CN111378615A - 一种促进间充质干细胞成骨分化的培养基 - Google Patents

一种促进间充质干细胞成骨分化的培养基 Download PDF

Info

Publication number
CN111378615A
CN111378615A CN202010217192.7A CN202010217192A CN111378615A CN 111378615 A CN111378615 A CN 111378615A CN 202010217192 A CN202010217192 A CN 202010217192A CN 111378615 A CN111378615 A CN 111378615A
Authority
CN
China
Prior art keywords
mass
parts
culture medium
stem cells
ferric oxide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
CN202010217192.7A
Other languages
English (en)
Inventor
陈忠平
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Lancy Purcell Biotechnology Guangzhou Co ltd
Original Assignee
Lancy Purcell Biotechnology Guangzhou Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Lancy Purcell Biotechnology Guangzhou Co ltd filed Critical Lancy Purcell Biotechnology Guangzhou Co ltd
Priority to CN202010217192.7A priority Critical patent/CN111378615A/zh
Publication of CN111378615A publication Critical patent/CN111378615A/zh
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0654—Osteocytes, Osteoblasts, Odontocytes; Bones, Teeth
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/20—Transition metals
    • C12N2500/24—Iron; Fe chelators; Transferrin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/20—Transition metals
    • C12N2500/24—Iron; Fe chelators; Transferrin
    • C12N2500/25—Insulin-transferrin; Insulin-transferrin-selenium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/32—Amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/32—Amino acids
    • C12N2500/33—Amino acids other than alpha-amino carboxylic acids, e.g. beta-amino acids, taurine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/44—Thiols, e.g. mercaptoethanol
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/155—Bone morphogenic proteins [BMP]; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone inducing factor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/305—Growth hormone [GH], aka. somatotropin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/998—Proteins not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
    • C12N2506/1346—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)

Abstract

本发明涉及干细胞领域，提供一种促进间充质干细胞成骨分化的培养基，用于解决干细胞向骨细胞分化效率低的问题。本发明提供的一种促进间充质干细胞成骨分化的培养基，包括胰岛素8~12μg/ml，转铁蛋白0.05~0.2μg/ml，BMP‑4 0.05~0.2ng/ml，FGF‑2 5~8ng/ml，生长激素1~3ng/ml、谷胱甘肽100~150μg/ml、L‑谷氨酰胺1~3mM，β‑巯基乙醇40~50μM，丙酮酸钠1~3mM，非必须氨基酸0.05~0.15mM，纳米三氧化二铁2~10μM，余量为DMEM培养基。培养基中未加入生物血清，同时引入了纳米氧化物，可以显著的促进间充质干细胞向骨细胞分化。

Description

一种促进间充质干细胞成骨分化的培养基
技术领域
本发明涉及技术领域，具体涉及一种促进间充质干细胞成骨分化的培养基。
背景技术
干细胞是一类具有自我更新能力和多向分化潜能的细胞类型，它是人体新 生细胞从增殖、迁移、分化直至达到成熟这一系列过程中的第一个细胞。关于 干细胞的研究已成为目前生物学上最具挑战性、也最具有吸引力的领域之一。 干细胞按其来源可分为胚胎干细胞和成体干细胞。而间充质干细胞(MSCs， mesenehymal stem cells)就是成体干细胞的其中一种。作为一类具有自我更新 能力的成体干细胞，间充质干细胞可以向多种细胞组织类型分化。它不仅可以 向多种间质来源的细胞谱系分化，例如脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、肌键 细胞等等，也可以向其他的细胞谱系分化，比如星形胶质细胞、肌原细胞、心 肌细胞以及神经细胞等。由于体外分离培养的MSCs在细胞表型上没有明显的 改变，也无功能缺失，因此被认为其对于细胞疗法和组织修复工程具有重要的 意义。
磁性材料是一种古老而用途广泛的功能材料。1960年Freeman等提出铁 磁性粒子可以通过血液循环系统和外界磁场的协同作用下到达身体的某一特 定组织。磁性纳米颗粒是包被葡聚糖等不同生物大分子衣的纳米级氧化铁胶体 溶液，具有高热稳定性、低毒性和超顺磁性。因其独特的超顺磁性质和纳米特 性已经被越来越多的应用于生物医学和生物科技的研究中，包括靶向给药、肿 瘤磁过热疗法、生物传感器以及特异性靶点(如细菌、白细胞、蛋白质)的浓 度示踪等，具有广阔的应用前景和潜在的应用价值。
干细胞移植治疗各类疾病成为当今医学研究的热点，但移植后如何从受 体辨别供体细胞，并观察其在活体内的生存迁徙情况一直是困扰其临床应用的 瓶颈。随着分子影像学的发展，超顺磁性纳米铁颗粒(SPIO)作为磁共振成 像(MRI)分子探针可以标记骨髓间充质干细胞、神经干细胞、心肌细胞、造 血细胞等，并能活体监测细胞的迁徙，代谢和生物学行为。
发明内容
本发明解决的技术问题为解决技术问题，提供一种促进间充质干细胞成骨分化的培养基。
为了解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：
一种促进间充质干细胞成骨分化的培养基，包括胰岛素8~12μg/ml，转铁蛋白0.05~0.2μg/ml，BMP-4 0.05~0.2ng/ml，FGF-2 5~8ng/ml，生长激素1~3ng/ml、谷胱甘肽100~150μg/ml、L-谷氨酰胺 1~3mM，β-巯基乙醇40~50μM，丙酮酸钠1~3mM，非必须氨基酸0.05~0.15mM，纳米三氧化二铁2~10μM，余量为DMEM培养基。
将纳米三氧化二铁引入干细胞的培养基中，可以在一定程度上促进干细胞向骨细胞分化。
培养基中未加入生物血清，同时引入了纳米氧化物，可以显著的促进间充质干细胞向骨细胞分化。
优选地，包括胰岛素10~12μg/ml，转铁蛋白0.08~0.2μg/ml，BMP-4 0.1~0.2ng/ml，FGF-2 6~8ng/ml，生长激素2~3ng/ml、谷胱甘肽120~150μg/ml、L-谷氨酰胺 2~3mM，β-巯基乙醇45~50μM，丙酮酸钠2~3mM，非必须氨基酸0.1~0.15mM，纳米三氧化二铁5~10μM，余量为DMEM培养基。
优选地，包括胰岛素10μg/ml，转铁蛋白0.08μg/ml，BMP-4 0.1ng/ml，FGF-2 6ng/ml，生长激素2ng/ml、谷胱甘肽120μg/ml、L-谷氨酰胺 2mM，β-巯基乙醇45μM，丙酮酸钠2mM，非必须氨基酸0.1mM，纳米三氧化二铁5μM，余量为DMEM培养基。
优选地，所述纳米三氧化二铁为改性纳米三氧化二铁。改性的三氧化二铁可以更进一步的促进干细胞向骨细胞分化。
优选地，所述改性三氧化二铁的制备方法为：取纳米三氧化二铁10~15质量份，正硅酸乙酯20~30质量份，聚偏氟乙烯30~40质量份，三氯化钌0.3~0.5质量份，亚硒酸钠0.1~0.3质量份，硫普罗宁5~8质量份；将纳米三氧化二铁分散于40倍量的无水乙醇中，加入正硅酸乙酯，超声1~2h，升温至60℃，调节pH为碱性，保温反应12h，过滤，取滤渣干燥，得到第一产物；将第一产物同聚偏氟乙烯混合后溶于N-甲基吡咯烷酮，反应20h后真空干燥，得到的第二产物；将第二产物在氩气气氛中煅烧，煅烧温度为400~500℃，煅烧2h后加入碱液中，浸泡10~30min，分离固体产物，干燥，得到第三产物；将第三产物分散到100倍量的去离子水中，高速搅拌下同时滴加三氯化钌和亚亚硒酸钠，滴加结束后，缓慢搅拌，加入硫普罗宁，超声2h，分离、洗涤、干燥得到改性纳米三氧化二铁。加入钌和硒，同时对纳米三氧化二铁的微观结构进行了调整，使得纳米三氧化二铁在较少的钌和硒的修饰下，具有一定的超顺磁性，可以更进一步的促进干细胞向骨细胞分化。
优选地，所述纳米三氧化二铁12~15质量份，正硅酸乙酯24~30质量份，聚偏氟乙烯36~40质量份，三氯化钌0.4~0.5质量份，亚硒酸钠0.2~0.3质量份，硫普罗宁6~8质量份。
优选地，所述纳米三氧化二铁12质量份，正硅酸乙酯24质量份，聚偏氟乙烯36质量份，三氯化钌0.4质量份，亚硒酸钠0.2质量份，硫普罗宁6质量份。
优选地，所述纳米三氧化二铁的制备方法为：取硝酸铁15~25质量份，蔗糖40~60质量份，钛酸四丁酯1~5质量份；将蔗糖溶于20倍量的去离子水中，加入到水热反应釜中，在180~200℃下进行水热反应2~10h，产物用去离子水和乙醇洗涤，80℃下烘干，得到均一的碳球；将硝酸铁溶解于3倍量的乙醇中，加入碳球，超声分散，再加入钛酸四丁酯，搅拌12~24h，反应结束后，将产物用去离子水和乙醇洗涤，100℃下干燥，得到中间产物；将中间产物在空气气氛中焙烧12~24h，焙烧温度为500~600℃。用于改性的纳米三氧化二铁先经过钛改性，使得纳米三氧化二铁可以更好促进干细胞向骨细胞分化。
优选地，所述硝酸铁20~25质量份，蔗糖50~60质量份，钛酸四丁酯2~5质量份。
优选地，所述硝酸铁20质量份，蔗糖50质量份，钛酸四丁酯2质量份。
与现有技术相比，本发明具有的有益效果为：培养基中未加入生物血清，同时引入了纳米氧化物，可以显著的促进间充质干细胞向骨细胞分化；可以大幅的提高干细胞成骨分化的效率。
具体实施方式
以下实施列是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。
实施例1
一种促进间充质干细胞成骨分化的培养基，包括胰岛素10μg/ml，转铁蛋白0.08μg/ml，BMP-4 0.1ng/ml，FGF-2 6ng/ml，生长激素2ng/ml、谷胱甘肽120μg/ml、L-谷氨酰胺 2mM，β-巯基乙醇45μM，丙酮酸钠2mM，非必须氨基酸0.1mM，纳米三氧化二铁5μM，余量为DMEM培养基。所述纳米三氧化二铁为改性纳米三氧化二铁。所述改性三氧化二铁的制备方法为： 取纳米三氧化二铁12质量份，正硅酸乙酯24质量份，聚偏氟乙烯36质量份，三氯化钌0.4质量份，亚硒酸钠0.2质量份，硫普罗宁6质量份；将纳米三氧化二铁分散于40倍量的无水乙醇中，加入正硅酸乙酯，超声1.5h，升温至60℃，调节pH为碱性，保温反应12h，过滤，取滤渣干燥，得到第一产物；将第一产物同聚偏氟乙烯混合后溶于N-甲基吡咯烷酮，反应20h后真空干燥，得到的第二产物；将第二产物在氩气气氛中煅烧，煅烧温度为450℃，煅烧2h后加入碱液中，浸泡20min，分离固体产物，干燥，得到第三产物；将第三产物分散到100倍量的去离子水中，高速搅拌下同时滴加三氯化钌和亚亚硒酸钠，滴加结束后，缓慢搅拌，加入硫普罗宁，超声2h，分离、洗涤、干燥得到改性纳米三氧化二铁。所述纳米三氧化二铁的制备方法为：取硝酸铁20质量份，蔗糖50质量份，钛酸四丁酯2质量份。；将蔗糖溶于20倍量的去离子水中，加入到水热反应釜中，在180~200℃下进行水热反应8h，产物用去离子水和乙醇洗涤，80℃下烘干，得到均一的碳球；将硝酸铁溶解于3倍量的乙醇中，加入碳球，超声分散，再加入钛酸四丁酯，搅拌18h，反应结束后，将产物用去离子水和乙醇洗涤，100℃下干燥，得到中间产物；将中间产物在空气气氛中焙烧16h，焙烧温度为550℃。
将纳米三氧化二铁引入干细胞的培养基中，可以在一定程度上促进干细胞向骨细胞分化。培养基中未加入生物血清，同时引入了纳米氧化物，可以显著的促进间充质干细胞向骨细胞分化。改性的三氧化二铁可以更进一步的促进干细胞向骨细胞分化。加入钌和硒，同时对纳米三氧化二铁的微观结构进行了调整，使得纳米三氧化二铁在较少的钌和硒的修饰下，具有一定的超顺磁性，可以更进一步的促进干细胞向骨细胞分化。用于改性的纳米三氧化二铁先经过钛改性，使得纳米三氧化二铁可以更好促进干细胞向骨细胞分化。
实施例2
一种促进间充质干细胞成骨分化的培养基， 包括胰岛素8μg/ml，转铁蛋白0.05μg/ml，BMP-4 0.05ng/ml，FGF-2 5ng/ml，生长激素1ng/ml、谷胱甘肽100μg/ml、L-谷氨酰胺 1mM，β-巯基乙醇40μM，丙酮酸钠1mM，非必须氨基酸0.05mM，纳米三氧化二铁2μM，余量为DMEM培养基。所述纳米三氧化二铁为改性纳米三氧化二铁。所述改性三氧化二铁的制备方法为：取纳米三氧化二铁10质量份，正硅酸乙酯20质量份，聚偏氟乙烯30质量份，三氯化钌0.3质量份，亚硒酸钠0.1质量份，硫普罗宁5质量份将纳米三氧化二铁分散于40倍量的无水乙醇中，加入正硅酸乙酯，超声1h，升温至60℃，调节pH为碱性，保温反应12h，过滤，取滤渣干燥，得到第一产物；将第一产物同聚偏氟乙烯混合后溶于N-甲基吡咯烷酮，反应20h后真空干燥，得到的第二产物；将第二产物在氩气气氛中煅烧，煅烧温度为400℃，煅烧2h后加入碱液中，浸泡10min，分离固体产物，干燥，得到第三产物；将第三产物分散到100倍量的去离子水中，高速搅拌下同时滴加三氯化钌和亚亚硒酸钠，滴加结束后，缓慢搅拌，加入硫普罗宁，超声2h，分离、洗涤、干燥得到改性纳米三氧化二铁。所述纳米三氧化二铁的制备方法为：取硝酸铁15质量份，蔗糖40质量份，钛酸四丁酯1质量份；将蔗糖溶于20倍量的去离子水中，加入到水热反应釜中，在180~200℃下进行水热反应2h，产物用去离子水和乙醇洗涤，80℃下烘干，得到均一的碳球；将硝酸铁溶解于3倍量的乙醇中，加入碳球，超声分散，再加入钛酸四丁酯，搅拌12h，反应结束后，将产物用去离子水和乙醇洗涤，100℃下干燥，得到中间产物；将中间产物在空气气氛中焙烧12h，焙烧温度为500℃。
实施例3
一种促进间充质干细胞成骨分化的培养基，包括胰岛素12μg/ml，转铁蛋白0.2μg/ml，BMP-4 0.2ng/ml，FGF-2 8ng/ml，生长激素3ng/ml、谷胱甘肽150μg/ml、L-谷氨酰胺 3mM，β-巯基乙醇50μM，丙酮酸钠3mM，非必须氨基酸0.15mM，纳米三氧化二铁10μM，余量为DMEM培养基。所述纳米三氧化二铁为改性纳米三氧化二铁。所述改性三氧化二铁的制备方法为：取纳米三氧化二铁15质量份，正硅酸乙酯30质量份，聚偏氟乙烯40质量份，三氯化钌0.5质量份，亚硒酸钠0.3质量份，硫普罗宁8质量份；将纳米三氧化二铁分散于40倍量的无水乙醇中，加入正硅酸乙酯，超声2h，升温至60℃，调节pH为碱性，保温反应12h，过滤，取滤渣干燥，得到第一产物；将第一产物同聚偏氟乙烯混合后溶于N-甲基吡咯烷酮，反应20h后真空干燥，得到的第二产物；将第二产物在氩气气氛中煅烧，煅烧温度为500℃，煅烧2h后加入碱液中，浸泡30min，分离固体产物，干燥，得到第三产物；将第三产物分散到100倍量的去离子水中，高速搅拌下同时滴加三氯化钌和亚亚硒酸钠，滴加结束后，缓慢搅拌，加入硫普罗宁，超声2h，分离、洗涤、干燥得到改性纳米三氧化二铁。所述纳米三氧化二铁的制备方法为：取硝酸铁25质量份，蔗糖60质量份，钛酸四丁酯5质量；将蔗糖溶于20倍量的去离子水中，加入到水热反应釜中，在180~200℃下进行水热反应10h，产物用去离子水和乙醇洗涤，80℃下烘干，得到均一的碳球；将硝酸铁溶解于3倍量的乙醇中，加入碳球，超声分散，再加入钛酸四丁酯，搅拌24h，反应结束后，将产物用去离子水和乙醇洗涤，100℃下干燥，得到中间产物；将中间产物在空气气氛中焙烧24h，焙烧温度为600℃。
实施例4
实施例4同实施例1不同之处在于，所述纳米三氧化二铁未改性，且该纳米三氧化二铁为市售纳米三氧化二铁，未经钛修饰。
实施例5
一种促进间充质干细胞成骨分化的培养基，包括胰岛素10μg/ml，转铁蛋白0.08μg/ml，BMP-4 0.1ng/ml，FGF-2 6ng/ml，生长激素2ng/ml、谷胱甘肽120μg/ml、L-谷氨酰胺 2mM，β-巯基乙醇45μM，丙酮酸钠2mM，非必须氨基酸0.1mM，纳米三氧化二铁5μM，余量为DMEM培养基。所述纳米三氧化二铁为改性纳米三氧化二铁。所述改性三氧化二铁的制备方法为：取纳米三氧化二铁12质量份，正硅酸乙酯24质量份，聚偏氟乙烯36质量份，三氯化钌0.4质量份，亚硒酸钠0.2质量份，硫普罗宁6质量份；将纳米三氧化二铁分散于40倍量的无水乙醇中，加入正硅酸乙酯，超声1.5h，升温至60℃，调节pH为碱性，保温反应12h，过滤，取滤渣干燥，得到第一产物；将第一产物同聚偏氟乙烯混合后溶于N-甲基吡咯烷酮，反应20h后真空干燥，得到的第二产物；将第二产物在氩气气氛中煅烧，煅烧温度为450℃，煅烧2h后加入碱液中，浸泡20min，分离固体产物，干燥，得到第三产物； 将第三产物分散到100倍量的去离子水中，高速搅拌下同时滴加三氯化钌和亚亚硒酸钠，滴加结束后，缓慢搅拌，加入硫普罗宁，超声2h，分离、洗涤、干燥得到改性纳米三氧化二铁。
实施例6
一种促进间充质干细胞成骨分化的培养基，包括胰岛素10μg/ml，转铁蛋白0.08μg/ml，BMP-4 0.1ng/ml，FGF-2 6ng/ml，生长激素2ng/ml、谷胱甘肽120μg/ml、L-谷氨酰胺 2mM，β-巯基乙醇45μM，丙酮酸钠2mM，非必须氨基酸0.1mM，纳米三氧化二铁5μM，余量为DMEM培养基。所述纳米三氧化二铁的制备方法为：取硝酸铁20质量份，蔗糖50质量份，钛酸四丁酯2质量份。；将蔗糖溶于20倍量的去离子水中，加入到水热反应釜中，在180~200℃下进行水热反应8h，产物用去离子水和乙醇洗涤，80℃下烘干，得到均一的碳球；将硝酸铁溶解于3倍量的乙醇中，加入碳球，超声分散，再加入钛酸四丁酯，搅拌18h，反应结束后，将产物用去离子水和乙醇洗涤，100℃下干燥，得到中间产物；将中间产物在空气气氛中焙烧16h，焙烧温度为550℃。
对比例1
对比例1同实施例1不同之处在于，包括胰岛素10μg/ml，转铁蛋白0.08μg/ml，BMP-40.1ng/ml，FGF-2 6ng/ml，生长激素2ng/ml、谷胱甘肽120μg/ml、L-谷氨酰胺 2mM，β-巯基乙醇45μM，丙酮酸钠2mM，非必须氨基酸0.1mM，余量为DMEM培养基。
对比例2
对比例2同实施例1不同之处在于，包括胰岛素6μg/ml，转铁蛋白0.03μg/ml，BMP-40.04ng/ml，FGF-2 3ng/ml，生长激素0.5ng/ml、谷胱甘肽80μg/ml、L-谷氨酰胺 0.5mM，β-巯基乙醇30μM，丙酮酸钠0.5mM，非必须氨基酸0.03mM，纳米三氧化二铁1μM，余量为DMEM培养基。
对比例3
对比例3同实施例1不同之处在于，包括胰岛素15μg/ml，转铁蛋白0.3μg/ml，BMP-40.3ng/ml，FGF-2 10ng/ml，生长激素5ng/ml、谷胱甘肽160μg/ml、L-谷氨酰胺 5mM，β-巯基乙醇60μM，丙酮酸钠5mM，非必须氨基酸0.2mM，纳米三氧化二铁15μM，余量为DMEM培养基。
对比例4
对比例4同实施例1不同之处在于，包括胰岛素10μg/ml，转铁蛋白0.08μg/ml，BMP-40.1ng/ml，FGF-2 6ng/ml，生长激素2ng/ml、谷胱甘肽120μg/ml、L-谷氨酰胺 2mM，β-巯基乙醇45μM，丙酮酸钠2mM，非必须氨基酸0.1mM，褪黑素5μM，细胞外基质10μg/ml，余量为DMEM培养基。
实验例
细胞外基质的钙沉积采用0.5%茜草素红液进行染色1小时，PBS洗涤后采用500ul1%氯化氢孵育，采用多功能酶标仪在420nm处检测吸光值分析成骨分化细胞外基质钙沉积量结果，进而分析培养基对成果分化的效果。如表1所示。
表1 成骨分化率
Figure 915548DEST_PATH_IMAGE001
实施例1~6在对比例1的基础上，增值率增加了12.5~89.2%，表明在培养基中引入了纳米三氧化二铁可以显著地提高干细胞的分化效率，为干细胞的大规模成骨分化提供了条件。
实施例1~3中的干细胞分化效果较为显著，表明经过改性和钛修饰的纳米三氧化二铁可以有效促进干细胞分化，实施例1的干细胞分化效果明显优于实施例2和3，表明添加一定量的纳米三氧化二铁可以进一步提高干细胞的分化率。
实施例4中的纳米三氧化二铁未改性也未经钛修饰，其分化率有一定的提高，但提升的效果弱于实施例1~3，表明钛修饰和改性的三氧化二铁可以更进一步的提高干细胞的分化率。
实施例5中采用未经钛修饰的改性纳米三氧化二铁，其效果弱于实施例1；实施例6中纳米三氧化二铁经过改性但未经钛修饰，其效果也弱于实施例1，表明只有用一定的方法改性和钛修饰的纳米三氧化二铁才能促进干细胞向骨细胞分化。
对比例1中未加入纳米三氧化二铁，对比例2和3中的纳米层状双氢氧化物的添加量同实施列1~3有较大的区别，对比例2和3促进干细胞增殖的效果同对比例1相比无明显变换，表明只有一定添加量的纳米层状双氢氧化物才能促进干细胞的分化。
对比例4是现有的促进干细胞分化为骨细胞的方式，从表1可知，其效果弱于经过含有改性和钛修饰的纳米三氧化二铁的培养基的分化效果。表明本申请可以在现有技术的基础上显著的促进干细胞向骨细胞分化。
上列详细说明是针对本发明可行实施例的具体说明，以上实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本案的专利范围中。

Claims (10)

1.一种促进间充质干细胞成骨分化的培养基，其特征在于，包括胰岛素8~12μg/ml，转铁蛋白0.05~0.2μg/ml，BMP-4 0.05~0.2ng/ml，FGF-2 5~8ng/ml，生长激素1~3ng/ml、谷胱甘肽100~150μg/ml、L-谷氨酰胺 1~3mM，β-巯基乙醇40~50μM，丙酮酸钠1~3mM，非必须氨基酸0.05~0.15mM，纳米三氧化二铁2~10μM，余量为DMEM培养基。
2.根据权利要求1所述的一种促进间充质干细胞成骨分化的培养基，其特征在于，包括胰岛素10~12μg/ml，转铁蛋白0.08~0.2μg/ml，BMP-4 0.1~0.2ng/ml，FGF-2 6~8ng/ml，生长激素2~3ng/ml、谷胱甘肽120~150μg/ml、L-谷氨酰胺 2~3mM，β-巯基乙醇45~50μM，丙酮酸钠2~3mM，非必须氨基酸0.1~0.15mM，纳米三氧化二铁5~10μM，余量为DMEM培养基。
3.根据权利要求2所述的一种促进间充质干细胞成骨分化的培养基，其特征在于，包括胰岛素10μg/ml，转铁蛋白0.08μg/ml，BMP-4 0.1ng/ml，FGF-2 6ng/ml，生长激素2ng/ml、谷胱甘肽120μg/ml、L-谷氨酰胺 2mM，β-巯基乙醇45μM，丙酮酸钠2mM，非必须氨基酸0.1mM，纳米三氧化二铁5μM，余量为DMEM培养基。
4.根据权利要求1所述的一种促进间充质干细胞成骨分化的培养基，其特征在于，所述纳米三氧化二铁为改性纳米三氧化二铁。
5.根据权利要求4所述的一种促进间充质干细胞成骨分化的培养基，其特征在于，所述改性三氧化二铁的制备方法为：取纳米三氧化二铁10~15质量份，正硅酸乙酯20~30质量份，聚偏氟乙烯30~40质量份，三氯化钌0.3~0.5质量份，亚硒酸钠0.1~0.3质量份，硫普罗宁5~8质量份；将纳米三氧化二铁分散于40倍量的无水乙醇中，加入正硅酸乙酯，超声1~2h，升温至60℃，调节pH为碱性，保温反应12h，过滤，取滤渣干燥，得到第一产物；将第一产物同聚偏氟乙烯混合后溶于N-甲基吡咯烷酮，反应20h后真空干燥，得到的第二产物；将第二产物在氩气气氛中煅烧，煅烧温度为400~500℃，煅烧2h后加入碱液中，浸泡10~30min，分离固体产物，干燥，得到第三产物；将第三产物分散到100倍量的去离子水中，高速搅拌下同时滴加三氯化钌和亚亚硒酸钠，滴加结束后，缓慢搅拌，加入硫普罗宁，超声2h，分离、洗涤、干燥得到改性纳米三氧化二铁。
6.根据权利要求5所述的一种促进间充质干细胞成骨分化的培养基，其特征在于，所述纳米三氧化二铁12~15质量份，正硅酸乙酯24~30质量份，聚偏氟乙烯36~40质量份，三氯化钌0.4~0.5质量份，亚硒酸钠0.2~0.3质量份，硫普罗宁6~8质量份。
7.根据权利要求5所述的一种促进间充质干细胞成骨分化的培养基，其特征在于，所述纳米三氧化二铁12质量份，正硅酸乙酯24质量份，聚偏氟乙烯36质量份，三氯化钌0.4质量份，亚硒酸钠0.2质量份，硫普罗宁6质量份。
8.根据权利要求5所述的一种促进间充质干细胞成骨分化的培养基，其特征在于，所述纳米三氧化二铁的制备方法为：取硝酸铁15~25质量份，蔗糖40~60质量份，钛酸四丁酯1~5质量份；将蔗糖溶于20倍量的去离子水中，加入到水热反应釜中，在180~200℃下进行水热反应2~10h，产物用去离子水和乙醇洗涤，80℃下烘干，得到均一的碳球；将硝酸铁溶解于3倍量的乙醇中，加入碳球，超声分散，再加入钛酸四丁酯，搅拌12~24h，反应结束后，将产物用去离子水和乙醇洗涤，100℃下干燥，得到中间产物；将中间产物在空气气氛中焙烧12~24h，焙烧温度为500~600℃。
9.根据权利要求8所述的一种促进间充质干细胞成骨分化的培养基，其特征在于，所述硝酸铁20~25质量份，蔗糖50~60质量份，钛酸四丁酯2~5质量份。
10.根据权利要求8所述的一种促进间充质干细胞成骨分化的培养基，其特征在于，所述硝酸铁20质量份，蔗糖50质量份，钛酸四丁酯2质量份。
CN202010217192.7A 2020-03-25 2020-03-25 一种促进间充质干细胞成骨分化的培养基 Withdrawn CN111378615A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010217192.7A CN111378615A (zh) 2020-03-25 2020-03-25 一种促进间充质干细胞成骨分化的培养基

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010217192.7A CN111378615A (zh) 2020-03-25 2020-03-25 一种促进间充质干细胞成骨分化的培养基

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111378615A true CN111378615A (zh) 2020-07-07

Family

ID=71219984

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010217192.7A Withdrawn CN111378615A (zh) 2020-03-25 2020-03-25 一种促进间充质干细胞成骨分化的培养基

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111378615A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106906182B (zh) 一种间充质干细胞无血清培养基
Kim et al. Osteoblastic/cementoblastic and neural differentiation of dental stem cells and their applications to tissue engineering and regenerative medicine
CN106754668B (zh) 一种干细胞培养液及注射液
CN106635978B (zh) 一种脐带间充质干细胞无血清培养基及其制备方法和用途
CN104805054B (zh) 干细胞无血清培养基
Lewicka et al. Recombinant spider silk matrices for neural stem cell cultures
CN103484432B (zh) 一种诱导神经干/祖细胞分化为少突胶质前体细胞的诱导培养基及其诱导方法和用途
CN102703385B (zh) 一种间充质干细胞培养液
JP2010538681A (ja) 人または動物胚から間葉系幹細胞を抽出及びその分泌物を抽出する方法
CN102985534A (zh) 用于体外大量扩增毛囊干细胞的培养方法
CN111073850B (zh) 一种促进间充质干细胞分化的培养基
CN112353950B (zh) 一种siRNA纳米递送系统的制备方法及其在前列腺癌中的应用
CN107432952B (zh) 三维石墨烯-胶原复合支架及其制备方法和应用
Azevedo-Pereira et al. Superparamagnetic iron oxide nanoparticles as a tool to track mouse neural stem cells in vivo
Ren et al. Hyaluronic acid/polylysine hydrogel as a transfer system for transplantation of neural stem cells
CN102533640B (zh) 使成体干细胞产生为球体细胞群体的方法
US8703487B2 (en) Compositions and methods for making and using bone marrow mesenchymal stem cells and erythroid progenitor cells
CN111378615A (zh) 一种促进间充质干细胞成骨分化的培养基
Pisciotta et al. PEDOT: PSS promotes neurogenic commitment of neural crest-derived stem cells
CN115636400B (zh) 二级结构一维多功能羟基磷灰石纳米带的制备方法及在组装功能干细胞球上的应用
CN105087475B (zh) 一种细胞培养液及其应用以及诱导牙髓干细胞向神经样细胞分化的方法
Yang et al. Rapid construction and enhanced vascularization of microtissue using a magnetic control method
CN112680408A (zh) 一种诱导人间充质干细胞成软骨分化培养基及其制备方法
CN116350800A (zh) 葡萄糖氧化酶-金属-姜黄素自组装纳米颗粒的制备与应用
CN114376985B (zh) 一种3d干细胞微球胶囊、其制备方法及在移植治疗领域的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB02 Change of applicant information

Address after: Building F2, 39 Ruihe Road, Huangpu District, Guangzhou City, Guangdong Province 510000

Applicant after: Lancy Purcell Biotechnology (Guangzhou) Co.,Ltd.

Address before: 510000 Room D09, 4th Floor, 131 Airport Road, Baiyun District, Guangzhou City, Guangdong Province

Applicant before: Lancy Purcell Biotechnology (Guangzhou) Co.,Ltd.

CB02 Change of applicant information
WW01 Invention patent application withdrawn after publication

Application publication date: 20200707

WW01 Invention patent application withdrawn after publication