CN111386255B - 用于制备n-乙酰基半胱氨酸酰胺及其衍生物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明包括用于制备和分离N‑乙酰基半胱氨酸酰胺、其中间体和衍生物的方法，该方法包括：使胱氨酸与醇和氯化试剂接触以形成含有L‑胱氨酸二甲酯二盐酸盐的有机溶液；将干燥或未干燥的L‑胱氨酸二甲酯二盐酸盐与三乙胺、乙酸酐和乙腈合并以形成二‑N‑乙酰基胱氨酸二甲酯；将干燥的二‑N‑乙酰基胱氨酸二甲酯与氢氧化铵混合以形成二‑N‑乙酰基胱氨酸酰胺；和使用二硫苏糖醇、三乙胺和醇将干燥的二‑N‑乙酰基胱氨酸二甲酯分离为N‑乙酰基半胱氨酸酰胺。
Description
发明的技术领域
本发明总体上涉及用于制备N-乙酰基半胱氨酸酰胺(N-乙酰基半胱氨酸酰胺，NACA)及其衍生物的方法领域。
发明背景
在不限制本发明范围的情况下，在N-乙酰基半胱氨酸酰胺的合成方面描述其背景。
一种这样的方法在Warner等人提交的标题为“用于制备N-乙酰基半胱氨酸酰胺的方法(Method for Preparation of N-Acetyl Cysteine Amide)”的公开号为20170183302的美国专利公开中教导。简言之，这些发明人教导一种从N-乙酰基-L-半胱氨酸开始制备N-乙酰基-L-半胱氨酸酰胺(NACA)的方法，该方法涉及使N-乙酰基-L-半胱氨酸与有机醇和无机酸接触以形成含有N-乙酰基-L-半胱氨酸酯的有机溶液；用含有碱的水溶液中和有机溶液中的酸以形成中和的混合物；从所述中和的混合物中分离含有N-乙酰基-L-半胱氨酸酯的有机溶液；在减压下从所述有机溶液中除去N-乙酰基-L-半胱氨酸酯；和使N-乙酰基-L-半胱氨酸酯与氨接触。
用于制备N-乙酰基半胱氨酸酰胺(NACA)的另一种这样的方法之前在Martin等人的标题为“Amides of N-Acylcysteines as Mucolytic Agents”,J.Med.Chem.1967,10,1172-1176中描述。
但是，仍然需要开发用于有效地、大规模地合成N-乙酰基半胱氨酸酰胺的有效方法，该方法无需色谱法即可以高化学收率，特别是高化学和对映体纯度提供产物。
发明概述
本公开内容描述了以高化学收率和高对映体纯度制备NACA的有效方法或工艺。二甲基3,3'-二硫烷二基(2R,2'R)-双(2-氨基丙酸酯)二盐酸盐在本文中通常称为L-胱氨酸二甲酯二盐酸盐。二甲基3,3'-二硫烷二基(2R,2'R)-双(2-乙酰氨基丙酸酯)在本文中通常称为二-N-乙酰基胱氨酸二甲酯或Di-NACMe。(2R,2'R)-3,3'-二硫烷二基双(2-乙酰氨基丙酰胺)在本文中通常称为Di-NACA。(R)-2-乙酰氨基-3-巯基丙酰胺在本文中通常称为NACA或NPI-001或N-乙酰基半胱氨酸酰胺。具体地，本文公开了一种方法，其包括：使胱氨酸与醇和氯化试剂接触以形成含有L-胱氨酸二甲酯二盐酸盐的有机溶液；将干燥或未干燥的L-胱氨酸二甲酯二盐酸盐与三乙胺、乙酸酐和乙腈合并以形成二-N-乙酰基胱氨酸二甲酯；将干燥的二-N-乙酰基胱氨酸二甲酯与氢氧化铵混合以形成二-N-乙酰基胱氨酸酰胺；和使用二硫苏糖醇、三乙胺和醇将干燥的二-N-乙酰基胱氨酸二甲酯还原为N-乙酰基半胱氨酸酰胺。在一方面，所述醇是选自烷基醇、甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇或丁醇的有机醇。在另一方面，使L-胱氨酸与醇和氯化试剂接触以形成含有L-胱氨酸二甲酯二盐酸盐的有机溶液的步骤在-10至10℃下进行，然后在65℃至70℃加热至回流以完成。在另一方面，所述氯化试剂是亚硫酰氯。在另一方面，还包括在所述接触步骤和合并步骤之间的溶剂交换。在另一方面，所述合并步骤在-10至10℃下进行。在另一方面，将在合并步骤中形成的沉淀物过滤并用乙酸乙酯洗涤，然后真空干燥。在另一方面，所述合并步骤在-10至10℃下使用至少15体积的乙腈，然后添加至少4当量的三乙胺，然后添加至少2当量的乙酸酐。在另一方面，所述有机溶剂是乙酸乙酯。在另一方面，所述方法还包括使用干燥剂干燥从中和的混合物中除去的有机溶液。在另一方面，所述的方法还包括在反应完成后，使用饱和的碳酸氢钠从二-N-乙酰基胱氨酸二甲酯游离碱化(free-basing)三乙胺的步骤。在另一方面，所述氨以含水氢氧化铵的形式提供。在另一方面，N-乙酰基-L-胱氨酸酯与氨的接触在室温下进行。在另一方面，在将二-N-乙酰基胱氨酸二甲酯还原为N-乙酰基半胱氨酸酰胺中不使用金属。在另一方面，在减压下除去有机物的步骤在约45℃或更低的温度下进行。在另一方面，在减压下除去有机物的步骤在约35℃或更低的温度下进行。在另一方面，在减压下除去有机物的步骤在约30℃或更低的温度下进行。在另一方面，在减压下除去有机物的步骤在约45℃下进行。在另一方面，将从中和的混合物中除去的有机溶液过滤以除去固体。在另一方面，一种或多种还原剂选自三苯基膦、巯基乙酸或二硫苏糖醇，并且有机溶剂是四氢呋喃(THF)、二氯甲烷(DCM)、异丙醇(2-丙醇)或乙醇。在另一方面，在药品生产质量管理规范(GMP)条件下生产的N-乙酰基半胱氨酸酰胺的批量大小大于1kg。在另一方面，在GMP条件下生产的N-乙酰基半胱氨酸酰胺的批量大小大于15kg。在另一方面，在GMP条件下生产的N-乙酰基半胱氨酸酰胺的批量大小大于50kg。在另一方面，在GMP条件下生产的N-乙酰基半胱氨酸酰胺的批量大小大于100kg。
在另一个实施方案中，本发明包括具有下式的化合物：
在另一个实施方案中，本发明包括具有下式的化合物：
在另一个实施方案中，本发明包括具有下式的化合物：
在再另一个实施方案中，本发明包括一种用于制备N-乙酰基半胱氨酸酰胺的方法，该方法包括：
在另一个实施方案中，本发明包括一种用于制备N-乙酰基半胱氨酸酰胺的方法，该方法包括：使L-胱氨酸与醇和氯化试剂接触以形成含有L-胱氨酸二甲酯二盐酸盐的有机溶液；将干燥的L-胱氨酸二甲酯二盐酸盐与三乙胺、乙酸酐和乙腈合并以形成二-N-乙酰基胱氨酸二甲酯；将干燥的二-N-乙酰基胱氨酸二甲酯与氢氧化铵混合以形成二-N-乙酰基胱氨酸酰胺；和使用二硫苏糖醇、三乙胺和醇将干燥的二-N-乙酰基胱氨酸二甲酯还原为N-乙酰基半胱氨酸酰胺，其中所述还原不存在金属。在一方面，所述一种或多种还原剂选自三(2-羧乙基)膦、巯基乙酸、二硫苏糖醇，并且所述有机溶剂是THF或二氯甲烷(DCM)、异丙醇或乙醇，并且所述碱是三乙胺。
附图简述
为了更全面地理解本发明的特征和优点，现在参考本发明的详细说明以及附图，其中：
图1示出本发明的基本化学合成。
图2A示出没有原子标记的NPI-001(NACA)分子“A”的视图。所有的非氢原子均用以50％的概率水平设置的热椭圆体示出。颜色代码：碳，灰色；H，白色；O，红色；S，黄色。
图2B示出衍生自起始原料L-胱氨酸的NACA的部分。
图3示出包含完整分子的NPI-001的轴的晶胞图。所有的原子均用以50％的概率水平设置的热椭圆体示出。颜色代码：碳，灰色；H，白色；O，红色；S，黄色。
图4示出使用质谱检测的液相色谱的结果。
图5示出NPI-001的模拟(120K)XRPD 2θ衍射图。
图6示出NACA的1H-NMR。
图7示出NACA的1H-NMR分配(1H和13C分配基于1D 1H NMR，1H-13C HSQC和1H-13C HMBC光谱的分析)。
图8示出NACA的13C-NMR。
图9示出NACA的13C-NMR分配(1H和13C分配基于1D 1H NMR，1H-13C HSQC和1H-13CHMBC光谱的分析)。
图10示出NACA的组合热重/差示扫描量热法扫描。
图11示出NACA的傅立叶变换-红外光谱(FT-IR)。
图12示出显示NACA以及所有中间体和起始原料的方法I色谱图。
图13是示出B1和B2的方法II的代表性色谱图。
图14是示出R-NACA和S-NACA的分离的代表性色谱图。
图15示出NPI-001晶型1、NPI-001/尿素型式(pattern)1和NPI-001/尿素型式1急速冷却(Crash Cool)的XRPD。
图16示出NPI-001晶型1、diNACA、甲醇钠，来自甲醇的NPI-001/甲醇钠型式1和来自乙醇的NPI-001/甲醇钠型式1的XRPD衍射图。
发明详述
尽管下面详细讨论了本发明的各种实施方式的制造和使用，但是应当理解的是，本发明提供了许多可应用的发明构思，这些构思可以在各种特定情况下体现。本文讨论的特定实施方案仅是制造和使用本发明的特定方式的示例，并不限制本发明的范围。
为了便于理解本发明，下面定义了许多术语。本文所定义的术语具有与本发明有关的领域的普通技术人员通常理解的含义。诸如“一个(a)”，“一个(an)”和“所述(the)”之类的术语并非旨在仅指单数实体，而是包括其特定实例可用于说明的通用类别。本文的术语用于描述本发明的特定实施方案，但是除了权利要求中概述的以外，它们的用法不限制本发明。
本发明涉及用于制备N-乙酰基半胱氨酸酰胺(NACA)及其新的中间体的新方法。更具体地，本发明利用新的中间体从而显著且令人惊讶地提高了以高化学收率和高对映体纯度制备NACA的效率。以下是NACA的基本化学结构。
可以采用以下步骤制备本发明的化合物。用于制备这些化合物的起始原料和试剂可从商品供应商例如the Aldrich Chemical Company(Milwaukee,Wis.)、Bachem(Torrance,Calif.)、Sigma(St.Louis,Mo.)获得，或通过本领域普通技术人员熟知的方法，按照描述于以下的参考文献的程序制备：Fieser and Fieser’s Reagents for OrganicSynthesis,第1-17卷,John Wiley和Sons,New York,N.Y.,1991；Rodd's Chemistry ofCarbon Compounds,第1-5卷和增刊；Elsevier Science Publishers,1989；OrganicReactions，第1-40卷，John Wiley和Sons,New York,N.Y.,1991；March J.:AdvancedOrganic Chemistry，第四版，John Wiley和Sons,New York,N.Y；和Larock:ComprehensiveOrganic Transformations,VCH Publishers,New York,1989，其相关部分通过引用并入本文。
如图1所示，分4步制造NACA。起始原料是天然存在的两个半胱氨酸亚基上均具有L构象的L-胱氨酸。在第一步中，通过形成L-胱氨酸的二甲酯来保护两个酸基。在第二步中，使L-胱氨酸上的两个氮与乙酸酐反应以得到di-NACME，其本质上是两个酸被保护形成甲酯并且两个伯胺基团用乙酰基保护的L-胱氨酸。步骤3将甲酯基团转化为伯酰胺。步骤4将Di-NACA中间体还原性断裂以得到NACA。
NACA的制备具有一种对最终结构的骨架有重大贡献的起始原料：L-胱氨酸。在图2B中，虚线框中的NACA的部分源自L-胱氨酸。L-胱氨酸提供手性中心和氨基酸核心。两种常见的试剂乙酸酐和氢氧化铵，分别通过衍生化羧酸和伯胺来提供原子。
表1：起始原料的列表
| 起始原料 | 质量 | 其他 |
| L-胱氨酸 | ≥98.5％纯的 | BSE/TSE-认证 |
起始原料控制。目前，L-胱氨酸的质量是根据由制造商提供的规格和由合同制造组织(CMO)执行的入库测试来控制的。CMO执行的释放测试如表G所示。供应商根据用于该材料的USP专论测试L-胱氨酸。
表2：L-胱氨酸测试
| 属性 | 测试方法 | 规格/限制 |
| 外观 | 目测 | 白色粉末 |
| ID | NMR(USP<761>；D2O) | 符合结构 |
| 纯度<sup>1</sup> | 滴定 | 98.5-101.0％ |
| 旋光 | 供应商方法 | -215至-225° |
(1)使用测试可以代替纯度测试
试剂和溶剂。表H和表I分别提供了在制造过程的每个步骤中使用的试剂和溶剂的列表。
表3：试剂列表
| 步骤 | 试剂 | 质量 |
| 1 | 亚硫酰氯 | ≥97％ |
| 2、4 | 三乙胺 | ≥99％ |
| 2 | 乙酸酐 | ≥99％ |
| 2 | 碳酸氢钠 | ≥99％ |
| 2 | 硫酸钠(无水的) | -- |
| 3 | 氢氧化铵 | 28-32％ |
| 4 | 二硫苏糖醇 | ≥98％ |
表4：溶剂列表
在第一步中，形成了L-胱氨酸的甲酯。在缓慢添加亚硫酰氯之前，将L-胱氨酸和甲醇冷却至-10℃。技术人员将认识到甲醇可以被其他类似的反应性醇和/或其他供选择的羧酸活化剂(例如草酰氯，CDI等)替代。然后将浆料加热至回流以产生溶液。最初，在进行后处理之前，将反应保持4小时。使用HPLC发现没有实现完全转化。将该反应保持在回流下16小时被证明对于转化是有效的。一旦确认反应完成，就将溶液溶剂交换成乙醚。根据制备方法，也可以使用其他这样的溶剂，例如甲基叔丁基醚(MTBE)。已证明MTBE是乙醚的有效替代品，因为此溶液可以成功地被溶剂交换成MTBE，并且也可以用于洗涤。将白色固体过滤并用MTBE洗涤，然后在45℃下在真空下干燥至收率为95-99％，纯度为96-99％。
在步骤2中，将L-胱氨酸二甲酯二盐酸盐转化为二-N-乙酰基胱氨酸二甲酯。将以在乙腈中的浆料形式的L-胱氨酸二甲酯二盐酸盐冷却至0±5℃。首先向冷却的溶液中添加4.1当量的三乙胺，然后2.1当量的乙酸酐，同时在整个添加过程中维持内部温度≤5℃。在老化不少于30分钟后，通过HPLC确认反应完成。向反应中添加乙酸乙酯，并进行水后处理。一旦水后处理完成，就通过真空蒸馏乙腈并用乙酸乙酯置换数次将有机溶液完全交换成乙酸乙酯。通过过滤分离产物二-N-乙酰基胱氨酸二甲酯，并干燥至收率为73-75％，纯度为93-97％。步骤2可以用几种不同的方式来完成。尽管不那么有效，但使用在10体积乙腈中的300重量百分比的amberlyst-A21将L-胱氨酸二甲酯二盐酸盐游离碱化。然后在室温下使用2.1当量乙酸酐和2.5当量三乙胺将在乙腈中的游离碱化物料的溶液乙酰化。将粗物料浓缩并溶解在乙酸乙酯中，然后用饱和的碳酸氢钠和盐水溶液洗涤。将洗涤的有机物浓缩至干燥，得到收率为73-75％，纯度为93-97％。
供选择地且更有效地，步骤2游离碱化后用总计600重量百分比的amberlyst-A21替代三乙胺。将乙腈增加至15体积以利于搅拌。游离碱化完成后，可以在室温或更低的温度下添加乙酸酐。在室温下进行反应时可能会形成一些杂质，因此，可以将反应冷却至0℃以成功减少杂质形成。反应完成后，将溶液预先浓缩至干燥。通常，在某些分离步骤中可过滤的固体可能是优选的。因此，将乙腈溶液溶剂交换成乙酸乙酯，得到可过滤的固体。将这些固体过滤并用乙酸乙酯洗涤，然后在45℃下在真空下干燥，得到45％的收率，98％的纯度。也可以将溶剂交换后的物料骤冷至0℃，保持1小时，以提高收率至65％，同时获得相似的纯度。
通常，三乙胺比amberlyst-A21便宜，因此该反应也可以仅使用三乙胺来完成。通过将在15体积的乙腈中的L-胱氨酸二甲酯二盐酸盐的混合物冷却至0℃，然后添加4.1当量的三乙胺，接着再添加2.1当量的乙酸酐来完成。以前，使用amberlyst-A21来游离碱化，形成的盐酸盐结合到amberlyst-A21并从物料中滤出，得到无色透明的L-胱氨酸二甲酯溶液。使用三乙胺作为游离碱，导致形成三乙胺氯化物盐。将其滤出，然后使用在13％的NaCl溶液中的0.5N HCl将三乙胺盐析。此时，类似于先前的方法，将反应物溶剂交换成乙酸乙酯并过滤。该替代方法导致收率为88-92％，纯度为93-95％。
在步骤2中仅使用三乙胺会导致酸处理前一些产品损失，使用酸无法有效去除三乙胺以及物料降解。当首先进行三乙胺乙酰化时，在处理溶液之前过滤固体。然而，固体的HPLC显示存在所需的产物Di-NACMe。一旦反应完成，就将浆料现在溶于15体积的乙酸乙酯中，然后进行处理以使溶液中的Di-NACMe最大化。最初，使用在13％盐水溶液中的0.5N HCl处理反应溶液。酸处理的产物的1H-NMR结果表明，在步骤2的产物中仍存在大量的三乙胺。除了不能有效地除去三乙胺外，在加热时，干燥之前物料中酸的存在使物料降解成褐色乳脂状(brown taffy)。由于酸不仅不能除去三乙胺，而且还降解物料，所以避免酸。反应完成后，用饱和碳酸氢钠代替HCl来游离碱化三乙胺、乙酸和HCl。在用碱处理反应溶液以中和HCl后，认为三乙胺可以与乙腈(ACN)共沸，而乙酸在溶剂交换后留在乙酸乙酯中。
类似于NAC方法，Di-NACMe胺化成Di-NACA在氢氧化铵中进行。最初，将固体装入8.44当量的28-30％的含水氢氧化铵。随着Di-NACA沉淀，固体在溶液中溶解。固体形成后，将浆料搅拌2小时，然后过滤并用最少的水洗涤。将固体在45℃下在真空下干燥。该方法导致收率为60-70％，纯度为70％。反应完成后将溶剂交换为乙醇进一步提高收率，而不会牺牲纯度。Di-NACA的较高纯度可用于在最终还原步骤中获得较高的收率。另外，Di-NACA可以从水中重结晶以进一步提高纯度。
Di-NACA还原为NACA可以使用三(2-羧乙基)膦(TCEP)、巯基乙酸和/或二硫苏糖醇(DTT)完成。一种还原方法使用在加热至回流的15体积的10:1的THF:水中的1.1eq TCEP。使用2.5eq的巯基乙酸进行通过巯基乙酸的还原。尝试使用THF和乙醇作为溶剂进行反应。THF反应的为约42％，纯度为4％。乙醇反应的收率为2％，纯度为30％。以使用乙醇为目标，评估了amberlyst-A21和三乙胺作为有助于还原的碱。经测定，amberlyst-A21是更有价值的碱，收率为45％，纯度为85％。amberlyst-A21还将反应时间从三乙胺介导的反应中的2天减少到amberlyst-A21介导的反应中的3小时。供选择地，也可以使用DTT。可以使用各种可能的溶剂，例如二氯甲烷(DCM)、甲醇、异丙醇、乙醇和/或其他醇溶剂。选择乙醇是因为其对Di-NACA的溶解度更高。本文考虑使用替代的还原剂，例如但不限于三苯基膦、TCEP、巯基乙酸等。溶剂，例如但不限于THF、EtOH、iPrOH、MeOH、DCM、水等。催化或化学计量的碱，例如但不限于Et3N、NaOH、amberlyst-A21等。最初，为了实现还原二硫键，将1.5当量的三乙胺添加到溶于乙醇的Di-NACA中，然后添加1.5当量的DTT。将该溶液加热至回流并保持2小时，然后将溶剂交换成甲基叔丁基醚以沉淀可过滤的固体。反应的进一步优化导致三乙胺还原至催化量为0.1当量，DTT为1.25当量，反应温度为62±3℃，且具有改善了分离的NACA的杂质分布的效果。该方法收率为85％，纯度≥98.0％。通过从乙醇中重结晶，可以进一步提高NACA的纯度。
这些提高纯度的努力集中于通过HPLC测量的主要杂质，即Di-NACA、DTT和环状DTT。通过NAC途径的NACA制备揭示出当暴露于空气中时，NACA氧化。将还原和溶剂交换中使用的乙醇和甲基叔丁基醚(MTBE)脱气，试图降低Di-NACA。证明MTBE可有效去除DTT和环状DTT，因此进行MTBE研磨以提高纯度。
进行Di-NACA纯化的目的是通过用于更纯的NACA的还原来获得更纯的物料。
步骤1：L-胱氨酸二甲酯二盐酸盐的形成
装置：2000L搪玻璃反应器；
将50kg L-胱氨酸和625L甲醇装料至反应器并搅拌，同时冷却至-10℃。
在≤-5℃下缓慢添加60kg亚硫酰氯。添加完成后，将反应物料加热至回流并保持16小时。在通过HPLC证实反应完全(≤0.5％起始原料)之后，将反应冷却至室温。将反应混合物浓缩至6体积，然后溶剂交换为3×8体积的MTBE。将得到的浆料在室温下搅拌1小时，然后过滤并用MTBE洗涤。将固体在45℃下在真空下干燥。
产量：68.15kg(95.9％)，纯度：95.8％。
步骤2：双-N-乙酰基-l-胱氨酸二甲酯(Di-NACMe)的形成
装置：800升搪玻璃反应器
将26kg L-胱氨酸二甲酯二盐酸盐和390L乙腈(ACN)装料至反应器并搅拌，同时冷却至0℃。
在≤5℃下将32kg三乙胺添加到反应器。
在≤5℃下，将16kg乙酸酐缓慢添加到反应器。一旦添加完成，就将反应在5±5℃下保持30分钟。在通过HPLC证实反应完全(≤0.5％起始原料)之后，将10体积的乙酸乙酯添加到反应器并搅拌至环境温度。将所得的反应混合物用2×2体积的饱和碳酸氢盐洗涤。用5体积的乙酸乙酯反萃取水层。合并所有有机物并用硫酸钠干燥，并抛光过滤(polish-filtered)。将滤液浓缩至5体积，然后用2×4体积的乙腈共沸，然后溶剂交换成4×6体积的乙酸乙酯。将得到的浆料在0℃下搅拌1小时，然后过滤并用2体积的乙酸乙酯洗涤。将固体在25℃下在真空下干燥。
平均产量:29.56kg(100％)，平均纯度:92.2％。
步骤3:Di-NACA的形成
装置：800升搪玻璃反应器
将244kg脱气的28-30％NH4OH(含水的)冷却至0℃，然后将87.05kg Di-NACMe装料至反应器并搅拌4小时。在通过HPLC证实反应完全(≤0.5％起始原料)之后，将反应混合物溶剂交换成3×5体积的脱气乙醇。将所得的浆料在0℃下搅拌30分钟，然后过滤并用冷的脱气乙醇洗涤。将固体在45℃下在真空下干燥。
平均产量：52公斤(67.1％)，平均纯度：72.0％。
步骤3A:Di-NACA的纯化
装置：800L搪玻璃反应器
将52kg Di-NACA和416L脱气水装料至烧瓶并搅拌，同时加热至回流。一旦溶解，就使反应溶液冷却过夜。过滤固体，并使用2体积冷的脱气水洗涤。将固体在45℃下在真空下干燥。
回收率:36克(69％)，纯度:86.4％。
步骤4:NACA的形成
装置：800升搪玻璃反应器
将720L脱气乙醇、1.1kg三乙胺、22kg二硫苏糖醇和36kg Di-NACA装料至反应器，然后将反应加热至62±3℃。反应在温度下保持2小时。在通过HPLC证实反应完成(≤0.5％在过载的柱上的起始原料)之后，将反应冷却至环境温度。将该反应溶液抛光过滤并浓缩至10体积，然后溶剂交换成4×10体积的脱气MTBE。将所得的浆料搅拌过夜，然后过滤并用2体积的脱气MTBE洗涤。将固体在45℃下在真空下干燥。
收率：27.8kg(77.2％)，纯度：98.5％。
图1示出本发明的基本化学合成。图2A示出没有原子标记的NPI-001分子“A”的视图。所有的非氢原子均用以50％的概率水平设置的热椭圆体示出。颜色代码：碳，灰色；H，白色；O，红色；S，黄色。图2B示出衍生自起始原料L-胱氨酸的NACA的部分。图3示出包含完整分子的NPI-001的轴的晶胞图。所有的原子均用以50％的概率水平设置的热椭圆体示出。颜色代码：碳，灰色；H，白色；O，红色；S，黄色。图4示出使用质谱检测的液相色谱的结果。图5示出NACA的模拟(120K)XRPD 2θ衍射图。图6示出NACA的1H-NMR。图7示出NACA的1H-NMR分配(1H和13C分配基于1D 1H NMR、1H-13C HSQC和1H-13C HMBC光谱的分析。)。图8示出NACA的13C-NMR。图9示出NACA的13C-NMR分配(1H和13C分配基于1D 1H NMR、1H-13C HSQC和1H-13C HMBC光谱的分析)。图10示出NACA的组合热重/差示扫描量热法扫描。图11示出NACA的傅立叶变换-红外光谱(FT-IR)。
NACA的分析程序。表5列出用于测试NACA原料药的分析方法。大多数方法是USP药典测试。其他的NACA原料药方法(非药典的)包括两种用于分析和杂质的HPLC方法，以及一种用于手性纯度的手性HPLC方法。在以下各节中将更详细地描述每种非药典的方法。
表5：NACA原料药分析程序的列表
用于纯度和相关物质的HPLC方法。对NACA原料药的纯度和相关物质的分析使用带紫外(UV)检测器的反相HPLC。该方法总结在表6中。该方法还用作每个步骤的过程中方法以跟进反应完成。
表6 NACA HPLC方法I的总结(纯度和相关物质)
图12示出显示NACA以及所有中间体和起始原料的方法I色谱图。
杂质B1和B2的HPLC方法。方法I并不总是检测杂质B1和B2。开发了第二种方法，方法II，以可靠地定量这两种杂质。该方法总结在表7中。在图13中呈现显示B1和B2的保留时间的代表性色谱图。
表7:NACA HPLC方法II(杂质B1和B2)的总结
图13是示出B1和B2的方法II的代表性色谱图。
用于测定NACA手性纯度的手性HPLC方法。开发了手性方法以评估NACA的手性纯度。该方法总结在表8中。
表8：用于NACA的手性HPLC的方法的总结
图14是示出R-NACA和S-NACA的分离的色谱图。
D-NACA的制备。获得D-胱氨酸。将D-胱氨酸溶解在水中，并用NaOH将pH调节至pH9-10。在0℃下滴加乙酸酐，并将pH保持在9-10。搅拌溶液4小时，然后用HCl将其酸化至pH为约2。在减压下蒸发溶剂。将20mL MeOH添加到烧瓶中以溶解内容物。过滤溶液。将滤液浓缩并蒸发。薄层色谱(MeOH:DCM:HOAc 1:8:1)表明起始原料消失，并出现D-乙酰基胱氨酸的单一新峰。将D-乙酰基胱氨酸装料至具有50mL MeOH的圆底烧瓶，在室温下在搅拌下通过注射器向其中滴加0.35mL浓H2SO4。溶液变浑浊。通过TLC(MeOH:DCM，1:9)的IPC显示无起始原料。蒸发溶剂。用NaHCO3(饱和的)中和级分(fraction)，用DCM萃取(50ml两次)，用水洗涤，用Na2SO4干燥，过滤，用氮气吹扫并在减压下浓缩，得到在冰箱中形成的净重7.8g的白色固体，将N-乙酰基半胱氨酸甲酯装料入具有氮气瓶(bublet)和磁力搅拌器的三颈圆底烧瓶中。在环境温度下添加氢氧化铵并用氮气吹扫通过反应混合物，并在环境温度下搅拌。在真空下蒸发溶剂，形成白色固体。添加乙醇并加热形成澄清溶液，静置过夜。将结晶的白色固体过滤，用乙醇洗涤并通过柱色谱法纯化。
NACA的口服溶液
进行研究以测定NACA在
(Ora-Sweet是市售的糖浆载体，其包含水、蔗糖、甘油、山梨糖醇、调味剂、缓冲剂(柠檬酸和/或磷酸钠)、对羟基苯甲酸甲酯和山梨酸钾，pH 4.2，由明尼苏达州明尼阿波利斯市的Paddock Laboratories，Inc.生产)中的溶解度。使用了HPLC设备以及玻璃容器和搅拌器。
80mg/ml的NACA不容易溶解在ORA-SWEET中，而是需要搅拌20-30分钟以得到溶液。但是，摇动30秒，NACA容易溶于水，然后用等体积的ORA-SWEET稀释并摇动20-30秒。因此，将NACA溶解于50mL水中，然后溶解于50mL Ora-Sweet中，摇动以溶解于不透明的带封口塑料瓶中，并提供给受试者用于自我给药(口服)。
NACA口服溶液也被制备成ORA-SWEET中的100ml口服溶液。剂量范围可以达到250mg至4000mg/天/患者。发现对于混合最优的是将NACA溶解于水中，然后用ORA-SWEET稀释。ORA-SWEET是淡粉色的溶液，具有樱桃糖浆味。NACA具有轻微的硫磺味和苦味(像烧焦的芝麻籽)。当溶解在ORA-SWEET中时，硫磺味和苦味被掩盖。
制定了以下用于制备NACA口服液的说明：
称量NACA[250、750、1500、3000或4000mg(±1mg)，适用于特定的剂量组)]并放入125mL(约)容量的不透明的高密度聚乙烯标记(参见表9)瓶中，该瓶具有不透明聚丙烯螺帽。
表9.用于阶段1研究的NACA口服溶液的容器/封口
| 组件 | 说明 |
| 瓶 | 125mL不透明白色高密度聚乙烯瓶 |
| 盖 | 聚丙烯不透明白色盖 |
| 标签 | 制药业批准的标签 |
量取50mL的净化水并倒入装有NACA的每个瓶子中并用手剧烈摇动(至少30秒)使其溶解。
量取50mL Ora-Sweet并倒入装有NACA的每个瓶子中并用手剧烈摇动(至少30秒)使其溶解。
受试者喝完全部溶液，然后用两个20毫升的水冲洗容器，然后饮用。
用于临床I期或临床II期试验的NACA片剂或胶囊剂：
表10呈现出用于NACA片剂的定性组成。
表10：NACA片剂的定性组成
将250毫克NACA片剂配制为速释药物产品。将含有250mg NACA的辊压混合物压制成圆形双凸片剂。
用于制造NACA片剂的配方是通常赋形剂的辊压混合物(表11)。将混合物压制成圆形、双凸形的片剂。
表11：NACA片剂的定量组成
容器类型和剂型封口
将250mg NACA片剂包装到带有箔感应封口和白色聚丙烯螺旋盖的高密度聚乙烯(HDPE)瓶中。用于制剂的赋形剂符合药典标准。乳糖充当填充剂。微晶纤维素充当填充剂。交联羧甲基纤维素钠充当崩解剂。硬脂酸充当润滑剂。通过评估在具有每种赋形剂的混合物中NACA的稳定性来筛选赋形剂。与其他赋形剂相比，NACA与微晶纤维素、乳糖一水合物、交联羧甲基纤维素钠和交聚维酮/Kollidon CL和羟丙基纤维素的混合物均显示出较少的NACA降解(表12)。羟丙基纤维素比其他前面的赋形剂显示出更高水平的杂质(数据未显示)。基于这些结果以及配方师的共同经验，选择微晶纤维素、乳糖一水合物、交联羧甲基纤维素钠和硬脂酸作为NACA片剂的赋形剂。
表12：在40℃/75％RH下4周后，NACA/赋形剂混合物的稳定性结果
制备表13和14。使用NACA的制剂与各种赋形剂的辊压获得具有可接受的流动性的粉末。辊压然后压缩，获得具有基于脆性和硬度的可接受的性质的片剂。基于可接受的2周稳定性数据选择临床制剂。
将NACA制剂与各种赋形剂干混获得流动性差的粉末。干混后压缩，所获得的片剂基于脆性和硬度而不令人满意。
使用NACA的制剂与各种赋形剂的辊压获得具有可接受的流动性的粉末。辊压然后压缩，获得具有基于脆性和硬度的可接受性质的片剂。
表13：通过辊压的成品原型NACA片剂
*包装配置1(含干燥剂)：
瓶：60CC 33/400W-HDPE圆瓶
瓶盖：具有SG-75M衬垫的33MM SECURX
干燥剂：干燥剂罐硅凝胶2GM(DESICCANT CANISTER SILICA GEL 2GM)
填充：每瓶20片
*包装配置2(无干燥剂)：
瓶：60CC 33/400W-HDPE圆瓶
瓶盖：具有SG-75M衬垫的33MM SECURX
填充：每瓶20片
NACA片剂干混制剂开发
将NACA片剂制剂(表15)干混并直接压制。从料斗到压机的制剂流不均匀。而且，所得片剂经受差的脆性、硬度和压盖性。结果，放弃了干混。
表15.原型NACA片剂干混制剂的组成
上述制剂也可以用作填充到胶囊中的干混物。
进一步研究了微粉化条件与降解产物DiNACA的初始增加之间的关系。比较不锈钢和氧化锆研磨罐清楚地表明，钢样品经历降解产物DiNACA的依赖于时间的增加。相反，使用氧化锆罐和球不导致降解产物DiNACA的初始增加。因此，对氧化锆研磨工艺进行了进一步研究，并成功优化了对于1％NACA制剂的粒度分布、研磨参数和杂质分布。对氧化锆研磨工艺进行了研究，并成功优化了对于1％NACA制剂的粒度分布、研磨参数和杂质分布。通过激光衍射分析的粒度分布为x10＝1.3μm、x50＝4.7μm和x90＝12.3μm。制备了批次并发现在环境温度下可稳定最多4周。
单晶X射线衍射。
通过单晶X射线衍射由合适的晶体测定了NACA的绝对结构，该晶体是将饱和的2-丙醇NACA溶液冷却至环境条件而生长的。晶体的单晶分析清楚地表明，该材料是具有预期的键连接性的NACA。由Flack参数为-0.02(3)证实了晶体中的绝对立体化学，具有极高的置信度。材料的密度高，降低了甚至可能形成更稳定的多晶型物的风险，并且观察到的氢键网络满足了在NACA中观察到的预期功能。来自SC-XRD数据的预测的XRPD与晶型1材料一致，表明晶体代表了块状材料。收集数据并发现其是栾晶的，因此，使用HKLF5和BASF命令对其进行了精炼，在单斜空间群P21中找到了两个具有BASF标度0.7271(10):0.2729(10)的双组分孪晶，其中仅在不对称单元中找到NACA的两个完整式单元。在最终结构中未发现任何异常，使用Flack参数为-0.02，e.s.d 0.03获得的最终的R1[I>2σ(I)]为3.30％，使用1549个商测定，其适用于准确测定NACA的IUPAC名称为2R)-2-(乙酰基氨基)-3-硫烷基丙酰胺(＝N-乙酰基-L-半胱氨酸酰胺＝(R)-2-乙酰基氨基)-3-巯基丙酰胺)。
NACA，晶型1总体结构品质因子：1
其中：
1.强的数据集，无异常，R1～4％。可公布的质量。
2.良好的数据集，包含一些轻微异常，R1～6％。可公布的质量。
3.平均数据集和/或容易建模的异常或栾晶。谨慎公布。
4.较差数据和/或重大异常或栾晶，不容易建模。在某些情况下可以公布。
5.非常弱的数据和/或无法解释的数据或模型特征。不能公布的质量。
多晶型现象。
已使用多种溶剂和实验条件对NACA(NACA)(NACA)进行了详细的多晶型物筛选。在初筛期间，观察到的最常见的固体形式是型式1(表16)。
表16.NACA晶型1的晶体学参数和细化指标
几个实验得出不同的衍射图谱，或更常见的是观察到额外的峰。额外的峰将表明存在另一种晶型，尽管它不是纯相。
尝试使用急速冷却、蒸发和抗溶剂添加重现这些晶型均失败了。通过NMR对这些尝试的分析表明，该材料仍然主要是NACA材料，并且还没有被氧化成Di-NACA。这些潜在晶型的可重现性的缺乏是其缺乏稳定性的良好证据。这项研究清楚地表明，NACA材料以晶型1存在，其他晶型即使不是不可能也难以制备。
将约80mg的NACA称入24个小瓶的每个中。将下面列出的溶剂添加到适当的小瓶中。计算添加的量(基于溶解度研究)，以溶解约60％的材料。将这些混合物在环境温度和40℃之间以4小时循环进行温度循环，持续72小时。从浆料中分离出的固体通过XRPD测试。将得到的饱和溶液分离到三个单独的小瓶中，以进行急速冷却、抗溶剂添加和蒸发实验。
表17-初步多晶型物筛选中使用的溶剂列表
具有质谱检测的液相色谱
柱温：30℃
流动相A： 0.1％v/v甲酸的水溶液
流动相B： 0.1％v/v甲酸的乙腈溶液
稀释剂：流动相A： 50:50水:乙腈
流速： 1.0mL/min
运行时间： 25分钟
进样体积： 10μL
检测： 190-400nm
梯度：
| 时间(分钟) | 溶剂B[％] |
| 0 | 0 |
| 12 | 10 |
| 15 | 100 |
| 15.1 | 100 |
| 25 | 0 |
仪器：LCQ Advantage离子阱质谱仪
样品浓度：1mg/ml，+ve离子注入模式
源电压(kV)：4.50
源电流(μA)：80.00
鞘气流速：20.00
辅助/吹扫气流量：0.00
毛细管电压(V)：8.00
毛细管温度(℃)：200
套筒镜(V，Sp)：40.00
NACA/尿素共晶体。进行了初步共结晶筛选，其中在2种工艺相关的结晶条件，即热成熟和蒸发下，在6种溶剂体系中筛选了28种潜在的共晶体形成物(CCF)(表18)。鉴定NACA/尿素共晶体(图15)。作为次要共晶体筛选的一部分，成功从四种溶剂中放大了NACA/尿素型式1材料，然后通过XPRD和PLM全面表征，发现其为具有预期的XRPD型式的晶体，热稳定并具有高纯度。NMR分析证实了材料中所含尿素的近似化学计量含量。该材料在环境条件和高温(80℃)下似乎是稳定的，但在高湿度下长期贮存则不稳定，显示降解为di-NACA。在有机溶剂和低水活度的溶剂/水混合物中未发现解离迹象，但在去离子水和高水活度的溶剂/水混合物中发现解离。使用XRPD后分析的另外DSC实验证实在DSC冷却循环中观察到的放热事件是重结晶为NACA。
表18初步共晶体筛选的共晶列表
NACA钠盐。在2种与工艺相关的结晶条件，即热成熟和蒸发下，使用6种溶剂体系进行盐筛选。从这项研究中，鉴定出一种钠盐。如图16所示，使用来自乙腈、乙醇、甲醇或四氢呋喃的甲醇钠形成盐。
预期就本发明的任何方法、试剂盒、试剂或组合物而言，本说明书中讨论的任何实施方案都可以实施，反之亦然。此外，本发明的组合物可用于实现本发明的方法。
应当理解，本文所述的特定实施方案是以举例说明的方式显示的，而不作为对本发明的限制。在不脱离本发明范围的情况下，可以在各种实施方案中采用本发明的主要特征。本领域技术人员将认识到或能够使用不超过常规的实验确定本文所述具体过程的许多等同方案。这样的等同方案被认为是在本发明的范围内并且被权利要求涵盖。
说明书中提及的所有出版物和专利申请显示本发明所属领域的技术人员的技术水平。所有出版物和专利申请均通过引用并入本文，其程度如同每个单独的出版物或专利申请被具体和单独地指出通过引用并入。
当在权利要求和/或说明书中与术语“包含”结合使用时，词语“一(a)”或“一(an)”的使用可以意指“一个(one)”，但它也与“一个或多个”、“至少一个”和“一个或多于一个”的含义一致。权利要求中使用术语“或”用于意指“和/或”，除非明确指出仅指供选择的方案或供选择的方案是相互排斥的，尽管本公开内容支持仅指代供选择的方案和“和/或”的定义。在整个本申请中，术语“约”用于表示包括装置、用于确定值的方法的误差的固有变化，或研究对象之间存在的变化的值。
如在本说明书和权利要求(多项权利要求)中所使用的，词语“包含(comprising)”(和任何形式的包含(comprising)，例如“包含(comprise)”和“包含(comprises)”)、“具有(having)”(和任何形式的具有(having)，例如“具有(have)”和“具有(has)”)、“包括(including)”(以及任何形式的包括(including)，例如“包括(includes)”和“包括(include)”)或“含有(containing)”(以及任何形式的含有(containing)，例如“含有(contains)”和“含有(contain)”)都是包括性的或开放式的，并且不排除另外的、未叙述的要素或方法步骤。在本文提供的任何组合物和方法的实施方案中，“包含”可以用“基本上由......组成”或“由......组成”替换。如本文所用，短语“基本上由......组成”要求指定的整体(多个整体)或步骤以及不会实质上影响所要求保护的发明的特征或功能的那些。如本文所用，术语“由......组成”仅用于显示所列举的整体(例如，特性、要素、特征、性质、方法/工艺步骤或限定)或整体组(例如，特性(多个特性)、要素(多个要素)、特征(多个特征)、性质(多个性质)、方法/工艺步骤或限定(多个限定))的存在。
本文使用的术语“或其组合”是指该术语之前列出的项目的所有排列和组合。例如，“A、B、C或其组合”旨在包括以下中的至少一个：A、B、C、AB、AC、BC或ABC，并且如果顺序在特定上下文中是重要的，那么也包括BA、CA、CB、CBA、BCA、ACB、BAC或CAB。继续该实例，明确包括含有一个或多个项目或条目的重复的组合，例如BB、AAA、AB、BBC、AAABCCCC、CBBAAA、CABABB等。技术人员将理解，除非从上下文另外显而易见，通常对任何组合中的项目或条目的数量没有限制。
如本文所使用的，近似的词语，例如但不限于，“大约”、“基本的”或“基本上”是指这样的情况，当被如此修饰时被理解为不必是绝对的或精确的，但将被视为足够接近使本领域普通技术人员确保指明所述情况是存在的。描述可以变化的程度将取决于可以实施并且仍使本领域普通技术人员认识到修饰的特征仍然具有未修饰特征的所要求的特征和能力的变化的程度。一般而言，但受前面的讨论的限制，本文通过诸如“约”的近似词修饰的数值可以从所述值变化至少±1、2、3、4、5、6、7、10、12或15％。
根据本发明，无需过度实验即可形成和实施本文公开和要求保护的所有组合物和/或方法。虽然已经就优选实施方案描述了本发明的组合物和方法，但是对于本领域技术人员显而易见的是，可以在不脱离本发明的构思、精神和范围的情况下，对本文描述的组合物和/或方法以及在本文描述的方法的步骤中或步骤顺序中施加变化。对于本领域技术人员显而易见的所有这样的类似的替代和修改都被认为是在由所附权利要求限定的本发明的精神、范围和构思内。
Claims (14)
1.一种用于制备N-乙酰基半胱氨酸酰胺的方法，包括：
使L-胱氨酸与甲醇和氯化试剂接触以形成含有L-胱氨酸二甲酯二盐酸盐的有机溶液；
将干燥或未干燥的L-胱氨酸二甲酯二盐酸盐与三乙胺、乙酸酐和乙腈合并以形成二-N-乙酰基胱氨酸二甲酯；
将干燥的二-N-乙酰基胱氨酸二甲酯与氢氧化铵混合以形成二-N-乙酰基胱氨酸酰胺；和
使用二硫苏糖醇、三乙胺和醇，将干燥的二-N-乙酰基胱氨酸酰胺还原为N-乙酰基半胱氨酸酰胺。
2.权利要求1所述的方法，其中在-10至10℃下使所述L-胱氨酸与甲醇和氯化试剂接触，然后在65℃至70℃下将混合物加热至回流直到完成，以形成含有L-胱氨酸二甲酯二盐酸盐的有机溶液。
3.权利要求1所述的方法，其中所述氯化试剂是亚硫酰氯。
4.权利要求1所述的方法，其中所述合并步骤在-10至10℃下进行。
5.权利要求1所述的方法，其中在所述合并步骤中形成沉淀物，并且将所述沉淀物过滤并用乙酸乙酯洗涤，然后真空干燥。
6.权利要求1所述的方法，其中所述方法还包括在反应完成后，使用饱和的碳酸氢钠从二-N-乙酰基胱氨酸二甲酯游离碱化所述三乙胺的步骤。
7.权利要求1所述的方法，其中所述氢氧化铵以含水氢氧化铵的形式提供。
8.权利要求1所述的方法，其中所述二-N-乙酰基胱氨酸二甲酯与氢氧化铵的混合在室温下进行。
9.权利要求1所述的方法，其中将来自合并步骤的产物混合物过滤以除去固体。
10.权利要求1所述的方法，其中在GMP条件下生产的N-乙酰基半胱氨酸酰胺的批量大小大于1kg。
11.权利要求1所述的方法，其中在GMP条件下生产的N-乙酰基半胱氨酸酰胺的批量大小大于15kg。
12.权利要求1所述的方法，其中在GMP条件下生产的N-乙酰基半胱氨酸酰胺的批量大小大于50kg。
13.权利要求1所述的方法，其中在GMP条件下生产的N-乙酰基半胱氨酸酰胺的批量大小大于100kg。
14.一种用于制备N-乙酰基半胱氨酸酰胺的方法，该方法包括以下方案：
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