CN111388740B - 一种促伤口愈合敷料及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物医学工程领域，公开了一种促伤口愈合敷料及其制备方法，包括(1)α2巨球蛋白的纯化；(2)将蓝铜胜肽、硫酸铜、亮肽素、羧甲基壳聚糖和聚氧化乙烯溶于水，搅拌均匀，加入α2巨球蛋白溶液，得到纺丝液；(3)采用纺丝液进行静电纺丝，得到促伤口愈合敷料。本发明制备的促伤口愈合敷料是一种能够长效诱导伤口愈合的医疗用材料，能够加速伤口愈合，治疗伤口和皮肤损伤非常有效。

Description

一种促伤口愈合敷料及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物医学工程领域，具体涉及一种促伤口愈合敷料及其制备方法。
背景技术
皮肤损伤后通常需要采用医用敷料来保护伤口，防止创面感染和严重脱水，提供有利于伤口愈合的环境，促进创面愈合。目前传统敷料如医用脱脂棉纱布、棉垫和凡士林纱布等，是临床上皮肤创伤应用最广的敷料。传统敷料具有网状编织结构，其价格低廉、制作工艺相对简单、原料来源广泛、质地柔软，有较强的吸收能力，能防止创面渗液积聚，对创面愈合有一定程度的保护作用，至今仍在皮肤创伤中广泛应用。但是传统敷料也有很明显的缺点，比如敷料被创面积液渗透后屏障作用差，容易引起外源性感染，促伤口愈合效果差。因此，有必要开发一种能够长期有效地抗感染并促伤口愈合的敷料。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种促伤口愈合敷料及其制备方法，制备的促伤口愈合敷料能够抵御蛋白酶的水解作用，长期保持因子活性，达到修复伤口的目的。
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种促伤口愈合敷料的制备方法，包括如下步骤：
S1.取α2M粗提物浓缩后经Sephacryl S-300凝胶层析柱，洗脱液为含0.5mol/LNaCl的100mmol/L pH8.0 Tris-HCl缓冲液，在吸收峰280nm下检测流出液，收集第一峰流出液并超滤脱盐浓缩制得α2巨球蛋白溶液；
S2.将蓝铜胜肽、硫酸铜、亮肽素、羧甲基壳聚糖和聚氧化乙烯溶于水，搅拌均匀制得混合溶液，再加入步骤S1制得的α2巨球蛋白溶液，得到纺丝液；
S3.采用所述纺丝液进行静电纺丝，得到促伤口愈合敷料。
优选的，步骤S1中，所述超滤的超滤膜截留分子量为300-500kDa。
优选的，步骤S1中，所述α2巨球蛋白溶液的蛋白浓度为80-100μg/L。
优选的，步骤S2中，所述羧甲基壳聚糖的规格为粘均分子量5.0×105，脱乙酰度为80-85％；所述聚氧化乙烯的规格为平均分子量1.0×106。
优选的，步骤S2中，所述混合溶液中蓝铜胜肽、硫酸铜和亮肽素的浓度分别为0.17-0.68g/L、0.08-0.16g/L和1.1-3.3g/L；所述羧甲基壳聚糖和聚氧化乙烯在所述混合溶液中的总浓度为10-30g/L，所述羧甲基壳聚糖与聚氧化乙烯的质量比为1:1-1:4。
优选的，步骤S2中，所述α2巨球蛋白溶液的加入量为每100mL混合溶液加入100-150μLα2巨球蛋白溶液。
优选的，步骤S3中，所述静电纺丝工艺中，使用的注射器规格为10mL，针头规格为平头的7号针；所述静电纺丝的条件为：电压12-20kV，接收距离7-10cm，进样速率0.3-1.0mL/h，温度25-35℃。
本发明还提供了一种上述制备方法制备得到的促伤口愈合敷料。
优选的，所述促伤口愈合敷料的厚度为0.3-1mm，孔隙率为92-95％。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明采用蓝铜胜肽、硫酸铜、亮肽素、羧甲基壳聚糖、聚氧化乙烯和α2巨球蛋白溶液制成纺丝溶液，通过静电纺丝制备得到促伤口愈合敷料。其中，采用的α2巨球蛋白和亮肽素能够发挥协同互补作用，抑制蛋白酶活性，让蓝铜胜肽能够发挥长效的促愈合作用；采用的硫酸铜能够释放Cu2+，稳定蓝铜胜肽的活性；另外，Cu2+过高会抑制伤口愈合，Cu2+过低会导致蓝铜胜肽因Cu的解离而失活，采用的羧甲基壳聚糖能够螯合微量Cu2+，进而有效控制伤口环境的Cu2+浓度。通过利用纺丝溶液中的几种成分之间的协同作用，静电纺丝制备得到的促伤口愈合敷料能够抵御蛋白酶的水解作用，长期保持因子活性，达到修复伤口的目的。
附图说明
图1是伤口敷料的动物在体实验结果。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
本发明所有原料，除特殊说明外，对其来源没有特别限制，在市场上购买的或按照本领域技术人员熟知的常规方法制备的即可。
α2M粗提物的制备方法：
将新鲜的猪血浆，在-5℃条件下加入0.1％(w/v)大豆胰蛋白酶抑制剂，另加EDTA(乙二胺四乙酸)溶液使其终浓度至10mmol/L，经5％-18％聚乙二醇6000分级沉淀，充分搅拌60min后，4℃下10000r/min离心30min，5倍质量50mmol/L Tris-HCl(pH7.4)溶液溶解沉淀，50mmol/L Tris-HCl(pH7.4)的缓冲液充分透析，即得α2M粗提物。
实施例1
1、取α2M粗提物浓缩后经Sephacryl S-300凝胶层析柱，洗脱液为含0.5mol/LNaCl的100mmol/L Tris-HCl(pH8.0)缓冲液，在吸收峰280nm下检测流出液，收集第一峰流出液并采用截留分子量为400kDa的超滤膜超滤脱盐浓缩制得α2巨球蛋白溶液，其蛋白浓度采用BCA蛋白定量试剂盒测定为90μg/L；
2、将0.42g蓝铜胜肽、0.12g硫酸铜、2.2g亮肽素、5g粘均分子量为5.0×105、脱乙酰度为82.5％的羧甲基壳聚糖和15g平均分子量为1.0×106的聚氧化乙烯溶于1L水，搅拌均匀制得混合溶液后，再加入1.25mL步骤1所制得的α2巨球蛋白溶液，得到纺丝液；
3、采用纺丝液进行静电纺丝，使用的注射器规格为10mL，针头规格为平头的7号针；静电纺丝条件为：电压15kV，接收距离8cm，进样速率0.5mL/h，温度30℃。得到促伤口愈合敷料A，其厚度为0.6mm，孔隙率为94.8％
实施例2
1、取α2M粗提物浓缩后经Sephacryl S-300凝胶层析柱，洗脱液为含0.5mol/LNaCl的100mmol/L Tris-HCl(pH8.0)缓冲液，在吸收峰280nm下检测流出液，收集第一峰流出液并采用截留分子量为300kDa的超滤膜超滤脱盐浓缩制得α2巨球蛋白溶液，其蛋白浓度采用BCA蛋白定量试剂盒测定为80μg/L；
2、将0.17g蓝铜胜肽、0.08g硫酸铜、1.1g亮肽素、5g粘均分子量为5.0×105、脱乙酰度为80％的羧甲基壳聚糖和5g平均分子量为1.0×106的聚氧化乙烯溶于1L水，搅拌均匀制得混合溶液后，再加入1mL步骤1所制得的α2巨球蛋白溶液，得到纺丝液；
3、采用纺丝液进行静电纺丝，使用的注射器规格为10mL，针头规格为平头的7号针；静电纺丝条件为：电压12kV，接收距离7cm，进样速率0.3mL/h，温度25℃。得到促伤口愈合敷料B，其厚度为0.3mm，孔隙率为93.5％。
实施例3
1、取α2M粗提物浓缩后经Sephacryl S-300凝胶层析柱，洗脱液为含0.5mol/LNaCl的100mmol/L Tris-HCl(pH8.0)缓冲液，在吸收峰280nm下检测流出液，收集第一峰流出液并采用截留分子量为500kDa的超滤膜超滤脱盐浓缩制得α2巨球蛋白溶液，其蛋白浓度采用BCA蛋白定量试剂盒测定为100μg/L；
2、将0.68g蓝铜胜肽、0.16g硫酸铜、3.3g亮肽素、6g粘均分子量为5.0×105、脱乙酰度为85％的羧甲基壳聚糖和24g平均分子量为1.0×106的聚氧化乙烯溶于1L水，搅拌均匀制得混合溶液后，再加入1.5mL步骤1所制得的α2巨球蛋白溶液，得到纺丝液；
3、采用纺丝液进行静电纺丝，使用的注射器规格为10mL，针头规格为平头的7号针；静电纺丝条件为：电压20kV，接收距离10cm，进样速率1.0mL/h，温度35℃。得到促伤口愈合敷料C，其厚度为1mm，孔隙率为92.2％。
伤口敷料的动物在体实验
伤口模型制作和伤口敷料在体实验：选取200-220g的雄性SD大鼠25只，自由取水取食饲养两天。实验当日，将大鼠随机分成5组，每只大鼠腹腔注射0.8mL 20wt％的氨基甲酸乙酯进行麻醉。待大鼠完全失去知觉后，将其背部朝上平放于操作台面，下背部涂抹脱毛膏进行脱毛。脱毛的皮肤用医用酒精棉球消毒，再用医用剪刀沿竖脊肌纵向剪开一个1cm长的切口。然后立即用紫外辐照30min处理的伤口敷料(促伤口愈合敷料A、促伤口愈合敷料B、促伤口愈合敷料C、爱达宝伤口护理透气创可贴大号敷料贴(市售伤口敷料1)和奥奇伤口渗液吸收贴自粘敷贴(市售伤口敷料2)分别覆盖于不同组别大鼠的切口处。外部用医用纱布包扎固定。每隔2d观察切口并更换纱布，但不更换敷料。伤口完全愈合且6d内愈合的伤口表面无显著变化即为痊愈，记录最初愈合时间，结果取平均值±SD，如图1所示。
从图1可知，本发明实施例1～3制备的促愈合伤口敷料处理的伤口平均愈合时间为5-6d，而市售伤口敷料的愈合时间分别为10d和13d。结果表明本发明实施例制备的促愈合伤口敷料较市售伤口敷料具有更好的促进伤口愈合效果，是由于实施例制备的伤口敷料中蓝铜胜肽的促愈合作用，并且α2巨球蛋白和亮肽素发挥协同互补作用，抑制伤口蛋白酶水解活性，使蓝铜胜肽能够发挥长效的促愈合作用。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点，对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (9)

1.一种促伤口愈合敷料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.取α2M粗提物浓缩后经Sephacryl S-300凝胶层析柱，洗脱液为含0.5mol/L NaCl的100mmol/L pH8.0 Tris-HCl缓冲液，在吸收峰280nm下检测流出液，收集第一峰流出液并超滤脱盐浓缩制得α2巨球蛋白溶液；
S2.将蓝铜胜肽、硫酸铜、亮肽素、羧甲基壳聚糖和聚氧化乙烯溶于水，搅拌均匀制得混合溶液，再加入步骤S1制得的α2巨球蛋白溶液，得到纺丝液；
S3.采用所述纺丝液进行静电纺丝，得到促伤口愈合敷料。
2.根据权利要求1所述的一种促伤口愈合敷料的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述超滤所使用的超滤膜的截留分子量为300-500kDa。
3.根据权利要求1所述的一种促伤口愈合敷料的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述α2巨球蛋白溶液的蛋白浓度为80-100μg/L。
4.根据权利要求1所述的一种促伤口愈合敷料的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述羧甲基壳聚糖的规格为粘均分子量5.0×105，脱乙酰度为80-85%；所述聚氧化乙烯的规格为平均分子量1.0×106。
5.根据权利要求1所述的一种促伤口愈合敷料的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述混合溶液中蓝铜胜肽、硫酸铜和亮肽素的浓度分别为0.17-0.68g/L、0.08-0.16g/L和1.1-3.3g/L；所述羧甲基壳聚糖和聚氧化乙烯在所述混合溶液中的总浓度为10-30g/L，所述羧甲基壳聚糖与聚氧化乙烯的质量比为1:1-1:4。
6.根据权利要求1所述的一种促伤口愈合敷料的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述α2巨球蛋白溶液的加入量为每100mL混合溶液加入100-150μL α2巨球蛋白溶液。
7.根据权利要求1所述的一种促伤口愈合敷料的制备方法，其特征在于，步骤S3中，所述静电纺丝工艺中，使用的注射器规格为10mL，针头规格为平头的7号针；所述静电纺丝的条件为：电压12-20kV，接收距离7-10cm，进样速率0.3-1.0mL/h，温度25-35℃。
8.根据权利要求1~7任一项所述的一种促伤口愈合敷料的制备方法制备得到的促伤口愈合敷料。
9.根据权利要求8所述的促伤口愈合敷料，其特征在于，所述促伤口愈合敷料的厚度为0.3-1mm，孔隙率为92-95%。
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