CN111373302A - 对无接触定向流体动力学流动同时进行成像和执行的设备和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于对样品中的无接触定向流体动力学流动同时进行成像和执行的设备，具有：至少一个光源，特别是激光，被适配成动态地加热样品的内部和/或表面；具有物镜的显微镜，物镜被适配成对样品的至少一部分进行成像并且将光源的光束特别是激光束引导到，特别地聚焦到样品中和/或样品上，以加热样品的至少一个指定位置；用于操纵指定位置的装置；以及用于样品的样本室，样本室可用于成像辐射和光束进入以允许经由物镜对样品同时进行成像和操纵。此外，本发明涉及一种用于对样品中的无接触定向流体动力学流动同时进行成像和执行的方法，其中，至少一个光源特别是激光经由光束特别地经由激光束动态地加热样品的内部和/或表面，至少一个光源的光束通过显微镜的物镜被导向样品，光束被可变地引导到，特别地被聚焦到样品的指定位置，在样品中诱导流体动力学流动，以及经由与用于引入光束的相同的物镜对样品进行成像。

Description

对无接触定向流体动力学流动同时进行成像和执行的设备和 方法
本发明涉及如下各项：根据权利要求1的用于对样品中的无接触定向流体动力学流动同时进行成像和执行的设备；根据权利要求20的用于对样品中的无接触定向流体动力学流动同时进行成像和执行的方法；根据权利要求36的计算机程序产品；以及根据权利要求37的计算机可读存储介质。
根据Journal of Applied Physics 104，104701(2008)(应用物理期刊104,104701(2008))，知道了所定义的在微观尺度上的流体流动的控制，其是化学和生物化学中的若干应用的基础并且在缩小生物传感应用中起着重要作用。小型化可以缩短实验的时间，增强检测的信噪比并且减少化学药品的总体消耗。在过去，已经探索了用以远程切换微制造通道中的阀门以便控制通道中的流体流动的若干方式。已经调查了光学方法来移动覆盖的流体液滴或通过俘获粒子附近的全息诱导的涡流来驱动液体流动。光刻表面图案化用于通过热毛细管致动或表面声波来诱导液滴移动。光刻表面图案化是作为在没有表面图案化或不使用特殊基质的情况下对于液体在两个维度上具有受控路径的远程光学驱动而提出的。
在先前现有技术的微流控技术中，使用压力来沿着微观尺度通道驱动流动。然而，压力控制遭受迟滞效应并且需要到外部泵和控制器的宏观尺度连接。
根据WO 2008/061706 A1，已知一种用于粒子的快速热光表征的方法和设备。特别地，WO 2008/061706 A1涉及一种测量生物分子的稳定性、分子的相互作用以及单个粒子跳动的长度/大小的确定或者长度/大小的确定的方法和装置。
本发明面临提供允许经由诱导光进行受控操纵并对样品同时进行成像的设备、方法、计算机程序产品和计算机可读存储介质的任务。
此任务是根据本发明通过根据权利要求1的设备、根据权利要求20的方法、根据权利要求36的计算机程序产品以及根据权利要求37的计算机可读存储介质来解决的。
优选的实施例是随从属权利要求、说明书和附图而提供的。
根据本发明的设备被提供有：至少一个光源，特别是激光源，被适配成动态地加热样品的内部和/或表面；具有物镜的显微镜，所述物镜被适配成对样品的至少一部分进行成像并且将光源的光束，特别是激光束，引导到，特别地聚焦到，样品中和/或样品上，以加热样品的至少一个指定位置；用于操纵指定位置的装置；以及用于样品的样本室(samplechamber)，所述样本室可用于成像辐射和光束进入以允许经由物镜对样本同时进行成像和操纵。
利用光远程地控制物质的能力具有优点。在物理学和生物学的许多领域中，物质的光学控制由于其通用性和精密度而被使用并且对实验方法已经具有重大影响。例如，光学陷阱允许在各种广泛的几何构型中在真空中使单原子冷却和隔离。此外，已经采用光学镊子来在生理条件下在微观尺度上抓取并移动物体。
光源优选地为红外光源，特别是红外激光，其波长在700nm和1mm的范围内，优选地在1000nm和0.1mm的范围内，并且更优选地在1300nm和0.05mm的范围内。光源被特别地设计使得它在水的红外吸收最显著的波长区域中发出辐射。特别有利的是在1455nm下施加电磁辐射以便加热样品的流体，因为水在该波长下具有最大局部吸收。
发明设备的优选实施例的特征在于，存在用于将光束耦合到显微镜的光路中的装置。这个用于耦合的装置能够例如由二向色分束器实现。
原则上，能够将用于操纵指定位置的装置布置在到样品的光路中的任何地方。在优选实施例中，用于耦合光束的装置被布置在用于操纵指定位置的装置的下游。在这个上下文中，术语“下游”将连同光束的传播方向一起来理解。即，在此实施例中，光束首先通过用于操纵的装置，然后被耦合到微观光束路径中。
因此，实现了如下优点：可独立于样本的成像进行对样品的操纵，即在样品中无接触定向流体动力学流动的产生。例如，在利用显微镜对样品的某个区域进行成像的情形下，此区域能够经受光束的预定义的图案以便产生流体动力学流动，并且能够完全独立于利用显微镜进行的成像来选取图案。
在本发明的意义上的成像可以被理解为用于对样品进行实时分析的至少一种技术，诸如例如荧光分析。可以在执行对样品的操纵的同时实施成像技术。
在本发明的意义上的无接触可以特别是样品与固体、液体或气体探针的机械相互作用的任何缺少。在此上下文中，光是根据其电磁波特性来考虑的。因此，光与样品之间的相互作用以及光诱导的流体动力学流动被视为无接触相互作用。
在本发明的意义上的无接触相互作用还可能意味着不使用固态探针粒子作为用于加热样品的探针。例如，样品可能不含有用作用于样品加热的探针的固态粒子。更具体地，在发明方法的优选变型中，不使用粒子，特别地不使用金粒子用于样品的加热。术语探针粒子在本上下文中是指具有纳米粒子的尺寸或更大的实体。
根据本发明的定向流体动力学流动特别地将被理解为由于光源与样品之间的受控的相互作用而导致的样品内的液体部分的移位。然而，可以通过探针、染料或粒子在流体内的移动来检测流体动力学流动的移动速度。因此，所观察到的探针、染料或粒子的流动速度可能比流体它本身的实际流动慢。
样品可以是包含允许定向流体动力学流动的至少一个流体部分的任何样本。优选地，样品是在具有定义的高度的两个表面之间(例如在两个样品保持器之间)的液体的定义的样本，或具有至少一种液体或包含液体的腔室的死亡或活着的单细胞或多细胞生物样本。定向流体动力学流动可以用于在样品内/通过样品、特别地在样品的液体内/通过样品的液体从第一位置向至少第二位置、优选地沿着轨迹输送至少一种粒子、探针或实体，诸如化学品、染料或生物活性材料。
另外，可以提供流体动力学流动以使在样品内的预定位置处的流体内的至少两个粒子聚集在一起。
物镜可以是例如单个透镜或标准显微镜透镜。
根据本发明，粒子、探针或实体可以是可通过穿过样品的定向流体动力学流动输送的任何物体。粒子的可运输性可以特别地取决于粒子尺寸和/或介质弹性，尤其在粘弹性介质中。因此，粒子尺寸以及流动的强度和宽度可以彼此对应。
根据本发明，样品由光源动态地加热。因此，可以通过动态地(优选地不断地)改变样品中的加热位置来引入样品内的定向流动，从而在具有膨胀区域(优选地目前加热的区域)和不同收缩程度的区域的样品内，优选地在之前已经在不同时间点被加热的区域中提供变化的加热图案。每个加热区域也可以是移动光束所沿着的轨迹的一部分。
根据本发明的优选实施例，光束被导向样品并且沿着至少一个轨迹通过样品移动，由此通过样品的光束的移动可以是连续的(光束不在某个位置处逗留)或者可以具有中断，在所述中断期间，在通过样品的光束的移动继续之前光束在样品中的某个位置处停留一定时间。
另外，中断的形式可以为来自光源的减少的辐射摄入或没有来自光源的辐射摄入。
优选地，能够照此选取激光轨迹，即在优选地复合的激光轨迹的一个周期之后，样品中的每一点都被同样地加热。这导致跨样品的均匀温度分布。通过打破通过样品的聚焦体积路径(focal volume path)的对称性，仍然能够产生复杂的局部流动轨迹(参见图2)。
一般来说，流动速度线性地取决于粘度对温度的导数(dvis/dT)。
应指出，样品具有一定体积，所述体积可能受到例如至少细胞壁、样品保持器表面或任何其他边界的限制。通过物镜被导向样品的光束的聚焦体积能够被导向样品内或其表面上的地方。当根据本发明描述两者之一时，暗示了可替选地或附加地包括另一个(表面或内部)。
根据本发明的显微镜可以是具有物镜的任何设备，其使得能够优选同时地操纵和观察样品内诱导的变化。
根据本发明的指定位置可以是在样品内/在样品上移动光束所沿着的轨迹。此外，指定位置可以是至少在样品的一部分中提供的加热图案，其中由于加热斑点的定向运动的时空动态特性，所以加热图案诱导样品内的定向流体动力学流动。
根据本发明的用于操纵特定位置的装置可以是允许操纵光束在样品内的传播方向的任何设备。
本发明的优选实施例的特征在于，在光束路径的准直部分中在光源与显微镜之间提供用于操纵光束的聚焦体积的装置，特别是可变光束扩展器。可变光束扩展器被设计成使来自光源的光束的宽度变宽或变窄。用于操纵光束的聚焦体积的装置可以是变焦或可变光学器件。
优选地，在光束的路径中在用于操纵光束的聚焦体积的装置前面提供准直器。可变光束扩展器将光束挤得越窄，光束的聚焦体积在通过物镜之后越宽。因此，能够根据公知等式来调节聚焦体积的尺寸以及击中样品的辐射的强度：
Figure BDA0002504335770000061
其中n是物镜的折射率，
Figure BDA0002504335770000062
是离开透镜的光锥的角度，其取决于进入物镜的准直光束的宽度，λ是光束的波长并且xmin表示斑点的分辨率并且因此确定聚焦体积。由于
Figure BDA0002504335770000063
随进入物镜的光束的直径而上升，所以可以看到的是，准直光束的直径越小，聚焦体积越大。因此，样本在样品中每面积或体积单位的能量摄入随进入物镜的准直光束的光束宽度增加而减少。
窄光束在物镜后面导致更大的聚焦体积。因此，能量摄入在样品中跨更大的表面面积/体积扩散，并且因此与击中物镜的更宽的准直光束相比，样品中每单位的加热效果更小。优选地，光束扩展器具体地允许使光束的尺寸与应该被操纵的样品的隔室或细胞的尺寸大致匹配。更优选地，可以将聚焦体积调节为例如被操纵的细胞中的细胞核的尺寸的一半。
根据本发明的实施例，用于操纵指定位置的装置是扫描器，特别是声光偏转器或电流计扫描器，特别是准静态电流计扫描器。原则上，能够使用谐振电流计扫描器。此外，可以想象使用空间光调制器(SLM)以用于光束偏转或光束操纵目的，其可以或可以不与机械装置(即可旋转道威棱镜)组合以使所得的强度轮廓旋转。
优选地，偏振分束器和/或半λ片连同声光偏转器一起使用以选择线性偏振光并且使光束的线性偏振状态旋转以与偏转器的光轴匹配。
优选地，快门装置被提供并被适配成中断光束到显微镜的光路中的耦合。这可能是在定义的温度下进行定量荧光成像所需要的，受到荧光蛋白的温度相关性妨碍。进入到样品的光束的摄入加热样品。因此，特别是在某个区/区域中的样品的温度可以从环境温度改变，从而导致荧光强度的改变。当快门装置被关闭时，通过光源对样品的辐照被中断，并且能够在没有温度诱导的荧光强度变化的情况下计算图像。
然而，通过提供诸如荧光系统的指示剂(例如，罗丹明(Rhodamine)B)并且根据经由已知温度变化的在先校准，能够确定局部温度分布。因此可以将指示剂的可检测荧光强度与样本内的温度分布相关联，从而知道荧光系统的温度相关性。
根据本发明的优选实施例，显微镜是下列中的至少一种：共焦显微镜、荧光激光扫描显微镜、宽视场显微镜、2光子荧光显微镜、光片显微镜、结构照明显微镜和/或TIRF(全内反射)显微镜。显微镜可以被适配成提供下列中的至少一种：高灵敏度成像、高分辨率成像、与共焦、转盘和2光子荧光的兼容性、由于样本中的小加热图案而导致的高分辨率操纵、与荧光光漂白后恢复即FRAP的兼容性、与产生加热图案的干涉方法和/或STED(受激发射损耗)、SIM(结构照明显微术)、PALM(光激活定位显微术)、STORM(随机光学重建显微术)全息成像、相差、DIC(微分干涉差)的兼容性。
优选地，物镜提供有至少0.5、优选地0.95、更优选地1.2和最优选地1.4的高数值孔径。
根据本发明的实施例，使用空气或浸没物镜，对于后者，优选地在物镜与样本之间提供硅油或重水。通常，可以使用在所使用的激光波长下不吸收的浸液。浸液可以将分辨率放大等于液体的折射率的系数。浸液被优选地放置在物镜与样品保持器之间以避免设备的各部分与空气之间的附加相变。物镜的数值孔径通常会受到浸液影响。浸没光学器件优先地用于确保数值孔径(NA)是高的，使得成像具有高灵敏度。
发明设备的优选实施例的特征是样本室包括下列中的至少一个：样品保持器，优选地为具有第一样本室限定表面(first sample chamber confining surface)的盖玻片；提供定义的样本厚度的样品保持器上的至少一个间隔件；以及具有第二室限定表面的冷却装置，其中间隔件被设置在第一限定表面与第二限定表面之间。尽管它被称作样品保持器，但是还可以根据设备的设置在样品的上侧面上提供这种特征。间隔件可以是提供样本室的定义的高度的任何材料。可替选地，提供包括至少一个开放侧的非三明治样的样本装架(如上所述)。因此例如覆盖样品载玻片可能是不必要的。
相对于在通过光束加热样品期间的能量摄入，样本室的定义的高度以及因此定义的体积可能是重要的。冷却装置可以包括透明材料，其能够使成像辐射、加热光和/或用于样品的亮场或暗场照明的光的通过。
优选地，样品保持器和/或第二室限定表面的厚度为至少30μm。该厚度可以被适配并且能够达到170μm或更高的值。
优选地，提供了冷却装置的第二室限定表面包括导热、透明的材料，优选地为蓝宝石或金刚石。能够优选地使由样品吸收的热耗散以在样品内保持所定义的温度状态。特别地在活样品(诸如单细胞或多细胞有机体)的情况下，当超过某些温度阈值时可能发生样品的分解。例如，神经细胞应该在约36℃下处理。然而，当超过41℃时神经细胞失去其完整性。冷却装置被适配成(优选连续地)从样品中去除热并且使温度保持在预设水平。
在本发明的另一方面中，冷却装置还包括至少一个冷却元件，优选地为珀耳帖(Peltier)元件，被适配成使导热材料冷却。冷却元件被优选地提供来使冷却装置的温度保持稳定。从样品转移到第二室限定表面的热可以由有源冷却元件去除。
另外，冷却装置可以被连接到诸如计算机的公共操作员控件，从而使得能够优选地取决于光源的辐射的强度而适配冷却强度。能够提供动态冷却，所述动态冷却减小与设定点的温度偏差，这例如对脊椎动物细胞很重要。优选地偏差是50％或更小。
在本发明的另一个方面中，冷却装置包括热管理系统，所述热管理系统被适配成从冷却元件去除热。冷却元件产生热，特别地在相反的表面上产生热以在含有样品的表面或相反表面上提供上面提及的局部冷却效果。必须去除该热能以便避免冷却元件处的局部热点。因此，热管理系统可以提供有由导热材料制成的至少一个接触元件，所述至少一个接触元件优选地在与冷却装置相比的相反侧接触冷却元件。
可替选地或附加地，提供热管理系统的水冷却和/或用于使热管理系统冷却的冷却鳍片/肋片。
因此，优选地冷却元件被夹在冷却装置与热管理系统之间。热管理系统可以包括中空实体，通过所述中空实体可以提供冷却液体以与冷却元件的接触区域极为接近。最优选地，中空金属体可以与冷却元件接触，冷却水或不同的冷却液体通过所述中空金属体被泵送，以保持热管理系统对冷却元件的一定的冷却效果。
特别地为了观察样品，提供亮场或暗场照明，所述亮场或暗场照明支持通过显微镜的物镜对所操纵的样品进行直接或间接检查。可以将样品设置在物镜与冷却装置之间。与样品相比，可以将照明装置设置在冷却装置的相反侧。因此，优选的是冷却装置和热管理系统分别是透明的或者具有用于照明辐射分别到达样品和物镜的间隙或孔。
优选地，设备包括数据处理装备，所述数据处理装备被连接到冷却装置、显微镜和光源，由此能够依赖于彼此和/或依赖于所辐照的样品的成像信息来设置冷却装置的冷却强度和光束的强度。为了样品的可再现操纵，所辐照的光束优选地提供有可调强度，即能量输出。可以使此输出适应样品的特性或所实施的操纵。
另外，当在样品处沿着轨迹移动光束时，可能期望提供具有变化能量沿着轨迹摄入进入样品的能量轮廓。为了避免样品的过热并且使样品内的温度保持在预定水平和/或低于某个阈值，可以将冷却装置的输出功率调节以适应光源的能量输出。
与关于来自光束的能量摄入和来自冷却元件的冷却功率的信息相结合的从在执行无接触定向流体动力学流动的同时对样品进行成像中收集的信息使得能够进行对样品的依赖光束强度的观察和操纵。
甚至更优选地，数据处理装备还被连接到用于操纵光束的指定位置的装置，以便引起通过样品的光束的受控移动。通过样品的光束的受控移动可能沿着已经在操纵样品之前设置的预定轨迹。可能提供计算机作为具有用于输入关于通过样品的光束的轨迹的数据的至少一个接口的数据处理装备。
输入装置可以是数字的或图形的。根据本发明的一个实施例，输入装置是示出样品的至少一部分或表示样品的虚设物的触摸屏，其中可能对光束的轨迹进行编程，例如通过标记光束的轨迹并且因此通过在所呈现的图形上标记通过样品的光束的移动。
根据本发明的优选实施例，用于操纵指定位置的装置具有至少一个空间光调制器。用于投影激光图案的局部振幅的可变调制的任何装置，特别是空间光调制器(SLM)可能被用于在样品处提供加热图案。优选地，空间光调制器能够位于光束路径的图像平面或光瞳面中。
空间光调制器能够例如被用来在光轴例如样品内的z坐标的方向上移动光束的聚焦体积。在本说明书中，x坐标和y坐标对于图像平面、显微镜和/或样品保持器表面是正交的。利用这样的空间光调制器或相应地操纵光源的辐射的装置，可以在样品处提供光束的聚焦体积的3维轨迹。
可能通过沿着样品中和/或样品上的轨迹反复地扫描光束来在样品处提供加热图案。然而，还可能通过优选地利用区域之间的温度轮廓对样品的区域进行优选地恒定和/或动态的加热来提供加热图案，其中其他区域很少或根本不被加热。能够单独或与扫描光束相结合地使用产生加热图案的这种方式。
产生加热图案的另一方式可以被理解为对样品内的含有某种流体的区域的至少部分局部辐照。在含有流体的区域内可以提供不同能级的辐照并且/或者在含有不同流体的区域中可以建立相同或不同能级的辐照。
通过根据上面提供的说明在样品内提供加热图案，与样品中的其他区域相比，存在没有或较少辐照的区域。由于辐照的这种差异以及因此样品的不同区域中的不同温度，流体动力学流动被诱导，特别地通过由于加热而导致的流体的粘度、密度和膨胀方面的差异。
本领域的技术人员理解，与包含未被加热或加热的比第一区域少的流体的第二区域比，包含更强地被加热的流体的第一区域将膨胀更多，显示出更低的密度和更低的粘度。在至少两个区域处于流体连通的情况下，液体的至少一部分将从第一区域动态地移动到第二区域。
例如，当第一区域与第二区域之间的热摄入相反使得第二区域比第一区域被更多地加热时，液体的流动也相反。通过动态地改变第一位置与第二位置之间的热，可以提供样品的流体的来回运输或摇动/振荡。具体地，通过单向扫描多次然后使单向扫描反向，能够诱导具有给定频率的振荡流动。这些振荡流动能够用于探测诸如细胞质的粘弹性物质的材料状态，而无需任何样品修改。能够通过粒子跟踪、特别地借助于对所获得的粒子轨迹进行傅立叶分析(锁定技术)来检测材料的响应。原则上，能够经由对通过对粒子轨迹进行视频记录和计算机跟踪而获得的信号的傅里叶变换来检测粒子的振荡运动。这能够用于测量粘度和弹性材料特性。
此外，能够通过多个单向扫描来诱导材料变形，同时检测时间相关变形(蠕变变形)。随后检测无刺激的时间相关松弛。
在此示例中，不一定存在正在移动的光束，而是存在具有局部不同强度和/或盲斑点的辐照场，其中不提供加热或仅提供减少的加热。另外，第一区域和/或第二区域可以改变或更改它们的位置和/或尺寸。
根据上述第二替选方案的用于加热样品的至少一个区域的另一个可能性可能是投影光场特别是激光图案的局部振幅的时间调制，或多个相干光(激光)场的干涉，例如通过按相对频移使(激光)光场重叠。
结构图案的相长干涉和相消干涉可以被导向物镜。相消干涉导致没有加热或加热减少的盲斑点。相长干涉在样品中提供了被光束加热的至少一个区域。可以通过随时间改变单个光束的相对相位，即通过使两个相干激光束的频率稍微失配来调制干涉图案。
为了产生合适的干涉图案，例如可以提供相位掩模或空间光调制器，其提供样品的结构照明/辐照。此外，由相位掩模产生的图案与参考光束的干涉可能被用于产生动态热场。
如何能够在液体中产生流动的另一方式是在散热器附近进行局部重复加热。在加热尤其是冷却阶段期间，已建立的温度场将在更靠近散热器的区域中更快地衰减，使得已建立的温度场的中心的动态特性不会随时间保持恒定，而是在整个加热/冷却循环中稍微移动。温度场的这种有效运动然后继而将在液体内部诱导流动。
根据用于对样品中的无接触定向流体动力学流动同时进行成像和执行的发明方法，至少一个光源，特别是激光，经由光束，特别地经由激光束动态地加热样品的内部和/或表面，至少一个光源的光束通过显微镜的物镜被导向样品，光束被可变地引导，特别地聚焦到样品的指定位置，在样品中诱导流体动力学流动，并且经由与用于引入光束的相同物镜对样品进行成像。
根据本发明的一个方面，在经由相同物镜实现并执行对操纵的观察的同时，实施样品的液体中的流体动力学流动的无接触诱导。优选地，为以下任务提供了显微镜，显微镜提供样品的辐照和对由样品发射的辐射(优选地为荧光辐射)的分析。
根据本发明的优选实施例，物镜被同时用于样品的成像和利用光束对样品的加热。因此，可以实时地对样品的操纵进行观察/成像。
优选地，借助于声光偏转器、电流计扫描器、特别是准静态电流计扫描器，沿着样品处的路径移动光束特别是激光束的聚焦体积。原则上，还可以使用谐振电流计扫描器。这些扫描器特别地是为x-y扫描提供的。x-y平面与样品保持器和物镜的表面平行但是与光束路径正交。原则上，借助于SLM或可动透镜特别是特别地布置在光束的光束路径内的机动透镜，z方向上的扫描是可能的。
根据本发明的一个方面，在光束的路径中的快门装置被关闭，使得对样品的加热被中断，并且在定义明确的温度下，通常在光束的加热温度以下优选地通过荧光成像来观察流体动力学流动。利用快门装置可以中断对样品的加热以允许测量蛋白质浓度。
由于所提供的冷却装置和优选地样品的小体积，样品的温度能够非常快速地被降低至冷却设备/冷却装置的温度。因此，当快门装置被关闭时，样品内的温度是定义明确的。
优选地，通过光束沿着路径或指定轨迹反复地移动指定位置。无接触定向流体动力学流动可能通过沿着预定轨迹的光束的单次移动而被诱导。然而，为了使样品内的液体保持流动，沿着预定轨迹的光束的重复运动是有利的。通过光束对轨迹或路径的这种重复描绘在样品内引起泵送效果。
根据本发明的另一个方面，至少一个光源加热如下中的至少一种：样品、诸如金粒子的导热粒子、染料和/或在样品中或在样品上的吸热层，特别是碳层。光束优选地在样品的液体部分内具有其聚焦体积。然而，还可以通过加热辅助或补充实体来提供在样品内沿着轨迹的定义的加热。例如，样品中的吸热粒子(例如金)或吸光染料可能附加地或代替流体它本身被加热。
另外，如果仅样品内的表面层和/或某个层应该被加热和/或开始运动，则诸如碳层的吸热层能够被设置在样品上和/或在样品内并且可以被加热以吸收光束的能量。所吸收的能量在吸收层上沿着光束摄入轨迹转移到周围流体。
发明方法的特别优选实施例的特征在于，记录样品对流动驱动刺激的响应。流动驱动刺激可以是单个、重复或周期性或扫掠刺激(sweeping stimulus)。记录样品的响应能够为推断样本的材料特性和/或能帮助对样本的分类的现象学响应系数的目的服务。
在流动驱动刺激是周期性刺激的情况下，优选的是在与周期性刺激具有预定义的相位关系，例如恒定相位关系的时间点处拍摄显微图像。这具有能够更容易地评价微观数据的优点。
在发明方法的特别优选实施例中，通过跟踪基准标记物，特别地然后对基准标记物的轨迹进行傅立叶分析来执行粒子跟踪。在此上下文中，术语粒子将被理解为特别是生物学样品的一部分。例如，能够利用发明方法跟踪细胞的组分的移动。
作为基准标记物，使用荧光蛋白复合物，例如μNS示踪粒子或如同小粒剂(smallgranules)的其他细胞器(cellular organelles)。实体有资格作为可能的基准标记物的基本要求是其能够利用标准显微镜技术特别地但不一定利用荧光显微镜被检测。
关于粒子的对准和操纵，本发明具有许多有用的应用。
更具体地，可能以比流体动力学流场的典型尺寸高的精度进行粒子的定位。这在单个粒子的情况下是最容易实现的，但是还可能在多个粒子的情况下被实现。通过流体动力学流场或短流场，我们是指指示样品的空间内的流体动力学流动的方向和大小的矢量场。更具体地，术语流场表示完全地或至少部分地通过如上所述在受限制的和预定义的时间段内动态地加热样品的内部和/或表面而产生的流体动力学流场。
例如，可能通过施加一系列流体动力学流场来实现多个粒子的定位，所述一系列流体动力学流场是根据粒子的流诱导的或自发的重新定位顺序地选取的。也就是说，可能在有限时间段内施加第一流场，使得粒子被移动一定距离，然后施加第二不同的流场，然后施加第三流场，依此类推，直到粒子已经移动到足够地靠近其预定目的地和/或进入所期望的相对空间配置或间距中为止。
因此发明方法的优选的替选方案的特征在于，样品经受一系列流场，特别地使得样品内的一个或多个粒子被带到特定目的地。
特别地，可能期望在施加流场之后读出粒子位置的相对变化。相应地，本发明的另外的变型的特征在于，在每次施加流场之后确定一个或多个粒子位置的相对变化。
优选地，一个或多个粒子位置的相对变化能够被用于确定要随后施加的合适的另外的流场。粒子位置和/或移动性的信息用于预测、确定或计算合适的另外的流场。
可替选地，可能期望施加流场，使得除精确位置以外的粒子位置的其他测量被更改。优选地，流场被施加使得至少样品中的粒子的密度、间距和/或聚类被改变。
此外，能够施加流场，使得至少一个粒子被保持在样品中的预定义位置处。这在期望连续地校正粒子位置以抵消粒子位置的波动的情形下可能是有用的，所述波动可以由粒子的周围环境诸如例如样本中的扩散运动和/或其他运动源引起，但不限于漂移、由毛细作用力引起的流动和/或生物活性。
在发明方法的另一个优选变型中，施加流场使得对于部分地或完全地定位的粒子，空间目的地连续地或以离散时间步长改变。这在期望以离散时间步长或连续地改变部分地或完全地定位的粒子的目的地的情形下是有用的，使得通过流场驱动的粒子沿着连接这些时间上变化的目的地的路径移动。
附加地或可替选地，能够计算并施加流场以沿着期望路径移动一粒子或沿着期望路径移动多个粒子。
此外，根据本发明提供了一种包括指令的计算机程序产品，当程序由计算机执行时，所述指令使计算机执行具有以下步骤的方法：控制用于操纵样品的指定位置的装置，所述样品将根据指定位置的预定轨迹被加热；接收冷却装置上的温度读数；从显微镜接收成像数据；从光源接收功率输出数据；依赖于彼此和/或依赖于所辐照的样品的成像信息来控制冷却装置的冷却强度和光束的强度。
另外，提供了一种包括指令的计算机可读存储介质，所述指令当由计算机执行时，使计算机执行具有以下步骤的方法：控制用于操纵样品的指定位置的装置，所述样品将根据指定位置的预定轨迹被加热；接收冷却装置上的温度读数；从显微镜接收成像数据；从光源接收功率输出数据；依赖于彼此和/或依赖于所辐照的样品的成像信息来控制冷却装置的冷却强度和光束的强度。
在下文中，借助于所提供的附图进一步说明本发明。
图1：根据优选实施例的发明设备的示意草图，
图2：经历定向流体动力学流动的时间平均同等地加热的样品的示例，
图3：如何在样品中诱导作为定向流体动力学流动的旋转的示例。
图1示出了根据本发明的优选的实施例，其具有用以提供相干光辐射(优选地为激光26、28)的设置，以及可以用来观察对样品24的操纵的显微镜25。本领域的技术人员理解，此实施例的特定设置仅是说明性的并且可以根据所进行的实验来适配。
对光束的操纵
根据优选的实施例的设备30包括光源1，该光源优选地为激光光源。在光源与显微镜25之间，可以提供特别地具有附图标记2至11、33和34的若干固定装置。具有所提及的附图标记的固定装置可以被设计成提供具有定义的光束直径的相干、准直辐射。可以提供相同装置的任何附加、补充或替代安装。
光源1与快门装置11之间的光束被称为光束28。相同但在显微镜内的光束被称为光束26。
作为第一步骤，可以通过用于准直光源1的辐射的准直器33从光纤的出口收集光束28。在准直器33之后，可以提供偏振分束器立方体2以选择线性偏振光。可以将未通过偏振分束器立方体2的光辐射的份额导向用以安全地阻挡不需要的光的光束捕集器3，所述光束捕集器也可能是用以测量光源1的真实输出功率的光电二极管。
此外，可以提供具有至少第一透镜4和第二透镜5的望远镜作为预调整以供扫描器8消除由光源1的准直器33所引起的发散。此外，半λ片6可以用于使光束的线性偏振状态旋转以与扫描器8的光轴匹配。此外，可以在扫描器8的上游提供可变光束扩展器7(变焦光学器件，可变光学器件)。
扩展器7被设计成在不改变由扫描器8提供的样品24内的扫描图案的尺寸的情况下操纵光束直径。扫描图案的分辨率可以与样本即小流场和亚细胞隔室的尺寸匹配，并且在更大尺度上能够在不改变成像物镜的情况下被生成。物镜16被适配成对样品24的至少一部分进行成像和/或操纵。
扫描器8可能是声光偏转器(AOD)、电流计扫描器，特别是准静态电流计扫描器或SLM。其目的(8)可以被描述为将光束26、28导向样品24内的不同位置并且因此在样品24处沿着轨迹或路径移动光束26、28的聚焦体积。扫描器8是光特别是激光的操纵中的公知工具。扫描器8可以提供有至少一个反射镜或光折射实体，所述至少一个反射镜或光折射实体可以相对于光束28提供可调反射/折射角。因此，可以通过扫描器8在样品24内沿着轨迹至少沿着x轴和y轴动态地引导光束28。这些轴优选地与光束26正交。优选地，扫描器8用于重复地辐照在样品24处选取的轨迹，以使最初诱导的流动保持正常运行。
重复导致提供流动的泵送效果，可以从数百纳米直到甚至在更长的毫米距离上维持所述流动。当随光束26到达轨迹的终点时，扫描器8跳到轨迹的起点。优选地，不需要关闭光源1。
在光束在扫描器8之后或下游的传播方向上，可以提供具有至少第一透镜9第二透镜10的第二望远镜。该第二望远镜可能被提供来将扫描器诱导的光束移动精确地平移到显微镜物镜的后焦平面中。
另外，可以在附图标记1和11之间的各装置之间提供反射镜34以用于重定向光束28。
另外在光束在扫描器8之后优选地在第二望远镜之后的传播方向上，提供并设计了快门装置11以使光束与成像光学器件解耦。这可能是定量(荧光)成像所需要的。例如，当将荧光蛋白作为用于对样品24的操纵进行成像的染料来提供时，染料的发射活性是温度相关的。通过关闭快门装置11，可以将温度调节为精确地定义的温度，所述精确地定义的温度允许在染料/流体的定义明确的浓度下并且定义明确的温度下对样品进行成像。
利用预先准备的成像实验，可以分析染料的行为的温度相关性，特别是染料的发射活性和/或吸收活性。随后，当同时地对提供有染料的样品24进行操纵和成像时，由于关于染料的成像信息，所以可以实时地确定样品24内的某个区域的实际温度。
此外，在样品24内诱导流动之后，可以关闭快门装置11以便中断光束摄入。因此，样品24冷却至约等于由冷却装置18提供的温度的温度。
显微镜的结构
在由2至11的装置中的任一个操纵光束之后，提供显微镜25以用于既对样品24进行成像又对样品24进行操纵。提供至少一个元件12以用于将光束耦合到显微镜25的光路a)中。优选地，这种元件12是二向色镜，所述二向色镜优选地反射光束但是在用于荧光成像的可见波长状况下透射。因此，进入显微镜25的光束可能被元件12重定向，但是对样品进行成像所需的辐射穿过元件12以到达显微镜25的物镜16。
显微镜25可以是标准显微镜，优选地具有如下中的任一个：由相应的激发、二向色和发射滤光器构成的(荧光)滤光器立方体13；用于成像的光源(例如荧光光源或亮场照明)14；用于成像辐射的检测器15，特别是提供定量(荧光)成像的高速及高灵敏度相机；以及显微镜物镜16。成像辐射源14和/或用于成像辐射的检测器15(例如相机)可以被设置在显微镜光束路径a)内并且/或者可以被投影到该显微镜光束路径a)中，例如经由发射滤光器13。图1示出了被投影到辐照光束路径a)中的成像辐射27的光束路径。
通过连续箭头指示沿其提供光束的检测光束路径b)以及辐照光束路径c)的方向。检测光束路径b)从样品24开始并且穿过物镜16到达用于成像辐射的检测器15。用于成像辐射的辐照光束路径a)从成像辐射源14开始并且穿过物镜16到达样品24。
显微镜物镜16优选地包括高数值孔径，提供同时的高分辨率(荧光)成像和精确光束(例如红外激光)扫描。优选地，为相应的物镜提供重水或硅油作为浸液29。另外，可以使用高NA空气物镜。浸液29被优选地放置在样本室17与物镜16之间。这消除了气相(空气)的附加相变，其会降低被成像样品24的分辨率。
可以在样本室17内提供样品24。可以将样本室17视为提供有样品24的定义的体积的地方。样品24可以是单细胞或多细胞生命形式、在内部具有至少一个粒子的流体或任何其他液体样本、细胞裂解物或胚胎提取物、可以流体动力学方式或以热方式移动的粘弹性材料。样本室17可以提供有第一盖，所述第一盖提供优选地包含蓝宝石或金刚石或任何其他高导热和/或透明的材料的第一室限定表面。可以至少为可见光和/或根据本发明用于成像、操纵和/或背光的任何其他辐射提供透明度。另外，第一盖表面可以是标准显微镜玻片。
样本室17优选地由第二室限定表面限制，所述第二室限定表面可以是冷却装置18的一部分或用于高通量实验的开放多孔板。第二室限定表面优选地包含蓝宝石或金刚石或任何其他高导热且透明的材料。可替选地，也可以提供像盖玻片/盖玻璃这样的玻璃表面作为第二限定表面。可以至少为可见光和/或根据本发明用于成像、操纵和/或背光的任何其他辐射提供透明度。在冷却装置18的第二室限定表面下方可以提供冷却元件31，优选地为至少一个珀耳帖元件。本领域的技术人员理解，每个冷却元件也输出热，特别地以需要被消散的废热形式。因此，可以提供从冷却元件31去除热的热管理系统32。
优选地，热管理系统32包括金属或不同的导热表面，其中可以提供交换冷却液体(优选地为水)作为吸热器(heat dump)。另外，可以提供被动冷却。优选地在冷却装置18后面，为样品24提供亮场或暗场照明19。热管理系统32优选地提供有开口或透明层，以允许亮场或暗场照明19辐照样品24。附加地或可替选地，根据图1可以在成像传感器15的位置处提供亮场或暗场照明19并且反之亦然。
附加地，可以提供计算机20，所述计算机20优选地被连接到光源1、扫描器8、显微镜25、成像传感器15、快门11和/或冷却元件31。在计算机与冷却元件31之间，可以提供比例积分微分(PID)控件23，当需要重新调节冷却温度时，所述PID控件优选地帮助避免冷却元件31的温度的振荡。装置21和22被优选地设置在扫描器8与计算机20之间并且可以包括为扫描器控制箱22提供模拟信号的PCI控制器卡21，并且扫描器控制箱22可以包括用于操作扫描器8的电子振荡器和电子放大器。
计算机20优选地设置有计算机程序产品并且根据计算机程序产品，当程序由计算机执行时，所述计算机程序产品提供：对样品24的光辐射(光束、激光束)的施加的协调、由冷却元件31相对于光源1的输出功率进行的调节的冷却、扫描器8根据预定轨迹如当在沿着该预定轨迹移动的样品24中提供有光束26的聚焦体积时那样的移动和/或样品24的实时成像。
因此，可以使在每个时间点的成像信息符合光源1的输出功率以及在样品24处分别由光束26或聚焦体积在或多或少恒定的温度下辐照的实际点或区域，因为由光源1输出的能量变化可以通过冷却元件31的附加冷却功率来补偿。
技术
可以通过随流体的流动而携带的粒子的移动来观察流体动力学流动的实际移动。根据本发明的流体的流动速度可以是粒子在流动内的行进速度。优选地，流动的方向与光束移动的轨迹相反。
此外，可以通过染料的使用来观察流动，由此温度梯度和/或浓度梯度可以是从成像检测器15可记录的，因此允许染料的流动速度的确定代表液体/流体的流动。
如果仅样品的隔室例如样品的表面区域将被光源1动态地加热而不对在光路方向上的该隔室的上方和/或下方的附加流体进行加热，则在期望动态加热的那个区域中的粒子或层可以被提供来吸收合适波长的光并且因此分别地由光束或聚焦体积加热。
可以选取波长和粒子/层材料以吸收优选地不被样品的流体吸收的波长。这种粒子可以是例如金粒子，所述金粒子被光束辐照并因此被加热。所引入的能量然后转移到周围液体，当沿着轨迹的粒子被动态地加热时，周围液体最终导致液体中的流体动力学流动。本领域的技术人员理解，需要沿着流体或样品24内的流体动力学流动的轨迹提供这些粒子中的几个。附加地或代替流体内的粒子，可以在样品24上或在样品24内提供被光束辐照并因此被加热的层。
优选地沿着轨迹移动光束从而加热特定路径。在那个层下方和/或上方极为接近的液体从该层吸收热，这在那个层附近产生局部流体动力学流动。所述层可能是薄碳层或提供优选地为红外激光的光束的吸收但是允许透射可见光使得可以进行样品的荧光成像的相当的材料。然而，光束也可以包括其他非红外波长。
根据图2的垂直线和水平线描绘了可在样品中沿其移动激光束的聚焦体积的轨迹。根据图2的线可以具有小距离，使得样品被视为均匀地加热。沿着每条线聚焦体积被移动两次。线上的箭头指示聚焦体积移动的方向。
在线1和3中，移动是一个从左到右和一个从右到左。
因此，特别地由于在两个相反方向上几乎同时诱导的流动，所以这些线中诱导的流体动力学流动被抵消。在线2中聚焦体积被从左侧向右侧(或以相反方向)移动了两次，由此由两次聚焦体积移动诱导的流动是在同一方向上。
因此，尽管平均温度大约均匀地分布，但是诱导了流体动力学流动。线2中的流动是在与聚焦体积的移动方向相反的方向上诱导的。
还可以根据图3中的方案移动激光通过样品。
所描绘的正方形1至8至少表示如根据本发明所定义的样品的摘录。
每个正方形1至8大约表示在不同时间点的样品内的同一区域。
八个正方形表示将样品一个接一个地、优选地根据升序编号暴露于的八个不同的聚焦体积光束图案。
与正方形相比，所操纵的样品的尺寸可以更小、更大或相等。
通过由于局部温度变化而导致的粘度在那个正方形中随时间的相应变化，可以产生样品中的流体的自旋移动。
正方形内的每个虚线区域代表样品内的加热区域。该区域可以包括离散加热的许多加热位置和/或被沿其移动以在时间平均上提供加热区域的轨迹。优选地，特定正方形内的每个加热区域被一个接一个地诱导到样品中，然而比从一个正方形到另一个被提供的图案的变化要快。因此，在时间平均上，提供了根据每个正方形中的虚线的加热区域。
优选地，在已经引入了根据所有八个正方形的图案的一个完整循环之后，每个虚线区域被同等地加热。
加热位置/轨迹或正方形(即循环的各部分)的数目能够被适配并且具有大于或等于2的任何数目。
本发明实现了基于振荡流体动力学流动的主动和无探针微流变术。更具体地，为了积极地测量诸如活细胞的细胞质或染色质的细胞内组分的流变材料特性，本发明开发了主动和无探针微流变术。
对于本发明的实施例，在这方面的关键构思包括诱导微弱振荡流体动力学流动刺激并且通过跟踪细胞基准标记物同时地测量材料的响应。基准标记物可以是任何表达的荧光蛋白复合物，即能够利用标准显微镜技术检测的μNS示踪粒子或如同小粒剂的其他细胞器。
为了诱导振荡流体动力学流动，能够例如在使流动反向之前在交替的、相反方向上施加持续通常80ms的半周期(完整周期为160ms)的流动。这将导致6.25Hz的多孔材料的有效振荡频率。在表1中通过示例描述了技术细节，即激光扫描频率和扫描次数。通过改变给定激光扫描频率下的扫描次数，能够将振荡频率调整至少两个数量级。
通常能够通过跟踪基准标记物、随后对粒子轨迹进行傅立叶分析来执行材料对所诱导的振荡流体动力学流动的响应。在这里，优选的是每个流动周期用2^n个相机图像进行记录。通常，能够使用每周期8个图像并且每次测量总共128个周期。细节被示出在表1中。
本发明优于现有的微流变学技术(诸如磁镊子或光镊子)的技术优势是发明设备和发明方法不需要任何样本修改或探针注入。此特征对在闭合几何体中诸如在常常受到粒子并入严重影响的活胚胎和细胞中工作特别重要。
表1：用于流动驱动的微流变术的可能设置
Figure BDA0002504335770000261

Claims (37)

1.一种用于对样品(24)中的无接触定向流体动力学流动同时进行成像和执行的设备(30)，具有
-至少一个光源(1)，特别是激光源，被适配成动态地加热所述样品(24)的内部和/或表面，
-具有物镜(16)的显微镜(25)，所述显微镜(25)被适配成对所述样品(24)的至少一部分进行成像并且将所述光源(1)的光束(26)，特别是激光束引导到，特别地聚焦到所述样品(24)中和/或所述样品(24)上，以加热所述样品(24)的至少一个指定位置，
-用于操纵所述指定位置的装置(8)，以及
-用于所述样品(24)的样本室(17)，所述样本室(7)可用于成像辐射(27)和所述光束(26)进入以允许经由所述物镜(16)对所述样本同时进行成像和操纵。
2.根据权利要求1所述的设备(30)，
其特征在于
在光束路径的准直部分(28)中，在所述光源(1)与所述显微镜(26)之间提供用于操纵所述光束(26)的聚焦体积的装置，特别是可变光束扩展器(7)。
3.根据权利要求1和2中的一项所述的设备(30)，
其特征在于
所述用于操纵所述指定位置的装置(8)是扫描器，特别是声光偏转器或电流计扫描器，特别是准静态电流计扫描器。
4.根据权利要求1至3中的一项所述的设备(30)，
其特征在于
快门装置(11)被提供并且被适配成中断所述光束(28)到所述显微镜(25)的光路中的耦合。
5.根据权利要求1至4中的一项所述的设备(30)，
其特征在于
所述显微镜(25)是下列中的至少一种：共焦显微镜、荧光激光扫描显微镜、宽场光显微镜和/或2-光子荧光显微镜。
6.根据权利要求1至5中的一项所述的设备(30)，
其特征在于
所述物镜(16)具有至少为0.5，优选地为0.95，更优选地为1.2以及最优选地为1.4的高数值孔径。
7.根据权利要求1至6中的一项所述的设备(30)，
其特征在于
提供空气或浸没物镜，对于后者，优选地在所述物镜与所述样本之间提供硅油或重水。
8.根据权利要求1至7中的一项所述的设备(30)，
其特征在于
所述样本室(17)包括：样品保持器，优选地为具有第一样本室限定表面的盖玻片；在所述样品保持器上的至少一个间隔件，所述至少一个间隔件提供定义的样本厚度；以及具有第二室限定表面的冷却装置(18)，其中所述间隔件被设置在所述第一限定表面与所述第二限定表面之间。
9.根据权利要求8所述的设备(30)，
其特征在于
所述样品保持器和/或所述第二室限定表面具有至少30μm的厚度。
10.根据权利要求8所述的设备(30)，
其特征在于
所述冷却装置的所述第二室限定表面包括导热、透明的材料，优选地为蓝宝石或金刚石。
11.根据权利要求8所述的设备(30)，
其特征在于
所述冷却装置(18)进一步包括至少一个冷却元件(31)，优选地为珀耳帖元件，被适配成使所述导热材料冷却。
12.根据权利要求8或11所述的设备(30)，
其特征在于
所述冷却装置(18)包括热管理系统(32)，所述热管理系统(32)被适配成从所述冷却元件(31)去除热。
13.根据权利要求1至12中的一项所述的设备(30)，
其特征在于
提供亮场或暗场照明(19)，所述亮场或暗场照明(19)支持通过所述显微镜(25)的所述物镜(16)对所操纵的样品(24)进行直接或间接检查。
14.根据权利要求1至13中的一项所述的设备(30)，
其特征在于
提供数据处理装备(20)，所述数据处理装备(20)被连接到所述冷却装置(18)、所述显微镜(25)、所述快门(11)和所述光源(1)，由此能够依赖于彼此和/或依赖于辐照的样品(24)的成像信息来设置所述冷却装置(18)的冷却强度和所述光束(26、28)的强度。
15.根据权利要求14所述的设备(30)，
其特征在于
所述数据处理装备(20)进一步被连接到用于操纵所述光束(26)的所述指定位置的装置，以便引起通过所述样品(24)的所述光束(26)的受控移动。
16.根据权利要求1至15中的一项所述的设备(30)，
其特征在于
用于操纵所述指定位置的装置具有至少一个空间光调制器。
17.根据权利要求1至16中的一项所述的设备，
其特征在于
所述光源是红外光源，特别是红外激光，具有的波长在700nm至1mm的范围内，优选地在1000nm至0.1mm的范围内，并且更优选地在1300nm至0.05mm的范围内。
18.根据权利要求1至17中的一项所述的设备，
其特征在于
存在用于将所述光束(12)耦合到所述显微镜的光路中的装置。
19.根据权利要求1至18中的一项所述的设备，
其特征在于
用于耦合所述光束(12)的装置被布置在用于操纵所述指定位置的装置(8)的下游。
20.一种用于对样品(24)中的无接触定向流体动力学流动同时进行成像和执行的方法，其中，
-至少一个光源(1)，特别是激光，经由光束(26)特别地经由激光束动态地加热所述样品(24)的内部和/或表面，
-所述至少一个光源(1)的所述光束(26)通过显微镜(25)的物镜(16)被导向所述样品(24)，
-所述光束(26)被可变地引导到，特别地被聚焦到所述样品(24)的指定位置，在所述样品(24)中诱导流体动力学流动，以及
-经由与用于引入所述光束(26)的相同的物镜(16)对所述样品(24)进行成像。
21.根据权利要求20所述的方法，
其特征在于
所述物镜(16)被同时地用于对所述样品进行成像和利用所述光束(26)对所述样品进行加热。
22.根据权利要求20或21中的一项所述的方法，
其特征在于
所述光束(26)的聚焦体积借助于声光偏转器或电流计扫描器，特别是准静态电流计扫描器或谐振电流计扫描器，或空间光调制器，沿着所述样品(24)处的路径移动。
23.根据权利要求20至22中的一项所述的方法，
其特征在于
在所述光束(26)的路径中的快门装置(11)被关闭，使得对所述样品(24)的加热被中断并且在定义明确的温度下优选地通过荧光成像来观察流体动力学流动。
24.根据权利要求20至23中的一项所述的方法，
其特征在于
通过所述光束(26)沿着路径或轨迹重复地移动所述指定位置。
25.根据权利要求20至24中的一项所述的方法，
其特征在于
所述至少一个光源(1)加热如下中的至少一种：所述样品(24)、诸如金粒子的导热粒子、染料和/或在所述样品(24)中或在所述样品(24)上的吸热层，特别是碳层。
26.根据权利要求20至25中的一项所述的方法，
其特征在于
不使用固态探针粒子作为用于加热所述样品的探针。
27.根据权利要求20至26中的一项所述的方法，
其特征在于，记录所述样品对流动驱动刺激，特别是单个、重复或周期性或扫掠刺激的响应，特别地以推断所述样本的材料特性和/或能帮助对所述样品的分类的现象学响应系数。
28.根据权利要求20至27中的一项所述的方法，
其特征在于
通过跟踪基准标记物，特别地然后对所述基准标记物的轨迹进行傅立叶分析来执行粒子跟踪。
29.根据权利要求28所述的方法，
其特征在于，使用荧光蛋白复合物，例如μNS示踪粒子或如同小粒剂的其他细胞器作为基准标记物。
30.根据权利要求20至29中的一项所述的方法，
其特征在于
所述样品(24)经受一系列流场，特别地使得所述样品内的一个或多个粒子被带到特定目的地。
31.根据权利要求20至30中的一项所述的方法，
其特征在于
在每次施加流场之后确定一个粒子位置或多个粒子位置的相对变化。
32.根据权利要求20至31中的一项所述的方法，
其特征在于
一个粒子位置或多个粒子位置的相对变化被用于确定随后要被施加的合适的另外的流场。
33.根据权利要求20至32中的一项所述的方法，
其特征在于
施加流场，使得所述样品中的至少粒子的密度、间距和/或聚类被改变。
34.根据权利要求20至33中的一项所述的方法，
其特征在于
施加流场，使得对于部分地或完全地定位的粒子，空间目的地被连续地或以离散时间步长改变。
35.根据权利要求20至34中的一项所述的方法，
其特征在于
流场被计算并且施加以沿着期望路径移动至少一个粒子。
36.一种包括指令的计算机程序产品，
当所述程序由计算机执行时，所述指令使所述计算机执行具有以下步骤的方法：
控制用于操纵根据所述指定位置的预定轨迹要被加热的样品(24)的指定位置的装置(8)，
接收冷却装置(18)上的温度读数，
从显微镜(25)接收成像数据，
从光源接收功率输出数据，
依赖于彼此和/或依赖于辐照的样品(24)的成像信息来控制所述冷却装置(18)的冷却强度和光束(26、28)的强度。
37.一种包括指令的计算机可读存储介质，所述指令在由计算机执行时使所述计算机执行具有以下步骤的方法：
控制用于操纵根据所述指定位置的预定轨迹要被加热的样品(24)的指定位置的装置(8)，
接收冷却装置(18)上的温度读数，
从显微镜(25)接收成像数据，
从光源接收功率输出数据，
依赖于彼此和/或依赖于辐照的样品(24)的成像信息来控制所述冷却装置(18)的冷却强度和光束(26、28)的强度。
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