CN110664778A - 复合微颗粒及其制备方法和作为载体在给药中应用 - Google Patents

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Abstract

一种颗粒，粒径为100nm±20nm，其以金属有机骨架为核心，外层包覆介孔二氧化硅层，在介孔二氧化硅层外还包覆磷酸钙层。本发明提供的颗粒，具有生物相容性，对细胞低毒性，安全性高，受pH调控，对pH变化敏感。以其作为药物载体，随着环境pH的变化，能释放所装载的活性分子，具有靶向给药的作用。经验证，本发明提供的颗粒具有促进细胞迁移，促进VEGF和PDGF表达，以及促血管生成。

Description

复合微颗粒及其制备方法和作为载体在给药中应用
技术领域
本发明涉及一种生物可降解复合材料，尤其涉及一种由多种材料复合而成的颗粒，及其制备方法和在递送药物(drug delivery)中的应用。
背景技术
金属有机骨架(Metal Organic Frameworks，MOF)，也称配位聚合物，是一类以无机金属(金属离子或金属簇)为核与桥连的有机配体通过自组装相互连接，形成的具有周期性网络结构的晶态多孔材料。该材料即不同于无机多孔材料，也不同于一般的有机配合物，既具有无机材料的刚性，也具有有机材料柔韧性的特征。
中国发明专利201310351980.5公开了一种多孔金属有机骨架材料，用于气体储存、气体分离，作为催化剂、传感器或离子导体，用于光或磁应用，作为多孔材料特别适用于天然气、空气、惰性气体的吸附分离与存储。其将含有金属离子的金属化合物(如：Cu2+、Al3 +、Mg2+、Mn2+、Fe3+、Ni2+、Co2+和Zn2+等)、与金属离子配位的有机配体(如：富马酸、1，2，3-苯三甲酸、1，2，4-苯三甲酸、1，3，5-苯三甲酸、咪唑和2-甲基咪唑等)、缓释碱(如：尿素和六亚甲基四胺等)作为去质子碱，在溶剂中充分混合，在40℃～180℃和饱和蒸气压下，通过配位络合作用而自组装形成具有超分子网络结构化合物，然后经过过滤、洗涤、干燥、活化后形成多孔金属有机骨架材料。
中国发明专利201510077924.6公开了一种制备沸石咪唑酯骨架结构材料的方法，将金属锌离子、2-甲基咪唑、氢氧化钠在常温常压下连续搅拌反应1小时，所得的混合物经过离心分离，洗涤，干燥，即得。制得的沸石咪唑酯骨架结构材料应用于气体的分离储存、药物缓释、膜传感器以及异相催化等方面，但并未予以证明。
中国发明专利申请201810284394.6公开了一种蜂巢状金属有机骨架纳米片，由金属离子Cu2+与有机配体1，4-对苯二甲酸通过配位键自组装形成所述蜂巢状的金属有机骨架纳米片。其具有比表面积高、表面活性位点多、机械稳定性高等优点，在化学催化、药物缓释、氢能的储备以及生物医学等领域具有广阔的应用前景，但并未予以证明。
中国发明专利申请201811572574.0公开了一种环糊精-金属有机骨架材料复合微球，系以β-环糊精为有机配体、钾离子为无机金属中心形成的有机骨架材料，解决了CD-MOFs作为递药载体遇水崩解的问题，适用的药物如：酮洛芬、吲哚美辛、萘普生、白消安、兰索拉唑、布洛芬、芬布芬、地西泮、甲硝唑、硝苯地平、泼尼松龙、双氯芬酸钠、对乙酰氨基酚、甲苯磺丁脲、美洛昔康、克伦特罗、氟康唑、卡托普利、水杨酸、土槿皮乙酸、吲达帕胺、普罗西康、咖啡因、阿霉素、顺铂前药、拓扑替康、5-氟尿嘧啶、单/三磷酸-叠氮胸苷、西多福韦、尼美舒利和盐酸普鲁卡因胺等。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种复合微颗粒，以金属有机骨架为核心，外层包覆介孔二氧化硅，以其作为载体，满足多种药物同时提供递送的需要，并能按需释放。
本发明的另一个目的在于提供一种复合微颗粒，在介孔二氧化硅施以含钙离子的材料，赋予载体以pH依赖的特性，以其作为给药载体实现多种药物的靶向释放。
本发明的再一个目的在于提供一种复合微颗粒以其为活性成分制成组合物(如：药物)或医疗器械在促进创伤修复，尤其是血管再生中的应用。
本发明的又一个目的在于提供一种给药载体，以复合微颗粒为药物的载体，实现多种药物的同时递送和靶向释放。
本发明的第五个目的在于提供一种给药载体，将细胞因子装载于复合微颗粒内，保持细胞因子的活性，提高细胞因子的递送效率，促进组织炎症的消除。
本发明的第六个目的在于提供一种方法，以制取本申请的金属有机骨架材料。
一种颗粒，以金属有机骨架为核心，外层包覆介孔二氧化硅层。
另一种颗粒，以金属有机骨架为核心，外层包覆介孔二氧化硅层，在介孔二氧化硅层外包覆磷酸钙层。
另一种颗粒，粒径为100nm±20nm，以镁离子和没食子酸形成的金属有机骨架为核心，外层包覆介孔二氧化硅层，在介孔二氧化硅层外包覆磷酸钙层。
在金属有机骨架中装载细胞因子如：但不限于白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子、集落刺激因子、趋化性细胞因子、转化生长因子和生长因子等，用于调控靶向组织的分化和生长。
本发明的颗粒具有促进细胞迁移，促进VEGF和PDGF表达，以及促血管生成。
本发明的颗粒载于支架上，再将支架置于缺损组织，能显著提高VEGF和PDGF表达，以及促血管生成。
本发明的颗粒与胶原通过化学交联结合成支架，再将支架置于缺损组织，能显著提高VEGF和PDGF表达，以及血管再生。
一种给药载体，以金属有机骨架为核心，外层包覆介孔二氧化硅层，在介孔二氧化硅层外包覆磷酸钙层，将第一种活性分子装载于金属有机骨架，将第二种活性分子装载于介孔二氧化硅层外。第一种活性分子和第二种活性分子为相同的物质。
另一种给药载体，以金属有机骨架为核心，外层包覆介孔二氧化硅层，在介孔二氧化硅层外包覆磷酸钙层，将细胞因子装载于金属有机骨架。
另一种给药载体，以金属有机骨架为核心，外层包覆介孔二氧化硅层，在介孔二氧化硅层外包覆磷酸钙层，将细胞因子装载于金属有机骨架，以及介孔二氧化硅层上。
本发明提供的各种给药载体，其上可以结合具有促进作用(如：激动剂)或抑制作用(如：抑制剂)分子和靶向分子，用于药物的输送和靶向给药，并在pH诱导下按层次，逐步释放。即先释放载于介孔二氧化硅层表面的分子，再随着金属有机骨架的降解，而将药物进一步释放。
本发明提供的一种制取颗粒的方法，步骤如下：
先将MgCl2和没食子酸于50mL水中混合，调节pH至8，并在120℃加热24小时后，固液分离制得Mg-MOF；
接着，将无水乙醇、5mL Mg-MOF溶液(10mgMg-MOF颗粒于1ml水中)和0.8mL氨水室温搅拌5分钟～10分钟。加入1mL正硅酸乙酯，搅拌反应1小时制得Mg-MOF纳米粒子外覆盖一层致密二氧化硅层的颗粒(dSiO2-MOF)；
之后，十六烷基三甲基氯化铵4g和0.1g/ml的三乙胺400μl于40mL水中并在室温下搅拌1小时～1.5小时，然后加入dSiO2-MOF，在80℃±0.2℃继续搅拌1.5小时，再以60μL/min加入300μL TEOS后，再于80℃±0.2℃反应1小时后将至室温，再置于50℃±0.2℃水浴，加入Na2CO3刻蚀30分钟±1分钟，得到介孔二氧化硅纳米粒子包覆的Mg-MOF颗粒(MSN-MOF)。
最后加入CaCl2、MSN-MOF、NaOH和肌酸磷酸盐，在室温下搅拌3天，以在Mg-MOF表面上生长均匀的薄的磷酸钙(CaP)纳米结构壳层的颗粒(MOF@CaP)。
本发明技术方案实现的有益效果：
本发明提供的颗粒，具有生物相容性，对细胞低毒性，安全性高，适用于作为药物载体，应用于活性分子的给药。
本发明提供的颗粒，受pH调控，对pH变化敏感。以其作为药物载体，随着环境pH的变化，能释放所装载的活性分子，具有靶向给药的作用。
本发明提供的颗粒，能同时装载多种(至少2种)活性分子，并随着颗粒降解而按层次逐渐释放。
经验证，本发明提供的颗粒具有促进细胞迁移，促进VEGF和PDGF表达，以及促血管生成。
本发明的颗粒还与其它材料制成支架，再将支架置于缺损组织，能显著提高VEGF和PDGF表达，以及促血管生成。
本发明的颗粒与胶原通过化学交联结合成支架，再将支架置于缺损组织，能显著提高VEGF和PDGF表达，以及血管再生。
附图说明
图1a为本发明颗粒作为给药载体或成骨剂具体应用流程示意图；
图1b为本发明制得的MOF@CaP的TEM电镜图；
图1c为本发明制得MOF@CaP颗粒的BF-STEM电镜图；
图1d为本发明制得Mg-MOF和MOF@CaP粉末的XRD谱图；
图1e为本发明制得Mg-MOF和MOF@CaP在不同pH值(7.4，6.5和5.5)中分散的降解行为，由没食子酸的吸光度决定；
图1f为本发明MOF@CaP颗粒的孔径分布曲线和N2吸附/解吸等温线结果图；
图1g为本发明Mg-MOF和MOF@CaP颗粒与不同用量的BSA混合的载药量结果图；
图1h为本发明Mg-MOF与不同用量的BSA负载后的凝胶电泳图；
图2a为暴露于Mg-MOF颗粒或MOF@CaP颗粒24小时HUVEC迁移的细胞计数结果图；
图2b为第14天支架和周围组织的血管生成因子hif-1α，VEGF和PDGF的mRNA表达的实时qPCR结果图；
图2c为各组CD31的免疫荧光染色结果图。
具体实施方式
以下结合附图详细描述本发明的技术方案。本发明实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。
实施例1制备MOF@CaP纳米颗粒
首先，使用溶剂热法合成Mg-MOF(参见：Chem Commun(Camb)2015，51，5848～51)，具体如下：
在磁力搅拌下将1g MgCl2，3.8g没食子酸(H4gal)和50mL水混合10分钟。加入10MKOH水溶液将pH调节至8，并将混合物在120℃加热24小时。然后10,000rpm离心15分钟固液分离，得浅灰色固体，并用超纯水洗涤两次，得到Mg-MOF。
然后，制取覆有二氧化硅纳米粒子(ACS Nano 2013，7，9027～39)，具体为：在室温下搅拌35.7mL无水乙醇，Mg-MOF溶液(10mgMg-MOF颗粒于1ml去离子水中)5mL和0.8mL氨水室温搅拌5分钟～10分钟。加入1mL正硅酸乙酯(TEOS)继续搅拌，反应1小时使得Mg-MOF纳米粒子外覆盖一层致密二氧化硅层(dSiO2-MOF)。
将4g十六烷基三甲基氯化铵(CTAC)和浓度0.1g/ml的三乙胺(TEA)溶液400μl于40mL水中并在室温下搅拌1小时～1.5小时。然后加入dSiO2-MOF并再搅拌1.5小时。接着，在80℃±0.2℃(此环节中，温度对制得的产物形态影响较大)下混合。同时，以60μL/min加入300μL TEOS，再于80℃±0.2℃反应1小时后将至室温，再置于50℃±0.2℃水浴(此环节中，温度对制得的产物形态影响较大)，加入1272mg Na2CO3刻蚀30分钟±1分钟(此环节中，时间对制得的产物形态影响较大)，得到介孔二氧化硅纳米粒子包覆的Mg-MOF(MSN-MOF)。
最后，以10,000g离心15分钟收集MSN-MOF，并用140mM NaCl的甲醇溶液中清洗三次，每次24小时，再用无水乙醇清洗3次(清洗后10,000g离心20分钟，再超声分散于无水乙醇中)。将0.22g CaCl2和0.1g MSN-MOF溶解在6mL去离子水中，再将2mL 1M NaOH和0.4g肌酸磷酸盐的混合水溶液滴加到上述溶液中。将所得混合物在室温下搅拌3天，以在Mg-MOF表面上生长均匀的薄的磷酸钙(CaP)纳米结构壳层(MOF@CaP)。
利用TEM(JEM-2010，加速电压＝200kV，日本)表征了纳米颗粒的形貌。使用Bruker-AXS微衍射仪(D8 ADVANCE)记录样品的XRD图案，其中Cu-Kα(λ＝1.5406)辐射，扫描速度为0.33min-1，从10°至80°(2θ)连续扫描并记录衍射数据。通过Shimadzu UV-2450UV-vis光谱仪测量Mg-MOF和MOF@CaP的降解，不同pH值的PBS(5.5，6.5和7.4)中孵育一定时间，并通过光谱仪连续测量进行表征。通过表面积和孔隙率分析仪(MicromeriticsInstrument Corp.ASAP2050)测量表面积和孔径。
MOF@CaP颗粒在透射电子显微镜(TEM)下的图像显示出约100nm的均匀球形形态。随后在MSN-MOF表面上形成的中空结构填充CaP壳(参见图1b)。MOF@CaP纳米复合材料的复合结构通过基于亮场扫描TEM(BF-STEM)的元素映射进一步证实其含有Mg、Si和Ca等元素(参见图1c)。通过粉末X射线衍射(PXRD)研究评估MOF@CaP的结晶度，其显示MOF@CaP的晶体结构整合性与原始Mg-MOF一致(参见图1d)。
Mg-MOF在生理液体中降解导致可生物合成的没食子酸和镁离子的释放。降解速率由没食子酸的释放量决定，在pH7的条件下，没食子酸不稳定。pH值为6.5和5.5时下降更快(图1e)。而采用表面MSN和CAP涂层，MOF@CAP能使Mg-MOF在中性pH下保持稳定。在pH值降低的条件下稳定性降低。MOF@CAP的缓慢和pH响应降解行为可以将没食子酸和镁离子的浓度维持在中等水平。
通过Brunauer-Emmett-Teller(BET)测量，MOF@CAP的表面和平均孔径分别为228.7m2g-1和8.1nm(图1f)。得到的多孔结构是有效载药的理想选择。
实施例2制备载药的颗粒
血清白蛋白(BSA或HSA)通常被用于生物大分子在给药载体中载药情况和药物释放情况的研究。通过在超声波下将这些纳米颗粒(10mg/mL)与不同浓度的BSA溶液一起孵育30分钟并在4℃下搅拌2小时。在质量比(BSA∶Mg-MOF)为4∶1的混合时，MOF能够负载自身92％的BSA的量，这与MOF@CaP组相比没有显著差异(图1g)。在这里，我们还发现蛋白质-Mg-MOF结合可以通过电泳分离，即这种蛋白吸附结合是可逆的，不影响蛋白活性(图1h)。
本实施例中，通过抽取未附着的BSA，并使用BCA蛋白质定量试剂盒(购自碧云天生物技术有限公司)测定未结合的BSA的量。两者的差值则确定为结合的BCA量。载有BSA的Mg-MOF纳米颗粒也用于电泳。在通过SDS-PAGE凝胶分离总细胞蛋白质后，使用考马斯蓝染色观察凝胶上的蛋白质条带。为了研究Mg-MOF对生物药物的保护作用，将Mg-MOF与别藻蓝蛋白标记的二抗(2Ab-APC)一起孵育2小时，然后在一系列不利环境(有机溶剂和高温处理，这通常会导致抗体变性或丧失活性)中进行处理。用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)观察2Ab-APC的结合，并使用
Figure BDA0002230170830000061
M3酶标仪读数器发光计来量化荧光强度。荧光定量测量645和660nm的激发和发射波长的荧光强度值。
实施例3制备载药的颗粒
生物活性因子通常需要在严格监管的条件下才能维持活性，并且由于其复杂的三级结构和短的体内生物半衰期，通常需要高剂量，这限制了它们的临床应用。荧光定量检测显示Mg-MOFs对加热和有机溶剂等不利环境表现出增强的抵抗力。
对于装载细胞因子(如：IL4)的MOF@CaP，在超声处理下将12.5μg IL4加入0.5mLMg-MOF(0.4％w/v于水中)溶液中10分钟，并在4℃下搅拌过夜。然后使用具有适当浓度的IL4与BSA类似的方式制备IL4-Mg-MOF，再于其外覆以CaP，产生IL4-MOF@CaP，其用于进一步的实验。为了表征的IL4蛋白的释放，将IL4-MOF@CaP与不同pH值(5.5，6.5和7.4)的磷酸缓冲盐溶液(PBS)一起温育不同的持续时间。在给定的时间点，使用ELISA试剂盒(购自Peprotech)测量溶液。
在不同pH值的溶液中研究IL4从所得到的IL4-MOF@CAP中的药物释放行为表明，在pH6.5和pH5.5的弱酸性溶液中，由于Mg-MOF纳米载体被酸性引发分解为没食子酸和Mg2+离子，IL4的释放速度明显快于pH7.4的MOF@CAP的缓慢释药曲线。
实施例4体外和体内对血管生成作用的评价
在此，评估了MOF@CAP纳米颗粒固有的血管生成作用。首先评估了MOF@CAP对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)迁移的影响(图2a)。将Mg-MOF和MOF@CaP加载到下室中，并将HUVEC悬浮在培养基中并接种在上室中，并在24小时内的不同时间点观察到迁移。很明显，在阴性对照组中，在孵育12小时后仅发生少量的细胞迁移，并且在24小时没有观察到迁移的显着增加。在Mg-MOF和MOF@CaP组中，在孵育的早期时间点发生明显的细胞迁移，并且在孵育24小时后观察到进一步明显的增加。24小时的定量分析显示，与Mg-MOF组相比，MOF@CaP组的细胞迁移显着更高。
体外毛细血管样管形成测定显示，与阴性对照组相比，暴露于Mg-MOF的HUVEC中管形成明显增加。这种增加在MOF@CaP组中更为显着，在24小时时形成高度管形结构。免疫组织化学染色结果进一步证实了这一点，其中MOF@CaP组具有最高的CD31表达。还使用蛋白质印迹评估血管内皮生长因子(VEGF)(血管生成的重要因子)的表达。结果显示，与对照组相比，MOF@CaP和Mg-MOF可以增强VEGF的表达。
还考察了MOF@CaP和Mg-MOF与胶原(COL)通过化学交联结合成支架(MOF@CaP/COL和Mg-MOF/COL)在体内的血管生成作用。具体而言：将COL溶液(于水中0.4％w/v)和MOF@CaP(或Mg-MOF)溶液(于水中0.4％w/v)在磁力搅拌下以1∶1的体积比混合15分钟，然后超声处理1小时以获得MOF@CaP(或Mg-MOF)在Col溶液中的均匀分散。然后，在搅拌下向混合物中加入0.1M EDC和0.025M NHS，并将混合物在室温下保持1小时以使Col与MOF@CaP(或Mg-MOF)交联并形成稳定的MOF@CaP/COL(Mg-MOF/COL)水凝胶，并于-20℃下冷冻过夜，然后在-50℃下冻干。
在颅骨缺损中植入COL支架后，在立体解剖显微镜下随时间检测血管形成。在第3天，即早期时间点，Mg-MOF/COL组的血流灌注略高于胶原对照组，但低于MOF@CAP/COL组。更重要的是，负载抗炎调节剂IL4的IL4-MOF@CAP/COL组进一步增强了血液灌注。在第7天，虽然血管形成在原始和纳米颗粒复合的COL支架中均有增加，IL4-MOF@CAP/COL组的血液灌注量最高。随着急性炎症的消退，第14天血管网开始重塑并消退。
但是，在术后14天，与体外实验结果一致，纳米药物组较对照组(NC)的VEGF的表达仍然较高，尤其是MOF@CAP/COL组和IL4-MOF@CAP/COL组中这种情况特别显著。通过检测缺氧诱导因子(HIF-1α)的基因表达，定量研究了IL4-MOF@CAP/COL的促血管生成作用。术后第14天，缺损区的血管内皮生长因子(VEGF)和血小板衍生生长因子(PDGF)(图2b)。结果表明，与NC和Mg-MOF/COL组相比，MOF@CaP/COL和IL4-MOF@CaP/COL组的生长因子VEGF和PDGF表达显着增加。最重要的是，通过IL4和MOF@CaP的组合，在IL4-MOF@CaP/COL组中得到有效地增强。14天冷冻切片的免疫组织化学分析显示IL4-MOF@CaP/COL组中存在更多CD31阳性血管，IL4-MOF@CaP/COL组与其他三组之间的血管面积具有显著差异(图2c)。

Claims (10)

1.一种颗粒，其特征在于以金属有机骨架为核心，外层包覆介孔二氧化硅层。
2.根据权利要求1所述的颗粒，其特征在于所述的颗粒粒径为100nm±20nm。
3.根据权利要求1所述的颗粒，其特征在于在所述的介孔二氧化硅层外包覆磷酸钙层。
4.根据权利要求1所述的颗粒，其特征在于以镁离子和没食子酸形成的金属有机骨架为核心。
5.一种权利要求1～4之一所述的颗粒在制取促进VEGF和PDGF表达的药物和促血管生成药物中应用。
6.一种支架，其特征在于包括权利要求1～4之一所述的颗粒。
7.根据权利要求6所述的支架，其特征在于所述的颗粒与胶原通过化学交联结合而成。
8.一种给药载体，其特征在于以权利要求1～4之一所述的颗粒为载体，将第一种活性分子装载于所述的金属有机骨架，将第二种活性分子装载于所述的介孔二氧化硅层外；所述的第一种活性分子和所述的第二种活性分子为相同或不同的物质。
9.根据权利要求8所述的给药载体，其特征在于第一种活性分子为细胞因子。
10.一种制取权利要求1～4之一所述的颗粒方法，其特征在于：
先将MgCl2和没食子酸于50mL水中混合，调节pH至8，并在120℃加热24小时后，固液分离制得Mg-MOF；
接着，将无水乙醇、5mL Mg-MOF溶液和0.8mL氨水室温搅拌5分钟～10分钟。加入1mL正硅酸乙酯，搅拌反应1小时制得Mg-MOF纳米粒子外覆盖一层致密二氧化硅层的颗粒dSiO2-MOF；
之后，十六烷基三甲基氯化铵4g和0.1g/ml的三乙胺400μl于40mL水中并在室温下搅拌1小时～1.5小时，然后加入dSiO2-MOF，在80℃±0.2℃继续搅拌1.5小时，再以60μL/min加入300μL TEOS后，再于80℃±0.2℃反应1小时后将至室温，再置于50℃±0.2℃水浴，加入Na2CO3刻蚀30分钟±1分钟，得到介孔二氧化硅纳米粒子包覆的Mg-MOF颗粒MSN-MOF；
最后在MSN-MOF中加入CaCl2、NaOH和肌酸磷酸盐，在室温下搅拌3天，以在Mg-MOF表面上生长均匀的薄的磷酸钙纳米结构壳层的颗粒MOF@CaP。
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