CN111388449A - 一种聚鸟氨酸/羧甲基香菇多糖层层自组装药物载体及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种聚鸟氨酸/羧甲基香菇多糖层层自组装药物载体及其制备方法,包括一MSNs纳米核心和一依次由聚鸟氨酸和羧甲基香菇多糖层层自组装而形成的壳层,该MSNs核心通过溶胶‑凝胶法制得。本发明采用结合层层自组装技术将两种具有潜在健康改善特性的聚电解质包裹在MSNs表面,不仅可以控制MSNs产生的突释效应,而且也得到了一种生物学相容性更好的缓释制剂。
Description
技术领域
本发明属于药物载体技术领域,具体涉及一种聚鸟氨酸/羧甲基香菇多糖层层自组装药物载体及其制备方法。
背景技术
宫颈癌是全世界女性发病率和死亡率第四高的癌症,传统治疗手段主要包括手术、放疗和化疗。然而,没有一种治疗宫颈癌的策略是完全有效的。比如其中传统化疗药物在肿瘤部位的渗透性较差和没有靶向性,决定了病理部位有效药物浓度较低,因此存在着许多副作用。为提高化疗药物癌症治疗效果,发展了纳米技术研发化疗药物传递载体。纳米药物载体通过渗透作用被组织细胞摄取,能够增加药物在病变部位的积聚量,从而增强药物疗效,减少给药次数,降低毒副作用,延长药物作用时间等。
被科学家广泛研究的MSNs纳米粒的孔表面具有丰富的Si-OH键,粒径和孔径可调控、比表面积大、表面易官能团化和显著的生物相容性等特性,在药物传递系统中具有良好的应用前景。但是孔道的开放状态,会引起部分药物早期突释。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术缺陷,提供一种聚鸟氨酸/羧甲基香菇多糖层层自组装药物载体。
本发明的另一目的在于提供上述聚鸟氨酸/羧甲基香菇多糖层层自组装药物载体的制备方法。
本发明的技术方案如下:
一种聚鸟氨酸/羧甲基香菇多糖层层自组装药物载体,包括一MSNs纳米核心和一依次由聚鸟氨酸和羧甲基香菇多糖层层自组装而形成的壳层,该MSNs核心通过溶胶-凝胶法制得。
在本发明的一个优选实施方案中,所述MSNs纳米核心的制备方法包括如下步骤:
(1)将CTAB加入到碱性水中,于75-85℃搅拌溶解;
(2)在步骤(1)所得的物料中加入TEOS并充分搅拌反应;
(3)先以5500-6500rpm的转速离心除去步骤(2)所得的物料中的大颗粒沉淀,再以11000-13000rpm的转速离心,并收集上清中的MSNs;
(4)将步骤(3)所得的MSNs用水和无水乙醇充分洗涤,接着进行酸回流以除去多余的CTAB,酸回流后用无水乙醇洗涤,再超声分散于无水乙醇中,即得MSNs纳米核心分散液。
进一步优选的,所述CTAB与TEOS的比例为100mg∶450-550μL。
进一步优选的,所述碱性水的pH=11。
在本发明的一个优选实施方案中,所述羧甲基香菇多糖通过一氯乙酸法制得。
进一步优选的,所述羧甲基香菇多糖的制备方法包括如下步骤:
(1)将香菇多糖溶解于异丙醇中;
(2)将氢氧化钠溶液缓慢滴加入步骤(1)所得的物料中,滴加完毕后快速搅拌80-100min;
(3)将氯乙酸溶液在30min内地加入步骤(2)所得的物料中,同时于60-70℃搅拌3-5h;
(4)将步骤(3)所得的物料冷却后用稀盐酸调节pH至中性,再纤维素透析袋依次在蒸馏水和超纯水中分别纯化;
(5)将步骤(4)所得的物料旋转蒸发,再冷冻干燥,即得所述羧甲基香菇多糖。
更进一步优选的,所述氢氧化钠溶液的浓度为55-65wt%,所述氯乙酸溶液的浓度为55-65wt%。
再进一步优选的,所述香菇多糖、异丙醇、氢氧化钠溶液和氯乙酸溶液的比例为1g∶25-35mL∶35-45mL∶55-65mL。
上述聚鸟氨酸/羧甲基香菇多糖层层自组装药物载体的制备方法,包括:将所述MSNs纳米核心依次交替放入聚鸟氨酸阳离子电解质溶液和羧甲基香菇多糖阴离子电解质溶液中进行层层吸附,即得。
在本发明的一个优选实施方案中,所述聚鸟氨酸阳离子电解质溶液的溶剂为pH=7.3-7.5的PBS,所述羧甲基香菇多糖阴离子电解质溶液的溶剂为0.1-0.2mol/L的NaCl溶液。
本发明的有益效果是:
1、本发明采用的层层自组装技术操作过程简单,可选材料来源广,制备材料层数可控,载药量高;
2、本发明中的壳层材料聚鸟氨酸具有生物安全性、良好的机械性能与渗透性等性质,同时,香菇多糖具有抗病毒、抗肿瘤、调节免疫等生物学活性。
3、本发明采用结合层层自组装技术将两种具有潜在健康改善特性的聚电解质包裹在MSNs表面,不仅可以控制MSNs产生的突释效应,而且也得到了一种生物学相容性更好的缓释制剂。
附图说明
图1为本发明实施例3中纳米粒的SEM图,其中a为MSNs的SEM图,b为MSN-PLO的SEM图,c为MSN-PLO/LC的SEM图。
图2为本发明实施例3中纳米粒的TEM图,其中a为MSNs的TEM图,b为MSN-PLO的TEM图,c为MSN-PLO/LC的TEM图。
图3为本发明实施例5中MSNs、MSN-PLO和MSN-PLO/LC纳米载体分别与L929(A、B)和Hela(C、D)共培养后的细胞增殖率图,其中,A和C:不同浓度(5、10、25、50、100、200、400μg/mL);B和D:不同时间(24h、48h、72h)。
图4为本发明实施例5中给小鼠注射纳米粒后其脏器的HE染色结果图。
图5为本发明实施例5中溶血实验结果图。
图6为本发明实施例6中Hela细胞与载药纳米粒作用后的增殖率图,其中,A:浓度为变量;B时间为变量。
图7为本发明实施例6中DOX被Hela细胞的摄取情况的激光共聚焦图片,其中,a1-a3:0.5h;b1-b3:2h;c1-c3:4h;d1-d3:6h。
图8为本发明实施例6中DN0被Hela细胞的摄取情况的激光共聚焦图片,其中,e1-e3:0.5h;fl-f3:2h;g1-g3:4h;h1-h3:6h。
图9为本发明实施例6中DN2被Hela细胞的摄取情况的激光共聚焦图片,其中,i1-i3:0.5h;j1-j3:2h;k1-k3:4h;11-13:6h。
图10为本发明实施例6中DN4被Hela细胞的摄取情况的激光共聚焦图片,其中,m1-m3:0.5h;n1-n3:2h;o1-o3:4h;p1-p3:6h。
具体实施方式
以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
为简化描述,将本发明下述实施例所用到的缩写做如下说明:
MSNs | 介孔二氧化硅 |
LN | 香菇多糖 |
LC | 羧甲基香菇多糖 |
PLO | 聚鸟氨酸 |
MSN-PLO | 包裹聚鸟氨酸的自组装纳米粒 |
MSN-PLO/LC | 包裹聚鸟氨酸和羧甲基香菇多糖的层层自组装纳米粒 |
LbLNPs | 层层自组装纳米粒 |
DOX-MSNs(DN0) | 载药MSNs纳米粒 |
DOX-MSN-PLO(DN1) | 预载药后包裹PLO自组装纳米粒 |
DOX-MSN-PLO/LC(DN2) | 预载药后包裹PLO/LC层层自组装纳米粒 |
MSN-PLO-DOX(DN3) | 预包裹PLO后载药自组装纳米粒 |
MSN-PLO/LC-DOX(DN4) | 预包裹PLO/LC后载药层层自组装纳米粒 |
实施例1:制备羧甲基香菇多糖
(1)取1g香菇多糖溶于30mL异丙醇并在室温下搅拌6h使其溶解,标记为A液;
(2)配制质量分数为60%的氢氧化钠溶液40mL缓慢滴加至A溶液中,标记为B液,之后快速搅拌90min;
(3)将60mL质量分数为60%的氯乙酸在30min内逐滴加入上述B液中,并在65℃水浴中搅拌4h。
(4)反应产物冷却后用稀盐酸调pH至中性,转移至纤维素透析袋依次在蒸馏水和超纯水中分别纯化3天、4天;
(5)将产物旋转蒸发,再冷冻干燥得羧甲基香菇多糖(LC);
(6)羧甲基香菇多糖的红外光谱中出现1604cm-1和1324cm-1的新吸收带,及13C NMR谱中在化学位移175.00ppm出现羧酸碳共振峰,结构上确定实验成功衍生出了羧甲基香菇多糖。另外香菇多糖的ζ-电位值由-15.14±1.44mV提高到了-36.99±0.75mV。
实施例2:制备MSNs纳米核心
(1)取48mL的超纯水调pH至11获得碱性水,100mg十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)加入碱性水并在80℃油浴锅中搅拌溶解;
(2)待CTAB完全溶解,向上述溶液中缓慢滴加500μL TEOS并搅拌反应2h;
(3)反应结束后,反应产物首先用6000rpm离心2min除去大颗粒沉淀,然后改为12000rpm离心15min收集上清中颗粒较小的MSNs;
(4)水和无水乙醇多次洗涤上述获得的MSNs,并采用酸回流的方法回流,以除去模板剂CTAB,每次回流后都用无水乙醇洗涤三次,最后将产物超声分散保存在无水乙醇中,获得MSNs纳米核心分散液。
实施例3:制备层层自组装纳米粒
(1)以pH7.4的PBS为溶剂配制浓度为1mg/mL聚鸟氨酸阳离子电解质溶液,以0.14mol/L的氯化钠为溶剂配制浓度为1.5mg/mL的羧甲基香菇多糖阴离子电解质溶液;
(2)取实施例2制得的MSNs纳米核心分散液配制成浓度为1mg/mL混悬液滴入到聚鸟氨酸阳离子电解质溶液里(MSNs与聚鸟氨酸体积比为1∶1),搅拌过后离心收集;
(3)再将步骤(2)所得的产物混悬后滴入到羧甲基香菇多糖阴离子电解质溶液里(MSNs与羧甲基香菇多糖体积比为1∶1.5),搅拌过后离心收集;
(4)循环步骤(2)和(3),最后得到具有一层、二层、三层、四层膜的LbLNPs,分别为MSN-PLO、MSN-PLO/LC、MSN-PLO+1/LC、MSN-PLO+1/LC+1。
(5)通过SEM和TEM观察到制得的纳米粒形貌规整、粒径分布均匀,结果见图1和图2。电位翻转结果也表明MSNs被包覆成功,MSNs表面沉积PLO之后电位由-34.90±1.39mV变为+32.93±0.53mV,继续包裹LC以后转变为-37.07±1.48mV,此后依次交替,且随着包裹聚电解质的纳米粒黏度增大,交替变化的电位值有所降低。结合各项结果,选取平均水合粒径为281nm的MSN-PLO和651nm的MSN-PLO/LC用于后续研究。
实施例4:制备载药纳米粒
(1)预载药后包裹:首先,将5mgMSNs纳米粒加入pH为7.4的PBS溶液中超声分散,然后称取适量的DOX配制成药物母液,按照投药量为10%、20%、30%、40%分别加入到MSNs溶液中,加入适量PBS确保整个载药体系中溶液体积一致,将上述混合溶液在室温条件下避光搅拌一夜,收集载药纳米粒后用PBS洗涤两次,经此步骤制备好DOX-MSN(DN0)。再以DN0作为基底材料,参照实施例三制备LbLNPs的方法,得到预载药后包裹一层聚电解质(PLO)的载药纳米粒DOX-MSN-PLO(DN1)和预载药后包裹两层聚电解质(PLO和LC)的载药纳米粒DOX-MSN-PLO/LC(DN2);
(2)预包裹后载药:按照实施例3中的方法制备自组装纳米粒各5mg,称取适量的DOX配制成药物母液,再按投药量为10%、20%、30%、40%分别加入到各自组装纳米粒溶液中超声分散,加入适量PBS确保整个载药体系中溶液体积一致,将上述混合溶液在室温条件下避光过夜搅拌,收集载药纳米粒并用PBS洗涤两次得到MSN-PLO-DOX(DN3)和MSN-PLO/LC-DOX(DN4)
(3)测定纳米粒的载药量与包封率。随着理论投药量的增加,各组包封率变化呈现不同的趋势,载药量大小顺序为DN4>DN0>DN3>DN1>DN2,当投药量为40%时,各组纳米粒载药量最高;
(4)在pH 5.5和pH 7.4条件下载药纳米粒的药物释放行为观察。除DN2以外的自组装纳米粒组在酸性条件下的释放率都高于pH 7.4时的释放率,DN0在pH5.5的条件下72h内基本释放完全,自组装纳米粒(DN3、DN4)在72h之后仍显示出持续释放的效果。
实施例5:层层自组装纳米粒的生物相容性评价
(1)以L929和Hela细胞为模型细胞,本实施例首先考察了MSNs、MSN-PLO和MSN-PLO/LC的细胞相容性,具体是根据CCK-8检测到的细胞存活情况进行评价;
(2)开展小鼠全身急性毒性实验,给药七天后活体解剖小鼠,取其心、肝、脾、肺、肾制备组织切片,HE染色观察纳米材料对小鼠各脏器的组织相容性;
(3)取兔血与层层自组装纳米粒混合在37℃下温浴30min,考察层层自组装纳米粒的血液相容性。结合以上三部分相容性实验,对层层自组装纳米粒的安全性做初步评价;
(4)综合分析以上结果,如图3所示,表明MSNs对两种细胞增殖无影响;MSN-PLO对两种细胞有一定的抑制作用,对Hela细胞更为敏感;MSN-PLO/LC不影响L929的增殖率,但随着浓度的增大,Hela细胞增殖率逐渐降低。小鼠全身急性毒性实验表明MSNs、MSN-PLO和MSN-PLO/LC纳米粒对小鼠正常生活无影响,但如图4所示的内脏病理切片结果显示MSNs组肾小球缩小,其它均无明显毒性。溶血试验进一步表明包裹了羧甲基香菇多糖的层层自组装纳米粒有助于提高MSNs的血液相容性,溶血实验结果如图5所示,因此后期选择负载药物的MSN-PLO/LC纳米粒用于体外抗肿瘤评价。
实施例6:载药纳米粒的体外抗肿瘤效果评价
(1)采用CCK-8法测定Hela细胞与载药纳米粒共培养后的活性;
(2)激光共聚焦观察载药纳米粒DN2、DN4、DN5与Hela细胞共培养至6h的过程中,药物在细胞内的分布情况。
(3)由以上实验结论,分析得出DN2和DN4在体外对Hela细胞均具有一定的杀伤作用,载药纳米粒对Hela细胞的抑制情况如图6所示;再如图7至图10所示的激光共聚焦图片,可以观察到载药纳米粒在细胞中的分布,相对于DN0,层层自组装纳米粒更易被细胞摄取,0.5h吸附在细胞膜表面,6h基本摄取完全,其中DN2和DN4与细胞作用效果最好。
以上所述,仅为本发明的较佳实施例而已,故不能依此限定本发明实施的范围,即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰,皆应仍属本发明涵盖的范围内。
Claims (10)
1.一种聚鸟氨酸/羧甲基香菇多糖层层自组装药物载体,其特征在于:包括一MSNs纳米核心和一依次由聚鸟氨酸和羧甲基香菇多糖层层自组装而形成的壳层,该MSNs核心通过溶胶-凝胶法制得。
2.权利要求1所述的一种聚鸟氨酸/羧甲基香菇多糖层层自组装药物载体,其特征在于:所述MSNs纳米核心的制备方法包括如下步骤:
(1)将CTAB加入到碱性水中,于75-85℃搅拌溶解;
(2)在步骤(1)所得的物料中加入TEOS并充分搅拌反应;
(3)先以5500-6500rpm的转速离心除去步骤(2)所得的物料中的大颗粒沉淀,再以11000-13000rpm的转速离心,并收集上清中的MSNs;
(4)将步骤(3)所得的MSNs用水和无水乙醇充分洗涤,接着进行酸回流以除去多余的CTAB,酸回流后用无水乙醇洗涤,再超声分散于无水乙醇中,即得MSNs纳米核心分散液。
3.如权利要求2所述的一种聚鸟氨酸/羧甲基香菇多糖层层自组装药物载体,其特征在于:所述CTAB与TEOS的比例为100mg∶450-550μL。
4.如权利要求2所述的一种聚鸟氨酸/羧甲基香菇多糖层层自组装药物载体,其特征在于:所述碱性水的pH=11。
5.如权利要求1所述的一种聚鸟氨酸/羧甲基香菇多糖层层自组装药物载体,其特征在于:所述羧甲基香菇多糖通过一氯乙酸法制得。
6.如权利要求5所述的一种聚鸟氨酸/羧甲基香菇多糖层层自组装药物载体,其特征在于:所述羧甲基香菇多糖的制备方法包括如下步骤:
(1)将香菇多糖溶解于异丙醇中;
(2)将氢氧化钠溶液缓慢滴加入步骤(1)所得的物料中,滴加完毕后快速搅拌80-100min;
(3)将氯乙酸溶液在30min内地加入步骤(2)所得的物料中,同时于60-70℃搅拌3-5h;
(4)将步骤(3)所得的物料冷却后用稀盐酸调节pH至中性,再纤维素透析袋依次在蒸馏水和超纯水中分别纯化;
(5)将步骤(4)所得的物料旋转蒸发,再冷冻干燥,即得所述羧甲基香菇多糖。
7.如权利要求6所述的一种聚鸟氨酸/羧甲基香菇多糖层层自组装药物载体,其特征在于:所述氢氧化钠溶液的浓度为55-65wt%,所述氯乙酸溶液的浓度为55-65wt%。
8.如权利要求7所述的一种聚鸟氨酸/羧甲基香菇多糖层层自组装药物载体,其特征在于:所述香菇多糖、异丙醇、氢氧化钠溶液和氯乙酸溶液的比例为1g∶25-35mL∶35-45mL∶55-65mL。
9.权利要求1至7中任一权利要求所述的一种聚鸟氨酸/羧甲基香菇多糖层层自组装药物载体的制备方法,其特征在于:包括:将所述MSNs纳米核心依次交替放入聚鸟氨酸阳离子电解质溶液和羧甲基香菇多糖阴离子电解质溶液中进行层层吸附,即得。
10.如权利要求9所述的制备方法,其特征在于:所述聚鸟氨酸阳离子电解质溶液的溶剂为pH=7.3-7.5的PBS,所述羧甲基香菇多糖阴离子电解质溶液的溶剂为0.1-0.2mol/L的NaCl溶液。
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2020
- 2020-04-08 CN CN202010271524.XA patent/CN111388449B/zh active Active
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