CN111378012B - 与S.suis 2感染检测相关的合成肽及其应用 - Google Patents

与S.suis 2感染检测相关的合成肽及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了与S.suis 2感染有关的合成肽及其应用。一种与S.suis 2感染有关的合成肽，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述的合成肽作为包被抗原在制备S.suis 2感染快速辅助诊断试剂盒中应用。本发明提供了一种自行设计的合成肽，通过实验证实，该合成肽能够捕捉到S.suis 2感染后人体外周血中的特异性抗体，可以作为包被抗原应用在S.suis 2感染快速辅助诊断试剂盒中。本发明为S.suis 2的快速辅助诊断提供了新思路，可以降低由于S.suis 2感染诊断不及时造成的死亡，具备潜在的良好临床应用价值。

Description

与S.suis 2感染检测相关的合成肽及其应用
技术领域
本发明属于医学检测领域，涉及与S.suis 2感染有关的合成肽及其应用。
背景技术
2型猪链球菌(Streptococcus suis serotype 2，S.suis 2)属球菌科、链球菌属(Streptococci)，革兰阳性兼性厌氧菌，是一种重要的人兽共患传染病病原菌。S.suis 2不仅能够感染猪导致急性败血症、脑膜炎、心内膜炎和急性死亡，而且可以通过呼吸道和伤口等传播途径，导致人的感染发病和死亡。本病呈全球性分布，对相关从业人员的健康构成严重威胁，已确定为重要的新发传染病病原体。1998年和2005年分别在我国的江苏省和四川省暴发了大规模S.suis 2感染疫情，患者中出现高比例的、国内外罕见的链球菌中毒性休克综合征(Streptococcal toxic shock syndrome,STSS)。患者病程极为凶险，可出现心脏、肝功能损坏、血细胞破坏及造血系统抑制、脑膜炎、听神经损坏等多器官功能受损表现，多在发病1～3日内死亡[1-2]。作为一种新现人兽共患传染病病原，S.suis 2流行菌株表现出的高致病性和高病死率特征已经成为全世界关注的公共卫生的焦点[2-4]，而尽早行相应抗感染治疗可大大降低患者死亡率。迄今为止脑脊液和外周血培养仍然是判断人感染S.suis2的金标准，但血培养易受抗凝剂、抗菌药物、标本采集时间及培养方法等多因素影响，阳性率往往较低，所以建立可靠的检测方法对S.suis 2感染的对症治疗尤为重要。因此，研究S.suis 2的蛋白结构，筛选特异性肽段并建立快速诊断S.suis 2感染的方法，对感染早期的应急处置具有重要临床意义。
Sao蛋白(Surface antigen one)，是Li等在大规模搜寻与S.suis 2强致病性相关的功能蛋白的研究过程中发现蛋白[5]。它通过C端LPVTG基序锚定在细胞壁表面，具有高度的保守性[5]。免疫电镜实验证实Sao是一种广泛分布于菌体表面的蛋白，并且Sao蛋白特异性抗体可以和S.suis 2的多种分离株发生特异性反应[5]。表明Sao蛋白是在S.suis 2感染过程中表达的有效抗原。可见Sao蛋白具有成为S.suis 2感染筛选分子的巨大潜能。实验室前期工作表明，重组Sao蛋白纯化难度大，通过对Sao蛋白一级结构分析，Sao蛋白不稳定系数为42.24，高于阈值40，是不稳定蛋白。在实验过程中遇到了类似易降解问题：蛋白纯化过程中高浓度咪唑洗脱时仍出现蛋白杂带，系重组Sao蛋白降解所致(图1)。因此重组Sao蛋白保存时需加入4种蛋白酶抑制剂PMSF、Pepstantin、Leupeptin和Aprotinin，于4℃可稳定一周，-20℃可稳定6个月。这些因素阻碍了重组Sao蛋白作为检测标志物的进一步开发。
目前已报道的关于Sao蛋白的免疫学信息分析较少，基于Sao蛋白免疫优势表位的检测标志物研究未见报道。若能筛选到S.suis 2感染特异表达的优势表位，并研制相应的辅助诊断试剂盒，就能实现S.suis 2感染的快速辅助诊断，这将大幅度降低由于S.suis 2感染诊断不及时造成的死亡。
发明内容
本发明的首要目的是针对上述技术问题，提出一种与S.suis 2感染快速辅助诊断相关的基于Sao蛋白免疫优势表位的检测标志物。
本发明的第二个目的是提供上述Sao蛋白免疫优势表位在制备S.suis 2感染快速辅助诊断试剂盒中的应用。
本发明的第三个目的是提供用于S.suis 2感染快速辅助诊断试剂盒。
本发明的目的是通过下列技术方案实现的：
利用现有的网络资源和生物信息学工具，结合S.suis 2感染与Sao蛋白在菌体表面广泛分布的特点，尤其是Sao蛋白特异性抗体可以和S.suis 2的多种分离株发生特异性反应[5]这一重要理论，初步设计出10个肽段并合成。分别以10个合成肽为包被抗原，以Sao多抗血清(Anti-Sao)为一抗，通过间接ELISA法筛选具有免疫优势的合成肽。我们发现，合成肽Sao149～164能够与Sao多抗血清发生强烈反应，说明Sao149～164在抗S.suis 2感染中诱导了免疫优势的抗体应答。目前没有关于此表位的文献报道。课题组进而以Sao149～164为检测抗原，以不同来源血清为一抗，分别是S.suis 2感染后人血清为实验组、其他菌(肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、表皮葡萄球菌等)感染后血清为对照组、正常人阴性血清为阴性对照组，完成间接ELISA检测。数据显示，合成肽Sao149～164仅与S.suis 2感染后人血清发生强烈反应，而与其他菌感染后血清、正常人血清不发生反应。结果证实，Sao149～164能够捕捉到S.suis 2感染后人体外周血中的特异性抗体，可以作为S.suis 2感染的检测标志物。
一种与S.suis 2感染有关的合成肽Sao149～164，该合成肽的氨基酸序列具体如下：
IEFIDNDNVFNNFYTP(SEQ ID NO.1)。
该合成肽为包含16个氨基酸的肽段，能够与Anti-Sao、S.suis 2感染后人血清发生强烈反应。
合成肽Sao149～164作为包被抗原在制备S.suis 2感染快速辅助诊断试剂盒中应用。
一种S.suis 2感染快速辅助诊断试剂盒，该试剂盒用于检测人感染S.suis 2后血清中的特异性抗体。所述快速辅助诊断试剂盒，该试剂盒含有检测标志物Sao149～164。
所述快速辅助诊断试剂盒还包括ELISA检测常用的试剂。如包被液、牛血清白蛋白V、PBS缓冲液、HRP-羊抗鼠多克隆血清、终止液、TMB显色液等，还可以含有阴、阳性对照品。
有益效果：
本发明提供了一种自行设计的合成肽，高效液相色谱法分析该合成肽纯度可高达93.22％。合成肽为白色粉末状冻干粉，性质稳定，-20℃条件下可保存数年。通过实验证实，该合成肽能够捕捉到S.suis 2感染后人体外周血中的特异性抗体，可以作为包被抗原应用在S.suis 2感染快速辅助诊断试剂盒中。本发明为S.suis 2的快速辅助诊断提供了新思路，可以降低由于S.suis 2感染诊断不及时造成的死亡，具备潜在的良好临床应用价值。
附图说明
图1Sao蛋白Ni-IDA亲和层析纯化检测
1：诱导的上清；2：流出液；3：30mM咪唑漂洗液；4：60mM咪唑漂洗液；5:90mM咪唑漂洗液；6～9：250mM咪唑洗脱液；箭头：重组Sao蛋白降解所致杂蛋白带。
图2间接ELISA法筛选Sao的免疫优势B细胞表位肽
图3Sao149～164与不同来源人血清的结合情况
1～24为正常人阴性血清；25为表皮葡萄球菌感染后人血清；26为屎肠球菌感染后人血清；27为肺炎克雷伯菌感染后人血清；28为大肠埃希菌感染后人血清；29～31为猪链球菌感染后不同人的血清。
具体实施方式
实施例1：05ZYH33来源的Sao序列信息及线性B细胞表位预测
1.1明确Sao蛋白序列：Sao蛋白全长580个氨基酸，其中，1-29位氨基酸为信号肽，具体序列如SEQ ID NO.2所示。
1.2Sao蛋白免疫信息学参数预测：利用IEDB网站中的Antibody EpitopePrediction下的Parker Hydrophilicity Prediction、Karplus&Schulz FlexibilityPrediction、Emini Surface Accessibility Prediction、Chou&Fasman Beta-TurnPrediction工具，分别对Sao蛋白的亲水性、柔性、表面可及性和β折叠进行预测，设定阈值，将4种免疫信息学参数预测结果汇总分析。
1.3Sao蛋白B细胞表位预测：分别利用三种线性B细胞表位预测工具进行预测(Bepipred、COBEpro和ABCpred)，将三种方法预测得到的B细胞表位汇总后比较，取重叠的B细胞表位为候选B细胞表位，结合免疫信息学参数预测结果，筛选Sao蛋白B细胞表位肽。
1.4实验结果
将上述表位预测工具的预测结果作汇总后比较，结合免疫信息学参数预测结果，最终筛选到10个B细胞表位肽，交由吉尔生化(上海)有限公司协助合成。其基本序列见表1。
表1：Sao蛋白10个候选B细胞表位肽氨基酸序列信息
Figure BDA0002339633470000041
实施例2：间接ELISA法筛选Sao蛋白免疫优势线性B细胞表位肽
2.1Anti-Sao的制备
取SPF级6～8周龄雌性BALB/c小鼠。首次免疫：将纯化的rSao蛋白(制备方法见王晶,李敏,刘文静,et al.Sao蛋白多克隆抗体制备鉴定及促全血杀菌作用[J].中国公共卫生,2014,30(3):364-367)与弗氏完全佐剂充分乳化，腹部皮下多点注射，免疫剂量为100μg/只；第2次免疫：首次免疫2周后，将rSao蛋白与弗氏不完全佐剂完全乳化，经皮下多点注射，免疫剂量为100μg/只；第3次免疫于第2次免疫后2周进行，剂量和方法同第2次免疫；加强免疫：第3次免疫后2周，用未乳化的rSao蛋白腹腔内注射，免疫剂量为100μg/只。加强免疫7d后自小鼠眼眶后静脉丛取血，分离血清即为Anti-Sao，采用间接ELISA检测Anti-Sao效价。
2.2根据不同B细胞表位肽与Anti-Sao的应答水平，确定优势应答的B细胞线性表位肽。间接ELISA法步骤如下：
2.2.1抗原包被：为确定Sao优势应答的B细胞线性表位肽，ELISA板中分别包被10种候选B细胞线性表位肽、阴性对照蛋白BSA及阳性对照rSao蛋白，之后用Anti-Sao进行检测。用包被液(50mM碳酸钠/碳酸氢钠，pH 9.6)调整抗原包被浓度，每种抗原做2个复孔。将纯化后rSao蛋白、B细胞表位肽浓度调整至1μg/ml，100μl/孔4℃过夜包被酶标板；
2.2.2封闭：含吐温-20的磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffered Saline Tween-20,PBST)洗板3次，甩干后每孔加入200μl封闭液(3％BSA溶液),37℃封闭2h；
2.2.3加入一抗：PBST洗板3次，甩干，Anti-Sao按照1：5000稀释，100μl/孔加入酶标板，37℃孵育1h；
2.2.4加入二抗：PBST洗板3次，甩干，HRP标记的山羊抗鼠IgG按照1：4000稀释，100μl/孔加入酶标板，37℃孵育1h；
2.2.5显色：PBST洗板3次，甩干，TMB显色液100μl/孔加入酶标板，避光显色10min；
2.2.6终止反应：酶标板内加入终止液100μl/孔，终止反应；
2.2.7检测：酶标仪检测450nm处吸光度(A)值，待测样本/阴性对照(P/N)≥2.1为阳性。
2.3实验结果
在OD450nm处，表位肽Sao149～164的吸光度值显著高于阴性对照蛋白BSA，其吸光度值有显著性差异(P<0.0001)，可见Sao149～164为Sao的免疫优势表位肽。结果如图2所示。
实施例3：Sao149～164检测S.suis 2感染
3.1以Sao149～164为检测抗原，以不同来源血清为一抗，分别是S.suis 2感染后人血清为实验组、其他菌(肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、表皮葡萄球菌等)感染后血清为对照组、正常人阴性血清为阴性对照组，完成间接ELISA检测。具体步骤如下：
3.1.1抗原包被：ELISA板中包被合成肽Sao149～164。用包被液(50mM碳酸钠/碳酸氢钠，pH 9.6)调整抗原包被浓度，每种抗原做2个复孔。包被浓度与条件同2.2.1；
3.1.2封闭：封闭液与封闭时间同2.2.2；
3.1.3加入一抗：一抗根据来源不同分为三组。第一组为实验组，为S.suis 2感染后人血清共3份；第二组为其他菌对照组，分别为肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、表皮葡萄球菌、屎肠球菌感染后人血清共4份；第三组为阴性对照组，是正常人血清共24份，PBST洗板3次，甩干，一抗血清按照1：200稀释，100μl/孔加入酶标板，37℃孵育1h；
3.1.4加入二抗：PBST洗板3次，甩干，HRP标记的山羊抗人IgG按照1：4000稀释，100μl/孔加入酶标板，37℃孵育1h；
3.1.5显色及终止反应同2.2.5、2.2.6；
3.1.6检测：酶标仪检测450nm处吸光度(A)值，待测样本/阴性对照(P/N)≥2.1为阳性。
3.2实验结果
合成肽Sao149～164仅与S.suis 2感染后人血清发生强烈反应，而与其他菌感染后血清、正常人血清不发生反应，结果如图3所示。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
序列表
<110> 无锡市妇幼保健院
<120> 与S.suis 2感染检测相关的合成肽及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Ile Glu Phe Ile Asp Asn Asp Asn Val Phe Asn Asn Phe Tyr Thr Pro
1 5 10 15
<210> 2
<211> 580
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Asn Thr Lys Lys Trp Arg Thr Ser Leu Leu Ile Pro Gly Ile Val
1 5 10 15
Leu Phe Gly Thr Val Ala Leu Val Asn Asn Val Ser Ala Gln Glu Val
20 25 30
Lys Asn Thr Ile Ile Ser Ala Lys Gln Pro Asp Gly Gly Gln Ala Thr
35 40 45
Ser Lys Ala Val Asn Val Lys Ile Pro Ala Val Val Arg Leu Phe Gly
50 55 60
Arg Glu Leu Leu Glu Asn Glu Phe Lys Phe Glu Leu Arg Glu Ala Asn
65 70 75 80
Gly Glu Glu Leu Pro Val Leu Asp Thr Ala Gln Asn Thr Lys Glu Gly
85 90 95
Gln Val Arg Phe Lys Asn Leu Ser Phe Asp Lys Pro Gly Lys Tyr Trp
100 105 110
Tyr Thr Ile Ser Glu Val Lys Asp Glu Leu Gly Gly Ile Glu Tyr Asp
115 120 125
Ser Lys Tyr Ile Val Ala Lys Ile Thr Val Glu Asp Arg Asn Gly Gln
130 135 140
Leu Gln Ala Met Ile Glu Phe Ile Asp Asn Asp Asn Val Phe Asn Asn
145 150 155 160
Phe Tyr Thr Pro Ala Pro Ala Ala Ala Ser Leu Ser Ile Lys Lys Val
165 170 175
Leu Glu Gly Arg Thr Leu Asn Thr Gly Glu Phe Glu Phe Val Leu Lys
180 185 190
Asn Glu Lys Gly Asp Glu Ile Glu Lys Val Ser Asn Gln Ala Asp Gly
195 200 205
Ser Val Asn Phe Ser Ala Leu Thr Phe Thr Lys Glu Gly Thr Tyr Thr
210 215 220
Tyr Thr Val Ser Glu Val Asp Gly Gly Leu Gly Asp Ile Ile Tyr Asp
225 230 235 240
Lys Ser Asp Ile Lys Ala Thr Val Thr Val Lys Asp Asn Asn His Gly
245 250 255
Gln Leu Val Ser Thr Val Thr Tyr Glu Asn Ser Asp Gln Ile Phe Glu
260 265 270
Asn Ile Leu Asn Pro Gly Lys Leu Ile Ala Pro Thr Thr Asp Ser Val
275 280 285
Ile Thr Asp Asn Glu Val Ser Lys Glu Ala Met Thr Gly Lys Glu Lys
290 295 300
Gly Asn Ile Glu Pro Leu Lys Glu Gln Ile Ala Asn Glu Glu Lys Asp
305 310 315 320
Asn Ile Glu Ala Ser Glu Lys Gln Met Pro Ser Ile Val Asn Asp Met
325 330 335
Val Val Thr Pro Glu Lys Gln Met Thr Asn Lys Glu Asn Asp Lys Val
340 345 350
Val Ile Ser Glu Lys Gln Met Pro Ser Val Val Asn Glu Asn Ala Val
355 360 365
Thr Pro Glu Lys Gln Met Thr Asn Lys Glu Asn Asp Asn Ile Glu Thr
370 375 380
Ser Glu Lys Gln Met Pro Ser Val Val Asn Glu Asn Ala Val Thr Pro
385 390 395 400
Glu Lys Gln Met Thr Asn Lys Glu Lys Asp Asn Ile Glu Thr Ser Glu
405 410 415
Lys Gln Met Pro Ser Ile Val Asn Asp Met Val Val Thr Pro Gln Glu
420 425 430
Gln Met Ala Asn Lys Glu Asn Asp Lys Val Val Ile Ser Glu Lys Gln
435 440 445
Met Pro Ser Ile Val Asn Asp Met Val Val Thr Pro Gln Glu Gln Met
450 455 460
Ala Asn Lys Glu Asn Asp Lys Val Glu Thr Ser Glu Lys Gln Met Pro
465 470 475 480
Val Asn Glu Lys Asp Asn Ala Val Thr Pro Glu Lys Gln Met Ala Asn
485 490 495
Lys Glu Lys Glu Asn Ile Glu Thr Ser Lys Lys Gln Ile Pro Val Asn
500 505 510
Glu Asn Asn Gln Asn Gly Thr Val Glu Glu Asn Ser Asn Thr Lys Pro
515 520 525
Thr Thr Glu Lys Thr Asp Lys Gln Glu Thr Ser Thr Phe Lys Thr Glu
530 535 540
Thr Ala Lys Gln Ile Leu Pro Val Thr Gly Glu Lys Gly Ser Leu Trp
545 550 555 560
Leu Leu Thr Ser Gly Ile Ile Gly Leu Ala Ile Ala Leu Phe Thr Arg
565 570 575
Lys Arg Lys Leu
580

Claims (1)

1.SEQ ID NO.1所示合成肽Sao149~164在制备S.suis 2感染快速辅助诊断试剂盒中应用。
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