在KK成肌细胞组中8个基因转录物升高：Acaca、Aebp1、Cfd、Gpd-1、Jun、PPARγ、Ptpn1和UCP1。与C57BL组相比，在KK成肌细胞组中7个基因转录物升高并且1个降低：Braf、Frap1、Gpd-1、Igf2、Leptin、Ppp1ca和UCP1升高，而Glut-1降低。我们发现与不仅KK对照小鼠还有接受人成纤维细胞移植的KK小鼠相比，只有接受hSkM移植的KK小鼠具有显著改善的高血糖、葡萄糖耐受和胰岛素抵抗。但是，KK成肌细胞组没有发展出与C57BL组同样的葡萄糖稳态。因此，令人惊讶地看到尤其是在细胞移植治疗的背景下，Acaca、Aebp1、Cfd、Gpd-1、Jun、PPARγ、Ptpn1和UCP1比其它剩余的15个有助于葡萄糖稳态的基因更重要。所有剩余的15个基因转录物水平在KK成肌细胞和KK成纤维细胞组之间是类似的。
与KK成纤维细胞组相比，在KK成肌细胞组中线粒体生物合成和功能的27个基因升高。在KK成肌细胞组中，所有功能组具有显著改变的基因。所述基因的一半(27个的51.9%)参与小分子转运(7)和线粒体转运(7)。除了小分子转运、内膜和外膜易位的基因，大部分其它基因还是多功能的并且参与其它功能组。例如，Aip、Cpt1b和Grpel1不仅参与线粒体转运，而且还参与线粒体蛋白输入和对线粒体的靶向蛋白。
当与KK成纤维细胞组相比时，KK成肌细胞组显示在9个基因中基因转录物升高：Bcl2l1、Cox10、Cpt1b、Slc25a22、Slc25a25、Stard3、Timm17b、Tomm40和UCP1。当与C57BL组相比时，KK成肌细胞组显示在5个基因中基因转录物升高：Bcl2l1、Opa1、Sfn、Slc25a22和UCP1，并且在1个基因中基因转录物降低：Slc25a25。发现与KK对照和KK成纤维细胞小鼠相比，只有接受hSkM移植的KK小鼠具有显著改善的高血糖、葡萄糖耐受和胰岛素抵抗。尽管如此，他们没有发展出与C57BL小鼠同样的葡萄糖稳态。因此，令人惊讶地发现Bcl2l1、Cox10、Cpt1b、Slc25a22、Slc25a25、Stard3、Timm17b、Tomm40比剩余的19个有助于葡萄糖稳态的基因更重要，这是因为剩余的19个基因转录物水平在KK成肌细胞和KK成纤维细胞组之间是类似的。
该结果显示SkM移植补充了缺失的参与葡萄糖转运和代谢的基因。参与胰岛素信号传递途径和线粒体生物合成和功能的多基因的表达水平显著升高。这些改变直接地或间接地有助于增强骨骼肌中葡萄糖转运和代谢。从而，这导致KK小鼠的降低的高血糖和高胰岛素血症和改善的糖尿病表型。
因此，令人惊讶地显示正常hSkM异种移植入KK小鼠的肢骨骼肌中上调参与胰岛素信号传递途径和线粒体生物合成和功能的多个基因的表达。在KK小鼠中这伴有改善的葡萄糖耐受和降低的高血糖。在此背景下发现的具体基因对于监测疾病(具体为糖尿病)发生、进展和通过细胞助增的可能的和实际的治疗是有用的工具。这些基因的一个或多个的检测在用疾病缓解剂诸如细胞助增诸如本文所述的那些治疗之前、期间和之后是尤其有帮助的。这些基因及其产物还可用于选择优秀细胞克隆来用于正在出现的细胞治疗剂领域中。技术人员将容易理解使用本文描述的一个或多个具体的基因以选择繁殖用于疾病治疗和预防的细胞的方法。
权利要求是示例性的而非限制性的。基于本文的公开内容，技术人员可以确定其它相关的实施方案，并且篇幅考虑排除了在阅读本公开后容易理解的此类实施方案的进一步的详尽列举。下列参考文献通过引用以其整体具体并入。具体并入的是所公开的用于获得和生长细胞以及测定生物化学(包括蛋白和DNA/RNA)和细胞标志物的方法和材料。最具体地是，用于参考文献11和14中所述的肌细胞活组织检查、培养、鉴定和用途的每一个临床步骤、程序和材料用途通过引用具体并入。
Figure 7314DEST_PATH_IMAGE001
Figure 402523DEST_PATH_IMAGE002

Claims (10)

1.组合物，其用于治疗宿主中的II型糖尿病，包含：
供应量的培养的来自供体的遗传正常的成肌细胞，其以治疗有效剂量向宿主的至少一种肌肉施用；和
治疗有效剂量的向所述宿主施用的免疫抑制剂，
由此通过成肌细胞细胞核转移向患者供应完整的人基因组，导致所述患者的基因转录物改变、肌肉介导的葡萄糖稳态改善和症状减轻。
2.权利要求1的组合物，其中所述培养的成肌细胞获自选自遗传正常组的供体，包括但不限于所述宿主的父亲或男性同胞。
3.权利要求1的组合物，其中对于II型糖尿病，所述培养的成肌细胞的所述选择的治疗有效剂量是约500亿个细胞，并且其中所述剂量以每毫升患者血清约1亿个细胞施用。
4.权利要求1的组合物，其中所述免疫抑制剂包含环孢菌素，所述环孢菌素在成肌细胞植入前5天开始以每天5到7mg/Kg体重口服施用，并且其中每周监测环孢菌素全血谷水平，并且所述环孢菌素剂量根据需要重新调整以保持约250 ng/mL的血液水平，直至断药开始时第三周的开始，在操作后第三周的结束时完全断药。
5.权利要求1的组合物，其中通过检测提供疾病症状减轻的多个基因的直接转录物的数量或质量的变化进行所述患者的II型糖尿病状态的改善的测定。
6.权利要求1的组合物，用于预防宿主中II型糖尿病症状的发生，由此通过成肌细胞细胞核的转移向所述患者供应完整的人基因组，导致基因转录物改变、正常葡萄糖稳态的保持和糖尿病症状的缺失。
7.发现用于糖尿病治疗的药物化合物或细胞治疗候选物的方法，包括将试验化合物暴露于细胞的体外、先体外后体内或体内的组，测定选自Bcl211、Cox10、Cptlb、Slc25a22、Slc25a25、Stard3、Timm17b和Tomm40的基因的一个或多个的基因活性，并使用阳性基因活性结果以确定用于糖尿病治疗的试验化合物的值。
8.权利要求7的方法，其中所述方法包括检测基因转录物。
9.发现用于糖尿病治疗的药物化合物或细胞治疗候选物的方法，包括将试验化合物暴露于细胞的体外、先体外后体内或体内的组，测定选自Acaca、Aebp1、Cfd、Gpd-1、Jun、PPARγ、Ptpn1和UCP1的基因的一个或多个的基因活性，并使用阳性基因活性结果以确定用于糖尿病治疗的试验化合物的值。
10.权利要求9的方法，其中所述方法包括检测基因转录物。
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