CN111366568A - 一种多路荧光全视野扫描成像系统 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种多路荧光全视野扫描成像系统，包括：光路显微成像装置、样品托槽、位移载物台、控制机构和图片获取机构；位移载物台包括X轴、Y轴移动机构，X轴、Y轴移动机构分别带动位移载物台沿X轴、Y轴方向移动，从而带动样品托槽中样本移动；控制机构控制位移载物台按照设定路径进行移动，使待测样本暴露在显微视野下的视野覆盖整个待测样本；图片获取机构获取位移载物台每次移动后样本暴露在显微视野下的图片，从而得到整个样本暴露在显微视野下的多张局部位置的图片。本发明避免组织切片或单细胞悬液在显微放大状态下不完整视野扫描及拍照导致无法拼接完整而造成的图像信息损失。

Description

一种多路荧光全视野扫描成像系统

技术领域

本发明涉及属于生命科学领域，具体地，涉及一种多路荧光全视野扫描成像系统，尤其是一种组织切片或单细胞悬液的多路荧光全视野扫描成像系统。

背景技术

平面扫描成像在病理组织切片和单细胞悬液的研究中都起到很重要的作用。组织切片成像是观察组织学结构的检查结果、解析细胞的空间信息强有力的工具。但是显微镜尤其高倍显微镜的成像视野有限，切片在显微镜放大下，只能对局部位置进行拍照成像，无法在一个视野内对完整的组织切片进行观察，这样将无法体现样本全貌，而有些仪器为了增加采样量，会拍摄多个视野，但是没有连续起来，导致无法完整拼接，或者由于机械精度的原因，图像间会有重叠或者缝隙，导致组织切片成像不完整，从而可能会导致样本中重要细胞的空间信息丢失。对于单细胞悬液来说，荧光全视野扫描成像是为了准确的进行细胞计数，包括活细胞染料染色下的荧光图像与死细胞染料染色下荧光图像中的细胞个数，从而得出总细胞数以及活细胞比率。目前的细胞计数仪同样存在样品无法在一个视野内全部暴露在显微镜物镜下，而由于细胞悬液中细胞分裂或者细胞粘附很容易导致细胞分布并不均匀和局部细胞结团，严重影响细胞计数仪的准确性。

经检索发现，申请号为CN201811198222.3的中国专利，公开了一种基于图像识别法细胞计数仪的人工计数和校验装置，包括全自动细胞计数仪，全自动细胞计数仪包括控制主机，控制主机具有一个人机界面，该控制主机具有整机硬件控制模块自动调焦模块以及自动图像识别模块，还包括一摄像头、显微光路组、荧光滤块模组、物镜模组、荧光光源及透镜组、自动样品台以及可见光光源及透镜组，该全自动细胞计数仪还设置有一个电动载物台以及一个更换卡槽机构，主机内部主板录入一个虚拟刻线软件包以及人工计算软件，并使用多种类的细胞计数板。在上述专利中电动载物台的移动是为了保证仪器的计数区域和血细胞计数板的计数区域相同，无法实现全视野细胞计数，细胞计数的准确性有待进一步提高。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种多路荧光全视野扫描成像系统，实现对待测样本进行全视野扫描，有效提高了待测样本成像的完整性以及后续细胞计数的准确性。

为实现上述目的，本发明提供一种多路荧光全视野扫描成像系统，包括：用于待测样本的多路荧光的显微成像的光路显微成像装置，用于固定待测样本位置的样品托槽，用于承载所述样品托槽的位移载物台，控制机构和图片获取机构；其中，

所述位移载物台包括：

X轴移动机构，所述X轴移动机构带动所述位移载物台沿X轴方向移动；

Y轴移动机构，所述Y轴移动机构带动所述位移载物台沿Y轴方向移动；

所述X轴与所述Y轴位于同一水平面，且该水平面与所述光路显微成像装置的光路垂直；所述位移载物台在X轴、Y轴方向移动带动所述样品托槽中待测样本移动；

所述控制机构，其输出端分别与所述X轴移动机构、所述Y轴移动机构的输入端连接，通过所述X轴移动机构和/或所述Y轴移动机构控制所述位移载物台按照设定路径移动，所述位移载物台每次移动的距离与所述光路显微成像装置的显微放大视野相同，使所述待测样本暴露在显微视野下的移动路径覆盖整个所述待测样本；

所述图片获取机构，设置于所述光路显微成像装置的成像端，获取所述位移载物台每次移动后所述待测样本暴露在所述光路显微成像装置的显微视野下的图片，得到整个所述待测样本暴露在显微视野下的多张局部位置的图片，实现对所述待测样本全视野扫描。

优选地，所述X轴移动机构包括第一动力装置和第一传动系统，所述第一动力装置与所述第一传动系统连接，所述第一动力装置驱动所述第一传动系统在X轴方向移动，所述第一传动系统带动所述位移载物台沿X轴方向移动。

优选地，所述Y轴移动机构包括第二动力装置和第二传动系统，所述第二动力装置与所述第二传动系统连接，所述第二动力装置驱动所述第二传动系统在Y轴方向移动，所述第二传动系统带动所述位移载物台沿Y轴方向移动。

优选地，所述多路荧光全视野扫描成像系统还包括电动控制模块，所述电动控制模块包括第一控制系统和第二控制系统，所述第一控制系统、所述第二控制系统的输入端与所述控制机构的输出端连接，所述第一控制系统、所述第二控制系统的输出端分别与所述第一动力装置、所述第二动力装置的输入端连接，其中，所述第一控制系统控制所述第一动力装置驱动所述第一传动系统，通过所述第一传动系统带动所述位移载物台及所述样品托槽移动，从而控制所述样品托槽在X轴方向的运动位移；所述第二控制系统控制所述第二动力装置驱动所述第二传动系统，通过所述第二传动系统带动所述位移载物台及所述样品托槽移动，从而控制所述样品托槽在Y轴方向的运动位移，从而调整所述待测样本暴露在所述光路显微成像装置的显微视野内的区域。

优选地，所述第一传动系统、所述第二传动系统结构相同，均包括编码器和光栅尺，所述编码器对所述第一动力装置或所述第二动力装置的丢步及时检测并作出调整，所述光栅尺用于测量位移距离，并将测量输出信号转换为数字脉冲，使所述位移载物台在X轴、Y轴方向平移的直线距离从相对位移转变为绝对位移。

优选地，所述第一传动系统、所述第二传动系统还包括丝杆、联轴器、底板、支架、导轨和滑块，其中，所述丝杆通过所述支架固定于所述底板上，所述丝杆的一端与所述联轴器的一端连接，所述联轴器的另一端与所述第一动力装置或所述第二动力装置连接；所述导轨设置于所述丝杆的两侧，所述导轨的两端分别与所述支架固定；所述滑块设置于所述丝杆上方，并与两侧的所述导轨活动连接，所述丝杆转动带动所述滑块沿所述导轨方向滑动；所述光栅尺读头设置于所述滑块内，用于测量所述滑块下方的所述光栅尺记录的位移距离。

优选地，所述多路荧光全视野扫描成像系统还包括：与所述光路显微成像装置的物镜连接的Z轴升降机构，所述Z轴升降机构带动所述物镜在垂直方向发生位移，调节所述物镜与所述待测样本之间的距离，实现自动对焦。

优选地，所述多路荧光全视野扫描成像系统还包括：自动对焦控制模块，其输入端与所述Z轴升降机构的连接，所述自动对焦控制模块的输出端与所述图片获取机构的输入端连接，控制所述图片获取机构在所述Z轴升降机构的位移过程中连续拍照，并对位移过程中的连续拍照的多张图像进行分辨率分析，找出最清晰的图像并记录对应图像的拍摄Z轴方向的位置，以实现自动对焦过程。

优选地，所述光路显微成像装置包括明场光源和荧光场光源，能分别得到所述待测样本在明场下、荧光场下的显微成像。

优选地，所述荧光场光源包括多通道荧光光源和光路切换部件，所述光路切换部件根据荧光染色波段特征进行荧光场的光路切换，所述光路切换部件设置于所述多通道荧光光源的下方，所述光路切换部件带动所述多通道荧光光源沿水平方向移动，实现荧光场的光路切换。

优选地，所述图片获取机构还包括定位拍照模块，所述定位拍照模块的输入端与所述控制机构的输出端连接，控制并动态记录所述待测样本在X轴、Y轴的位置，以使在所述位移载物台每移动一显微放大视野的距离，对所述待测样本暴露在所述光路显微成像装置的显微视野下形成图像进行拍照。

优选地，所述多路荧光全视野扫描成像系统还包括图像拼接模块，所述图像拼接模块的输入端与所述图片获取机构的输出端连接，所述图像拼接模块将获得的所有图像进行多张图片按拍摄次序进行对齐与拼图，整合为一张完整的全视野图片。

优选地，所述多路荧光全视野扫描成像系统还包括计数模块，所述计数模块的输入端与所述图像拼接模块的输出端连接，所述计数模块根据所述图像拼接模块获得所述单细胞悬液在明场光源和不同荧光场下的所述全视野图片，分别计算所述单细胞悬液在明场光源下图像、活细胞染料染色下的荧光图像与死细胞染料染色下荧光图像中的细胞个数，并对三份图像进行比对分析，得出所述单细胞悬液的总细胞数、细胞结团率、双细胞率以及活细胞比率。

与现有技术相比，本发明具有如下至少一种的有益效果：

1.本发明上述系统，控制机构控制位移载物台在X轴、Y轴方向移动带动样品托槽中待测样本按照设定路径，实现定向定距移动以及拍照，获得待测样本在显微视野下的多张照片，实现对待测样本全视野扫描；上述系统可避免待测样本(组织切片或单细胞悬液)在显微放大状态下不完整视野扫描及拍照导致后期无法拼接完整而造成的图像信息损失。以及进一步设置的编码器与光栅尺联动精准控制X轴移动机构、Y轴移动机构的移动位置，从而精准控制待测样本暴露在显微镜物镜下的位置，保证完美覆盖待测样本的全部区域，再结合进一步设置的定位拍照模块和图像拼接模块，将获得待测样本的完整图像，从而避免了因图像间出现重叠或缝隙影响细胞空间信息的导致细胞计数的出现偏差的问题。

2.本发明上述系统，通过设置与物镜连接的Z轴升降机构，可以通过控制Z轴升降机构的位移距离，从而调整物镜与待测样本之间的距离进行自动对焦；调焦范围在0-8mm内，精度准确到10μm，从而实现高分辨的全视野扫描。

3.本发明上述系统，定位拍照模块能使上述位移载物台在X轴、Y轴方向移动带动样品托槽中待测样本进行定向定距移动并进行拍照，每次移动的距离与显微放大视野相同，当整个组织切片或单细胞悬液样本在单个光源的显微视野下经多张照片拍摄完毕后，通过图像拼接模块对所拍摄的图片拼接的同时进行光源切换，重新使待测样本在另一光源下进行定向定距移动和拍照，从而使本发明在保证图片拼图质量的前提下，加速扫描效率。

4.本发明上述系统，通过多通道荧光光源和光路切换部件，可实现多荧光检测，同一实验过程中可以自由切换多个激发光源，适用于不同荧光染色的待测样本，可准确判断细胞凋亡情况、细胞浓度、活性。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1是本发明一优选实施例的多路荧光全视野扫描成像系统的结构示意图；

图2为本发明一优选实施例的动力装置与传动系统的结构示意图；

图3为本发明一优选实施例的光路显微成像装置的光路图；

图中标记分别表示为：1为位移载物台、2为样品托槽、3为明场光源、4为多通道荧光光源、5为光路显微成像装置、6为图片获取机构、7为电动控制模块、8为Z轴升降机构、9为直流电源、10为编码器、11为第一动力装置、12为支架、13为联轴器、14为丝杆、15为导轨、16为滑块、17为光栅尺、18为光路切换部件。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

参照图1所示，为本发明一优选实施例的多路荧光全视野扫描成像系统的结构示意图，图中包括光路显微成像装置5、样品托槽2、位移载物台1、控制机构和图片获取机构6，其中，光路显微成像装置5用于待测样本的多路荧光的显微成像；样品托槽2用于固定待测样本的位置，待测样本可以组织切片或单细胞悬液；位移载物台1用于承载样品托槽2。图中还包括用于为仪器供电的直流电源9。

位移载物台1包括X轴移动机构和Y轴移动机构，X轴移动机构带动位移载物台1沿X轴方向移动。Y轴移动机构带动位移载物台1沿Y轴方向移动；X轴与Y轴位于同一水平面，且该水平面与光路显微成像装置5的光路垂直；位移载物台1在X轴、Y轴方向移动带动样品托槽中待测样本移动。

控制机构的输出端与分别与X轴移动机构、Y轴移动机构的输入端连接，通过控制X轴移动机构、Y轴移动机构来控制位移载物台1按照设定路径进行移动，位移载物台1每次移动的距离与光路显微成像装置5的显微放大视野相同，使待测样本暴露在显微视野下的移动路径覆盖整个待测样本。

图片获取机构6设置于光路显微成像装置5的成像端，获取位移载物台1每次移动后待测样本暴露在光路显微成像装置5的显微视野下的图片，得到整个待测样本暴露在显微视野下的多张局部位置的图片，实现对待测样本全视野扫描。作为一优选方式，图片获取机构6可以选择2000万高清像素的CCD工业相机，或者是CMOS相机。

在其他部分优选实施例中，X轴移动机构包括第一动力装置11和第一传动系统，第一动力装置11与第一传动系统连接，第一动力装置11驱动第一传动系统在X轴方向移动，第一传动系统带动位移载物台1沿X轴方向移动。

在其他部分优选实施例中，Y轴移动机构包括第二动力装置和第二传动系统，第二动力装置与第二传动系统连接，第二动力装置驱动第二传动系统在Y轴方向移动，第二传动系统带动位移载物台1沿Y轴方向移动。

在其他部分优选实施例中，一种多路荧光全视野扫描成像系统还包括电动控制模块7，电动控制模块7包括第一控制系统和第二控制系统，第一控制系统、第二控制系统的输出端分别与第一动力装置11、第二动力装置的输入端连接；其中，第一控制系统控制第一动力装置11驱动第一传动系统，通过第一传动系统带动位移载物台1及样品托槽2移动，控制样品托槽2在X轴方向的运动位移；第二控制系统控制第二动力装置驱动第二传动系统，通过第二传动系统带动位移载物台及样品托槽2移动，控制样品托槽2在Y轴方向的运动位移，从而调整待测样本暴露在物镜视野内的区域。

作为一优选实施例，电动控制模块7还包括第三控制系统和第四控制系统，第三控制系统用于控制Z轴升降机构8的第三动力装置；第四控制系统用于控制光路切换部件的第四动力装置。

在其他部分优选实施例中，参照图2所示，第一传动系统还包括丝杆14、联轴器13、底板、三个支架12、导轨15和滑块。第一动力装置11的后端连接编码器10，前端通过联轴器13与丝杆14连接，并通过支架12固定于底板上。底板为一水平板。三个支架12分别垂直固定于底板上，起到支撑的作用。丝杆14两侧对称设有导轨15，丝杆14与导轨15两端均套设在与底板连接的支架12上进行固定。丝杆14上旋有与两侧导轨15活动连接的滑块16，滑块16上方与位移载物台1的下部连接，滑块16内部还设有光栅尺17，精确测量位移距离。通过控制第一动力装置11有效改变丝杆14的转动速度，丝杆14转动带动滑块16沿导轨15方向滑动，带动位移载物台1移动，通过控制滑块16的移动距离，使待测样本进行平稳、精准的移动。通过第一动力装置11与第一传动系统中编码器10与光栅尺17的配合，使滑块16位移距离精确度达到10μm级别，并且可以实现绝对位移的距离移动，避免多次移动测量的距离误差累计，从而达到精准的全视野扫描。第二传动系统与上述第一传动系统采用相同结构，省略第二传动系统的结构视图，具体可参照图2所示。

在其他部分优选实施例中，参照图2所示，第一传动系统、第二传动系统结构相同，均包括编码器10和光栅尺17，编码器10对第一动力装置11或第二动力装置的丢步及时检测并作出调整，控制第一动力装置11或第二动力装置的精确转动，从而控制第一传动系统或第二传动系统中的丝杆14的转动和滑块16的位移距离。光栅尺17读头设置于滑块16内，用于测量滑块下光栅尺17记录的位移距离。第二传动系统与本实施例中第一传动系统的结构相同。用于对第二动力装置的丢步及时检测并作出调整，控制第二动力装置的的精确转动，从而控制第二传动系统中的丝杆14的转动和滑块的位移距离。其中，第一传动系统、第二传动系统中的光栅尺17用于测量X轴、Y轴的滑块μm级别的位移距离，并将测量输出信号转换为数字脉冲，数字脉冲信号通过高速计数模块转换为位移量，使位移载物台1在X轴、Y轴方向平移的直线距离从相对位移转变为绝对位移，通过位移载物台1的位移实现对待测样本全视野扫描。第一动力装置11、第二动力装置可以采用电机提供动力，比如步进电机。

在其他部分优选实施例中，参照图3所示，光路显微成像装置5包括明场光源3、物镜、多通道荧光光源4、直角棱镜和镜筒；其中，明场光源3通过杆件支撑于样品托槽2的正上方，位移载物台1通过支撑杆被抬高，明场光源3用于提供明场的LED光源。物镜设置于位移载物台1的正下方。作为一优选，可以采用40倍物镜。多通道荧光光源4设置于物镜的正下方，用以提供荧光场的光源激发。多通道荧光光源4包括荧光光源、荧光聚光镜、激发滤光片、二向色镜和发射滤光片，其中，多通道荧光光源4包括两种或以上的荧光光源的激发器(如激发器一和激发器二)。荧光光源依次透过所述荧光聚光镜、激发滤光片，在二向色镜的转折作用下将激发光投射到待测样本上，形成激发光路；待测样本内的染料吸收激发光后，发射出的发射光经物镜依次穿过二向色镜、发射滤光片形成发射光路。直角反光棱镜设置于多通道荧光光源4下方，用以改变光路方向。光路显微成像装置5的工作原理：当接通明场光源时，荧光光源处于关闭状态，明场光源穿过明场聚光镜投射到待测样本上，形成明场光路；或者当需要接通荧光光源时，会关闭明场光源。荧光光源透过荧光聚光镜及滤光片，在二向色镜的转折作用下将激发光投射到待测样本上。待测样本内的染料吸收激发光后，发射出的发射光经物镜穿过二向色镜、发射滤光片，再经直角反光棱镜90°转折光路，透过成像透镜形成图像，形成荧光场光路。

在其他部分优选实施例中，光路切换部件设置于多通道荧光光源4的正下方，光路切换部件根据荧光染色波段特征进行荧光场的光路切换；光路切换部件可以通过支撑杆固定于整个设备的底板上。在一具体实施例中，光路切换部件可以包括第四传动系统、第四动力装置；其中，第四动力装置的输入端可以与电动控制模块7的第四控制系统的输出端连接，第四动力装置的输出端与第四传动系统的输入端连接。作为一优选方式，第四传动系统可以采用上述第一传动系统的结构实现其功能，将第四传动系统的滑块与多通道荧光光源4的底部连接，通过该滑块带动多通道荧光光源4在水平方向的移动，从而切换多通道荧光光源4的光源通道，实现光源切换。通过光路切换部件，在同一实验过程中可以自由切换多个激发光源，适用于不同荧光染色的待测样本，例如，采用Hoechst、AnnexinV、PI和JC-1染色，可准确判断细胞凋亡情况；采用台盼蓝染色、calcein-AM/draq-7、AO/PI双荧光染色，可判断细胞浓度、活性。

在具体实施时，上述实施例中的明场光源3、多通道荧光光源4、CCD相机6、电动控制模块7、Z轴8分别与直流电源9进行电连接。

在其他部分优选实施例中，一种多路荧光全视野扫描成像系统还包括与光路显微成像装置5的物镜连接Z轴升降机构8，带动物镜在垂直方向发生位移，调节物镜与待测样本之间的距离，起到调整焦距的作用。在一具体实施例中，Z轴升降机构8可以包括第三动力装置以及第三传动系统，第三动力装置的输入端可以与上述实施例中的电动控制模块7的第三控制系统的输出端连接，第三动力装置的输出端与第三传动系统的输出端连接。作为一优选方式，第三传动系统可以采用与上述第一传动系统的相同结构实现其功能，将第三传动系统的滑块与物镜连接，通过该滑块带动物镜沿Z轴方向作直线运动。第三控制系统控制第三动力装置驱动第三传动系统沿Z轴方向移动，从而带动物镜在Z轴方向的发生位移，控制物镜与待测样本之间的距离，起到调整焦距的作用。通过设置与物镜连接的Z轴升降机构8，可以通过控制Z轴升降机构8的位移距离，从而调整物镜与待测样本之间的距离进行自动对焦，调焦范围可以在0-8mm内，精度准确到10μm。

在其他部分优选实施例中，一种多路荧光全视野扫描成像系统还包括自动对焦控制模块，其输入端与Z轴升降机构8的连接，自动对焦控制模块的输出端与照相机连接，通过Z轴升降机构8移动控制照相机在Z轴升降机构8的位移过程中连续拍照，并对位移过程中的连续拍照的多张图像进行分辨率分析，找出最清晰的图像并记录对应图像的拍摄Z轴方向的位置，实现自动对焦过程。

在其他部分优选实施例中，一种多路荧光全视野扫描成像系统还包括定位拍照模块，定位拍照模块的输入端控制机构的输出端连接，定位拍照模块的输出端与图片获取机构6的输入端连接，控制并动态记录待测样本在X轴、Y轴的位置，每移动一显微放大视野的距离(即一个物镜的距离)，图片获取机构6获得待测样本暴露在光路显微成像装置5的显微视野下的照片，得到整个待测样本暴露在显微视野下的多张局部位置的图片。在具体实施时：先在明场光源下，控制待测样本的移动，每次移动一个物镜的距离，保证在明场光源下获得整个待测样本暴露在显微视野下的多张局部位置的图片；然后再切换荧光光源，重复操作，以获得在整个待测样本在荧光光源暴露在显微视野下的多张局部照片。

在其他部分优选实施例中，一种多路荧光全视野扫描成像系统还包括图像拼接模块，图像拼接模块的输入端与图片获取机构6的输出端连接，图像拼接模块将获得的所有图像进行多张图片按拍摄次序进行对齐与拼图，整合为一张完整的全视野图片。作为一优选方式，图像拼接模块可以采用多视野图像拼图中的Stitching算法拼接成为完整的图像。

在其他部分优选实施例中，一种多路荧光全视野扫描成像系统还包括计数模块，计数模块的输入端与图像拼接模块的输出端连接，计数模块根据图像拼接模块获得单细胞悬液在明场光源和不同荧光场下的全视野图片，分别计算单细胞悬液在明场光源下图像、活细胞染料染色下的荧光图像与死细胞染料染色下荧光图像中的细胞个数，并对三份图像进行比对分析，得出单细胞悬液的总细胞数、细胞结团率、双细胞率以及活细胞比率。计算细胞结团率和双细胞率是根据细胞集落后体积明显大于单个细胞的体积来计算。

在一具体实施例中，一种多路荧光全视野扫描成像系统对组织切片进行全视野扫描成像，包括以下步骤：

1、取一石蜡包埋的组织块切片进行HE(苏木精-伊红)染色，苏木精将细胞核染成蓝色，伊红则将细胞浆、肌肉、结缔组织、红细胞染成红色。

2、将染好色的组织切片放入样品托槽2上。

3、通过自动对焦控制模块调整Z轴升降机构8的位移距离进行自动调整焦距，选取清晰度最高的位置进行对焦；然后，在然后在明场光源下，通过位移载物台1在X轴、Y轴方向移动带动样品托槽2中混合液进行定向定距移动并进行拍照，每次移动的距离与显微放大视野相同，获取位移载物台1每次移动后混合液暴露在光路显微成像装置5的显微视野下的图片，得到整个混合液暴露在显微视野下的多张局部位置的图片，拍摄完毕后，再通过图像拼接模块将所拍摄的多张图片进行对齐后拼接成为完整的图像，即得到明场光源下的完整的图像；同时再切换到荧光光源下，重复上述步骤，对待测样本定向定距移动、拍照及拼图，最后，得到荧光光源下的完整的图像。

本实施例避免因图像间出现重叠或缝隙影响细胞空间信息的获得和组织切片完整成像的准确性。

在另一具体实施例中，一种多路荧光全视野扫描成像系统对单细胞悬液进行全视野扫描成像，包括以下步骤：

1、取10μl单细胞悬液，用AO/PI荧光试剂进行染色后，活细胞经AO染色发出绿色荧光，死细胞经PI染色发出红色荧光。

2、将上述步骤中经AO/PI荧光试剂进行染色后的混合液加至待测样本板中，将其置于样品托槽2上。

3、通过自动对焦控制模块调整Z轴升降机构8的位移距离进行自动调整焦距，选取清晰度最高的位置进行对焦；然后，在然后在明场光源下，通过位移载物台1在X轴、Y轴方向移动带动样品托槽2中混合液进行定向定距移动并进行拍照，每次移动的距离与显微放大视野相同，获取位移载物台1每次移动后混合液暴露在光路显微成像装置5的显微视野下的图片，得到整个混合液暴露在显微视野下的多张局部位置的图片，拍摄完毕后，再通过图像拼接模块将所拍摄的多张图片进行对齐后拼接成为完整的图像，即得到明场光源下的完整的图像；同时再切换到荧光光源下，重复上述步骤，对待测样本定向定距移动、拍照及拼图，最后，得到荧光光源下的完整的图像。

4、然后通过计数模块对其进行细胞计数，并根据其染色情况分析细胞浓度、细胞活性。

5、生成结果报告，即可查阅细胞计数的结果以及细胞浓度、细胞活性等信息。

本发明缓解了细胞计数板上局部细胞结团或者混合不均匀导致的细胞计数偏差，通过上述位移载物台1在X轴、Y轴方向移动带动样品托槽2中待测样本移动，实现对待测样本全视野扫描。本发明可避免测量误差的积累，保证位移误差精确到10μm以内。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (13)

1.一种多路荧光全视野扫描成像系统，包括：用于待测样本的多路荧光的显微成像的光路显微成像装置，用于固定待测样本位置的样品托槽；其特征在于，还包括用于承载所述样品托槽的位移载物台，控制机构和图片获取机构；其中，

所述位移载物台包括：

X轴移动机构，所述X轴移动机构带动所述位移载物台沿X轴方向移动；

Y轴移动机构，所述Y轴移动机构带动所述位移载物台沿Y轴方向移动；

所述X轴与所述Y轴位于同一水平面，且该水平面与所述光路显微成像装置的光路垂直；所述位移载物台在X轴、Y轴方向移动带动所述样品托槽中待测样本移动；

所述控制机构，其输出端分别与所述X轴移动机构、所述Y轴移动机构的输入端连接，通过所述X轴移动机构和/或所述Y轴移动机构控制所述位移载物台按照设定路径移动，所述位移载物台每次移动的距离与所述光路显微成像装置的显微放大视野相同，使所述待测样本暴露在显微视野下的移动路径覆盖整个所述待测样本；

所述图片获取机构，设置于所述光路显微成像装置的成像端，获取所述位移载物台每次移动后所述待测样本暴露在所述光路显微成像装置的显微视野下的图片，得到整个所述待测样本暴露在显微视野下的多张局部位置的图片，实现对所述待测样本全视野扫描。

2.根据权利要求1所述的一种多路荧光全视野扫描成像系统，其特征在于，所述X轴移动机构包括第一动力装置和第一传动系统，所述第一动力装置与所述第一传动系统连接，所述第一动力装置驱动所述第一传动系统在X轴方向移动，所述第一传动系统带动所述位移载物台沿X轴方向移动。

3.根据权利要求2所述的一种多路荧光全视野扫描成像系统，其特征在于，所述Y轴移动机构包括第二动力装置和第二传动系统，所述第二动力装置与所述第二传动系统连接，所述第二动力装置驱动所述第二传动系统在Y轴方向移动，所述第二传动系统带动所述位移载物台沿Y轴方向移动。

4.根据权利要求3所述的一种多路荧光全视野扫描成像系统，其特征在于，还包括电动控制模块，所述电动控制模块包括第一控制系统和第二控制系统，所述第一控制系统、所述第二控制系统的输入端与所述控制机构的输出端连接，所述第一控制系统、所述第二控制系统的输出端分别与所述第一动力装置、所述第二动力装置的输入端连接，其中，所述第一控制系统控制所述第一动力装置驱动所述第一传动系统，通过所述第一传动系统带动所述位移载物台及所述样品托槽移动，从而控制所述样品托槽在X轴方向的运动位移；所述第二控制系统控制所述第二动力装置驱动所述第二传动系统，通过所述第二传动系统带动所述位移载物台及所述样品托槽移动，从而控制所述样品托槽在Y轴方向的运动位移，从而调整所述待测样本暴露在所述光路显微成像装置的显微视野内的区域。

5.根据权利要求3所述的一种多路荧光全视野扫描成像系统，其特征在于，所述第一传动系统、所述第二传动系统结构相同，均包括编码器和光栅尺，所述编码器对所述第一动力装置或所述第二动力装置的丢步及时检测并作出调整，所述光栅尺用于测量位移距离，并将测量输出信号转换为数字脉冲，使所述位移载物台在X轴、Y轴方向平移的直线距离从相对位移转变为绝对位移。

6.根据权利要求5所述的一种多路荧光全视野扫描成像系统，其特征在于，所述第一传动系统、所述第二传动系统还包括丝杆、联轴器、底板、支架、导轨和滑块，其中，所述丝杆通过所述支架固定于所述底板上，所述丝杆的一端与所述联轴器的一端连接，所述联轴器的另一端与所述第一动力装置或所述第二动力装置连接；所述导轨设置于所述丝杆的两侧，所述导轨的两端分别与所述支架固定；所述滑块设置于所述丝杆上方，并与两侧的所述导轨活动连接，所述丝杆转动带动所述滑块沿所述导轨方向滑动；所述光栅尺读头设置于所述滑块内，用于测量所述滑块下方的所述光栅尺记录的位移距离。

7.根据权利要求1所述的一种多路荧光全视野扫描成像系统，其特征在于，还包括：与所述光路显微成像装置的物镜连接的Z轴升降机构，所述Z轴升降机构带动所述物镜在垂直方向发生位移，调节所述物镜与所述待测样本之间的距离，实现自动对焦。

8.根据权利要求7所述的一种多路荧光全视野扫描成像系统，其特征在于，还包括：自动对焦控制模块，其输入端与所述Z轴升降机构的连接，所述自动对焦控制模块的输出端与所述图片获取机构的输入端连接，控制所述图片获取机构在所述Z轴升降机构的位移过程中连续拍照，并对位移过程中的连续拍照的多张图像进行分辨率分析，找出最清晰的图像并记录对应图像的拍摄Z轴方向的位置，以实现自动对焦过程。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的一种多路荧光全视野扫描成像系统，其特征在于，所述光路显微成像装置包括明场光源和荧光场光源，能分别得到所述待测样本在明场下、荧光场下的显微成像。

10.根据权利要求9所述的一种多路荧光全视野扫描成像系统，其特征在于，所述荧光场光源包括多通道荧光光源和光路切换部件，所述光路切换部件根据荧光染色波段特征进行荧光场的光路切换，所述光路切换部件设置于所述多通道荧光光源的下方，所述光路切换部件带动所述多通道荧光光源沿水平方向移动，实现荧光场的光路切换。

11.根据权利要求1-8中任一项所述的一种多路荧光全视野扫描成像系统，其特征在于，所述图片获取机构还包括定位拍照模块，所述定位拍照模块的输入端与所述控制机构的输出端连接，控制并动态记录所述待测样本在X轴、Y轴的位置，以使在所述位移载物台每移动一显微放大视野的距离后，对所述待测样本暴露在所述光路显微成像装置的显微视野下形成图像进行拍照。

12.根据权利要求1-8中任一项所述的一种多路荧光全视野扫描成像系统，其特征在于，还包括图像拼接模块，所述图像拼接模块的输入端与所述图片获取机构的输出端连接，所述图像拼接模块将获得的所有图像进行多张图片按拍摄次序进行对齐与拼图，整合为一张完整的全视野图片。

13.根据权利要求12所述的一种多路荧光全视野扫描成像系统，其特征在于，还包括计数模块，所述计数模块的输入端与所述图像拼接模块的输出端连接，所述计数模块根据所述图像拼接模块获得所述单细胞悬液在明场光源和不同荧光场下的所述全视野图片，分别计算所述单细胞悬液在明场光源下图像、活细胞染料染色下的荧光图像与死细胞染料染色下荧光图像中的细胞个数，并对三份图像进行比对分析，得出所述单细胞悬液的总细胞数、细胞结团率、双细胞率以及活细胞比率。

Images