CN111378788A - 辅助covid-19诊断的菌种标志物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种辅助COVID‑19诊断的菌种标志物及其应用，属于病原微生物感染检测技术领域。该菌种标志物包括：副流感嗜血杆菌、丙酸杆菌、非典型韦荣球菌、惰性凝聚杆菌、坦纳拟普雷沃菌、昭和弯曲菌、梭杆菌、具核梭杆菌、牙周梭杆菌、血孪生球菌、副溶血嗜血杆菌、唾液嗜血杆菌、牙龈卟啉单胞菌、中间普氏菌、普氏菌、普氏菌、变黑普氏菌和普氏菌中的至少一种。该菌种标志物得到的预测模型ROC的AUC值可达0.910，可将上述菌种标志物用于辅助SARS‑CoV‑2感染诊断，提高对COVID‑19肺炎的诊断能力，在一定程度上可以弥补病毒核酸检验假阴性的缺陷。
Description
技术领域
本发明涉及病原微生物感染检测技术领域，特别是涉及一种辅助COVID-19诊断的菌种 标志物及其应用。
背景技术
2019年爆发的新型冠状病毒，命名为2019-nCoV或SARS-CoV-2，可通过飞沫与接触传 播，是易传播疾病的病原。感染SARS-CoV-2的疾病称为COVID-19肺炎，症状为发热、干咳、乏力等，与流感病毒、腺病毒、呼吸都合胞病毒等其他已知病毒性肺炎及肺炎支原体感染肺炎相似，导致临床医生较难鉴别，准确鉴定是否为SARS-CoV-2感染对临床诊断和治疗以及公共卫生安全有重要的作用。
研究表明，人体微生态与疾病具有关联，人体微生态的动态变化与人类健康、疾病或者 亚健康状态相关，糖尿病、肝硬化和炎症性肠病等疾病已建立相应的检测、辅助诊断和疾病 进展检测等生物标志物已经建立，可提高疾病诊断灵敏度。
COVID-19肺炎是新爆发的感染性肺炎，潜伏期为14-28天，无症状的携带者病毒载量较 低，核酸检测方法的技术局限性易出现假阴性结果，危及公共卫生安全。
对于呼吸道微生态来说，呼吸道的粘膜表面定植着大量的细菌，主要是厚壁菌门、放线 菌门、拟杆菌门、变形杆菌门和梭杆菌门细菌等。对于单个个体来说，呼吸道菌群虽然受到 食物、空气微生物以及个人口腔卫生状态等影响，其菌群组成也是高度恒定的，不同个体间 存在共同的核心菌群。研究表明，呼吸道感染患者与健康人群的呼吸道微生态明显不同，不 同的疾病状态下，呼吸道微生态的特征不同，可辅助疾病的预防、诊断和监测。然而，目前 还没有辅助COVID-19诊断相关的菌种标志物报导。
发明内容
基于此，有必要针对上述问题，提供一种辅助COVID-19诊断的菌种标志物，该标志物 能够对COVID-19肺炎进行辅助诊断。
一种辅助COVID-19诊断的菌种标志物，包括：Haemophilus_parainfluenzae副流感嗜血 杆菌、Propionibacterium_humerusii丙酸杆菌、Veillonella_atypica非典型韦荣球菌、 Aggregatibacter_segnis惰性凝聚杆菌、Alloprevotella_tannerae坦纳拟普雷沃菌、 Campylobacter_showae昭和弯曲菌、Fusobacterium_hwasookii梭杆菌、Fusobacterium_nucleatum 具核梭杆菌、Fusobacterium_periodonticum牙周梭杆菌、Gemella_sanguinis血孪生球菌、 Haemophilus_parahaemolyticus副溶血嗜血杆菌、Haemophilus_sputorum唾液嗜血杆菌、 Porphyromonas_gingivalis牙龈卟啉单胞菌、Prevotella_intermedia中间普氏菌、 Prevotella_multiformis普氏菌、Prevotella_nanceiensis普氏菌、Prevotella_nigrescens变黑普氏 菌和Prevotella_timonensis普氏菌中的至少一种。
人体微生态菌群的种类及相对丰度与疾病相关，本发明人在前期工作中发现，COVID-19 肺炎患者呼吸道样本的微生态菌群种类和相对丰度和Non-COVID-19其他病原微生物感染肺 炎(即非SARS-CoV-2感染的其它病原微生物感染肺炎)患者的有较大差异，因此收集 COVID-19肺炎患者和其它肺炎患者呼吸道样本，进行宏基因组检测，对两组的微生态菌种 进行差异化分析，筛选均被检测到且相对丰度具有差异的菌种作为标志物菌种，用于辅助 COVID-19诊断的标志物，在一定程度上可以弥补病毒核酸检验假阴性的缺陷，提高对 COVID-19的诊断能力，当SARS-CoV-2病毒核酸检测为阴性，而上述菌种标志物表达阳性， 可提示进行复检或进一步观察等工作。
在其中一个实施例中，所述菌种标志物包括Haemophilus_parainfluenzae副流感嗜血杆菌、 Propionibacterium_humerusi丙酸杆菌、Veillonella_atypica非典型韦荣球菌中的至少一种。
以上述菌种标志物辅助诊断，具有最佳诊断效果。
本发明还公开了一种上述的菌种标志物在制备COVID-19辅助诊断检测试剂或检测设备 中的应用。
在其中一个实施例中，对所述菌种标志物的应用为：检测得到生物样本中所述菌种标志 物的相对丰度，与预设判定值进行对比，得出检测结果。
在其中一个实施例中，所述菌种标志物的相对丰度通过基因检测和/或MALDI-TOF质谱 检测得到。
可以理解的，基因检测方法可采用宏基因组检测或PCR等方式，MALDI-TOF质谱检测 可通过测定细菌自身独特的蛋白质组成，用质谱技术将测得的蛋白质和多肽按分子量大小排 列，形成独特的蛋白质组指纹图，通过特征性的模式峰进行菌株的鉴定和检测。
在其中一个实施例中，所述菌种标志物的相对丰度通过以下方法获得：分离提取生物样 本中核酸，构建文库，进行测序，对测序数据进行生物信息学分析，得出所述菌种标志物的 序列数，对序列数进行标准化得到菌种的相对丰度。具体的，基于序列数使用DESeq2(R程 序包)计算归一化系数，以序列数除以归一化系数即为菌种标准化后的相对丰度。通过序列 数标准化可消除测序总量不同对结果的影响。
在其中一个实施例中，所述预设判定值通过以下方法得到：分别获取COVID-19肺炎组 及其它病原微生物感染肺炎组样本数据，根据两组样本数据进行差异化分析，以各菌种相对 丰度差异倍数绝对值为2倍以上为预设判定值。
在其中一个实施例中，所述差异化分析时，限定FDR<0.05。
在其中一个实施例中，所述检测试剂用于痰液、鼻咽拭子、咽拭子、肺泡灌洗液样本的 检测。
本发明还公开了一种COVID-19辅助检测试剂盒，包括检测上述的菌种标志物的试剂。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的COVID-19辅助诊断菌种标志物，是发明人在宏基因组学研究的基础上，首先 通过COVID-19肺炎组患者和其他病原微生物感染肺炎组患者菌种的相对丰度差异进行分 析，得到具有差异的菌种作为候选标志物，再通过对候选标志物进行分析验证，得到的菌种 标志物预测模型ROC的AUC值可达0.910，可将上述菌种标志物用于辅助SARS-CoV-2感染 诊断，提高对COVID-19的诊断能力，在一定程度上可以弥补病毒核酸检验假阴性的缺陷。
附图说明
图1为实施例1中PCoA分析结果；
图2为实施例1中差异菌种ROC曲线；
图3为实施例2中菌种标志物ROC曲线；
图4-10为实施例4中以不同菌种组合作为标志物的ROC曲线；
图11为实施例5中病例检测结果对比示意图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了 本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的 实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人 员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施 例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列 项目的任意的和所有的组合。
实施例1
一、样本入组标准：
1、COVID-19肺炎组：通过临床症状、流行病学史判断为疑似2019-nCoVCOVID-19感染样本。
临床症状：(1)发热和/或呼吸道症状、(2)胸部影像学：早期小斑片影及间质改变，发展双肺磨玻璃影、侵润影，严重者肺实变、胸腔积液、(3)发病早期白细胞总数正常或降低，淋巴细胞计数正常或减少。
2、其他病原微生物感染肺炎组：通过临床症状、微生物培养、RT-PCR或(及)NGS核酸检测，诊断为非SARS-CoV-2感染，为其他病毒、细菌或真菌感染。
二、样品采集
根据上述入组标准，共采集14例COVID-19肺炎和39例其它病原微生物感染肺炎痰液 样本(包括病毒性感染肺炎12例，细菌性感染肺炎16例和真菌感染肺炎11例)。
三、高通量测序。
按照常规通用方法，使用宏转录组测序方法，以高通量测序获得测序数据，使用常规市 售试剂盒，按说明书具体步骤进行操作。步骤如下：
1、核糖核酸提取与纯化。
2、基因组DNA去除。
3、文库构建。
3.1 RNA片段化及人rRNA去除。
3.2 cDNA一链合成。
3.3 cDNA二链合成。
3.4接头连接及纯化。
3.5 PCR扩增及纯化。
3.6文库质检。
用Qubit 4.0Fluorometer及Qubit dsDNA HS Assay Kit检测文库浓度。
3.7文库混合与变性。
4、上机测序。
使用NextSeq 550Dx测序仪进行测序。
三、数据分析。
1、低质量序列过滤。
使用fastp软件过滤低质量和接头序列。过滤条件：一条序列质量值小于Q15的碱基的 占比大于40％，序列N碱基个数大于1，序列长度小于40，序列复杂度小于30％均被过滤， 复杂度的定义为非连续相同碱基数的占比，即如果一条序列里面，连续的相同碱基比例大于 70％则被过滤。
2、宿主序列过滤。
使用bwa软件mem模块将上述过滤后测序数据，比对到宿主库中，得到sam格式的比对结果文件，即得到过滤宿主后的序列。
上述宿主库来源于RefSeq和Genbank等公共数据库，通过网站下载GRCh38等包含宿主 核酸的基因组文件，去冗余后合并为全面的宿主核酸基因组，用于比对过滤。
3、去除质粒和rRNA
使用bwa软件mem模块对上述过滤宿主后的序列，分别比对到细菌和人的rRNA、细菌 和人的质粒数据库中，并得到去除rRNA和质粒后的序列。
上述rRNA、质粒数据库来源于NCBI的RefSeq和Genbank等公共数据库，通过网站下载，去冗余合并为完整rRNA、质粒核酸库。
4、细菌数据库比对
使用bwa软件mem模块将上述过滤rRNA和质粒后的序列比对到细菌数据库中，得到比 对结果文件。统计唯一比对到菌种上的特异序列，序列总数记为该菌种的readcount值。
上述细菌基因组来源于NCBI的RefSeq和Genbank等公共数据库。
5、样本聚类分析
根据比对上的微生物种类，以样本中检出的呼吸道微生态种类和丰度进行聚类分析。
1)微生物菌种丰度计算方法：
对样本的菌种readcount值进行标准化(DESeq2标准化方法：计算归一化系数，序列数 除以归一化系数即为菌种标准化后的相对丰度)得到相对丰度。
2)聚类分析方法：
基于微生物种类和相对丰度计算各个样本间的bray_curtis距离，计算样本间的细菌组成 差异并进行主坐标轴分析(PCoA)。
PCoA，principal co-ordinates analysis，是一种研究数据相似性或差异性的可视化方法， 通过一系列的特征值和特征向量进行排序后，选择主要排在前几位的特征值，找到距离矩阵 中最主要的坐标，PCoA分析的结果是数据矩阵的一个旋转，其没有改变样品点之间的相互 位置关系，只是改变了坐标系统。可通过PCoA分析可以观察个体或群体间的差异。
聚类分析结果如图1所示，从结果中我们出乎意料的发现，微生态的种类和丰度可对 COVID-19肺炎样本与其他病原体感染肺炎样本进行很好的分类，说明COVID-19肺炎患者 的微生态组成与其他感染肺炎的微生态组成存在明显差异。
在上述研究基础上，我们对上述样本进行分类，分为COVID-19肺炎组和non-COVID-19 肺炎组，初步分析两组间菌种差异。
6、COVID-19肺炎组和non-COVID-19肺炎组的菌种差异分析
根据菌种相对丰度进行候选标志菌种筛选，筛选标准为：以non-COVID-19肺炎组(即 其他病原微生物感染肺炎组)为对照组，如COVID-19肺炎组菌种丰度上调，且Foldchange>2 则定义为上调菌种，如菌种丰度下调，且Foldchange＜0.5则定义为下调菌种，且菌种变化 满足FDR≤0.05。
通过上述差异分析的筛选，获得67种具有差异的初筛菌种作为候选菌种标志物，其中有 6个上调菌种，61个下调菌种。具体如下表：
表1.差异菌种筛选结果
注：P-Value表示Wald检验，检验差异显著性，FDR为BH方法对P-Value的多重检验矫正值；Fold change指差异倍数。
7、候选菌种标志物ROC分析
对候选标志物的功能验证方法主要为ROC分析。ROC(Receiver OperationCharacteristic) 分析是把灵敏度和特异度结合起来综合评价诊断准确度或判别效果的一种方法。使用R语言 中的Logistic Regression模型，计算候选菌种标志物对COVID-19肺炎和其他感染肺炎分类 的预测值，并使用该预测值绘制ROC(受试者工作特征)曲线，计算AUC值。
ROC曲线中，横坐标为假阳率(False positive rate，FPR)，即预测为阳性，但实际为阴性 的样本占所有阴性样本的比例；纵坐标为真阳率(True positive rate，TPR)，即预测为阳性且实 际为阳性的样本占所有阳性样本的比例。因此，ROC曲线越偏离45度对角线，表示区分灵 敏度和特异性效果越好，即曲线下面积AUC越接近1，效果越好。
将上述候选菌种标志物整体进行模型计算，结果如图2所示，得到AUC为0.809，说明 上述差异菌种对COVID-19肺炎与non-COVID-19肺炎组的分类有一定的可靠度。
实施例2
对实施例1得到的菌种标志物进行验证。
一、样品采集
根据实施例1的样本入组标准，采集30例已确诊COVID-19肺炎样本和30例 non-COVID-19肺炎组样本作为验证集，对实施例1的结果进行验证。
二、测序。
参照实施例1的高通量测序方法，检测60例样本并分析实验组和对照组各菌种的相对丰 度。
三、宿主标志物验证。
参照实施例1的差异分析方法，获得验证集中有差异菌种有31，取实施例1中训练集差 异菌种与本实施例验证集差异菌种交集，且上下调方向一致的18个菌种，作为最终的候选菌 种标志物。
表2.菌种标志物筛选结果
| 菌种名称 | P-Value | FDR | Lo2(Fold change) |
| Aggregatibacter_segnis | 0.002716738 | 0.041189256 | -3.810811251 |
| Alloprevotella_tannerae | 0.001265617 | 0.023780636 | -3.817815723 |
| Campylobacter_showae | 0.003399851 | 0.044386946 | -4.667353991 |
| Fusobacterium_hwasookii | 0.001315525 | 0.023780636 | -4.139240994 |
| Fusobacterium_nucleatum | 0.000537826 | 0.018055582 | -4.951794732 |
| Fusobacterium_periodonticum | 0.000894371 | 0.020016869 | -5.019757987 |
| Gemella_sanguinis | 0.000808839 | 0.020016869 | -4.682127973 |
| Haemophilus_parahaemolyticus | 0.000197715 | 0.011615733 | -6.366137313 |
| Haemophilus_parainfluenzae | 0.000519635 | 0.018055582 | -3.635019117 |
| Haemophilus_sputorum | 3.12E-05 | 0.004886593 | -7.823944276 |
| Porphyromonas_gingivalis | 1.40E-05 | 0.003300893 | -5.877449378 |
| Prevotella_intermedia | 0.000390556 | 0.01529677 | -4.379586386 |
| Prevotella_multiformis | 9.65E-05 | 0.007561098 | -6.645933162 |
| Prevotella_nanceiensis | 1.18E-07 | 5.54E-05 | -6.961019486 |
| Prevotella_nigrescens | 0.000974162 | 0.020811637 | -5.381729756 |
| Prevotella_timonensis | 0.001148838 | 0.023476257 | -2.743454942 |
| Propionibacterium_humerusii | 0.001258502 | 0.023780636 | -1.082820347 |
| Veillonella_atypica | 0.000749859 | 0.020016869 | -4.646543908 |
注：上述结果中出现的“E”为科学计数法，如“1.05E-05”为1.05×10-5。
四、菌种标志物ROC
使用R语言中的pROC程序包分析COVID-19肺炎分类的预测值，并使用该预测值绘制 ROC曲线，计算ROC曲线下面积AUC。
将上述候选菌种整体进行模型计算，结果如图3所示，得到AUC为0.871，说明训练集 和验证集差异菌种的交集作为候选菌种集，可以提高候选菌种对COVID-19肺炎诊断的可靠 度。
实施例4
菌种标志物可行性筛选。
一、样本收集。
根据实施例1的样本入组标准，收集包括COVID-19肺炎和non-COVID-19肺炎样本，共计1000例，对1000例样本进行宏转录组检测，分析18个候选标志物的检出稳定性。
二、检出率分析。
统计样本中18个候选菌种的检出率，如下表所示。
表3.候选菌种标志物的检出率
上述18个菌种的联合检出率大于0.95(即95％)，其中个别菌种检出小于0.5，是由不 同个体的恒定菌群不同引起的。
其中，Haemophilus_parainfluenzae(副流感嗜血杆菌，菌种1)，Propionibacterium_ humerusii(丙酸杆菌，菌种2)，Veillonella_atypica(非典型韦荣球菌，菌种3)的单个菌种检出率 大于0.7，联合检出大于0.92。
上述Haemophilus_parainfluenzae为革兰阴性杆菌，是人类呼吸道的正常菌群，条件致病 菌，可以引起心内膜炎、肾炎、泌尿生殖道炎、胆道感染和腹膜炎等多种疾病，近年在下呼 吸道感染患者中的分离率有逐年上升的趋势，可引起肺炎、支气管炎等下呼吸道感染。 Propionibacterium_humerusi为革兰氏阳性菌，属于丙酸杆菌属菌种。Veillonella_atypica菌为 革兰氏阴性菌，厌氧球菌，人类口腔菌群的一部分，存在于牙菌斑生物膜中。
上述三种菌种均为人体中普遍存在细菌，可通过该菌种的相对丰度变化(均为下调)， 提示是否存在SARS-CoV-2感染，从而为COVID-19肺炎提供辅助诊断。
三、ROC分析。
对3个菌种检出值计算组合ROC，考察其作为助判断SARS-CoV-2感染标志物的性能。
表4.菌种优选标志物ROC的AUC
| ID | AUC |
| 菌种1 | 0.789377289 |
| 菌种2 | 0.833333333 |
| 菌种3 | 0.84981685 |
| 菌种1+菌种2 | 0.857142857 |
| 菌种1+菌种3 | 0.860805861 |
| 菌种2+菌种3 | 0.904761905 |
| 菌种1+菌种2+菌种3 | 0.91025641 |
将上述菌种进行组合后发现，不同的菌种组合有不同AUC值，组合的菌种越多，AUC值越高，SARS-CoV-2感染分类越显著，其中图4-图10依次为菌种1的ROC、菌种2的ROC、 菌种3的ROC、菌种1+2的ROC、菌种1+3的ROC、菌种2+3的ROC、菌种1+2+3的ROC， 上述结果说明以上述3个菌种检出值差异整体作为BioMarker使用，对SARS-CoV-2感染与 否的分类有较高的可靠度。
实施例5
对实施例4得到的宿主优选菌种标志物集进行确认。
一、样品采集。
取24例临床诊断为疑似COVID-19肺炎临床样本，12例样本类型为痰液，12例样本类 型为鼻咽拭子。
二、测序。
参照实施例1的宏转录组测序方法，检测24例样本并分析3个优选菌种标志物的检测值， 进行差异化分析时，将待测样本数据与实施例1和2中的阴性为对照组进行比较。
采用市售COVID-19RT-PCR和NGS检测试剂盒对样本进行检测，按照使用说明书对检 测结果进行判断。
三、分析
按照实施例1的方法，对上述两组样本中Haemophilus_parainfluenzae(菌种1)，Propionibacterium_humerusi(菌种2)，Veillonella_atypica(菌种3)的检出值进行分析，结 果如下表所示。
表5.临床样本检测结果
结果如图11所示，图中，每一行表示一例病例，由左至右的每一列依次表示PCR检测， NGS检测和菌种标志物分析，核酸检测(PCR检测，NGS检测)阳性为黑色，阴性为白色。菌种标志物检测阳性为灰色。
上述结果显示，有3例样本在NGS检测中显示阴性而PCR检测阳性，核酸结果不一致， 采用本发明的菌种标志物模型可提示阳性；有12例样本在NGS检测中显示阳性而PCR检测 阴性，核酸结果不一致，采用本发明的菌种标志物模型可提示阳性。
经上述验证，本发明的菌种标志物Haemophilus_parainfluenzae副流感嗜血杆菌、 Propionibacterium_humerusi丙酸杆菌、Veillonella_atypica非典型韦荣球菌，可在一定程度上 弥补病毒核酸检验假阴性的缺陷，提高对COVID-19的诊断能力。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中 的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾， 都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因 此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不 脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因 此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种辅助COVID-19诊断的菌种标志物，其特征在于，包括：Haemophilus_parainfluenzae副流感嗜血杆菌、Propionibacterium_humerusii丙酸杆菌、Veillonella_atypica非典型韦荣球菌、Aggregatibacter_segnis惰性凝聚杆菌、Alloprevotella_tannerae坦纳拟普雷沃菌、Campylobacter_showae昭和弯曲菌、Fusobacterium_hwasookii梭杆菌、Fusobacterium_nucleatum具核梭杆菌、Fusobacterium_periodonticum牙周梭杆菌、Gemella_sanguinis血孪生球菌、Haemophilus_parahaemolyticus副溶血嗜血杆菌、Haemophilus_sputorum唾液嗜血杆菌、Porphyromonas_gingivalis牙龈卟啉单胞菌、Prevotella_intermedia中间普氏菌、Prevotella_multiformis普氏菌、Prevotella_nanceiensis普氏菌、Prevotella_nigrescens变黑普氏菌和Prevotella_timonensis普氏菌中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的辅助COVID-19诊断的菌种标志物，其特征在于，包括Haemophilus_parainfluenzae副流感嗜血杆菌、Propionibacterium_humerusi丙酸杆菌、Veillonella_atypica非典型韦荣球菌中的至少一种。
3.一种权利要求1或2所述的菌种标志物在制备COVID-19辅助诊断检测试剂或检测设备中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，对所述菌种标志物的应用为：检测得到生物样本中所述菌种标志物的相对丰度，与预设判定值进行对比，得出检测结果。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述菌种标志物的相对丰度通过基因检测和/或MALDI-TOF质谱检测得到。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述菌种标志物的相对丰度通过以下方法获得：分离提取生物样本中核酸，构建文库，进行测序，对测序数据进行生物信息学分析，得出所述菌种标志物的序列数，对序列数进行标准化得到菌种的相对丰度。
7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述预设判定值通过以下方法得到：分别获取COVID-19肺炎组及其它病原微生物感染肺炎组样本数据，根据两组样本数据进行差异化分析，以各菌种相对丰度差异倍数绝对值为2倍以上为预设判定值。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述差异化分析时，限定FDR<0.05。
9.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述检测试剂用于痰液、鼻咽拭子、咽拭子、肺泡灌洗液样本的检测。
10.一种COVID-19辅助检测试剂盒，其特征在于，包括检测权利要求1或2所述的菌种标志物的试剂。
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