CN113884489A - 一种光栅尺辅助定位的厚液层细胞自动显微成像方法 - Google Patents

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Abstract

本发明是一种光栅尺辅助定位的厚液层细胞自动显微成像方法，该方案首先利用图像融合方法和串口通信完成上位机程序的编写，然后利用光栅尺参考零位脉冲信号实现系统回到零点，之后使用光栅尺差分信号定位控制电机驱动显微镜载物台运动至前景平面Z0和后景平面Z1并控制相机拍照，实现对厚液层细胞的自动聚焦，多次拍摄和融合，最后利用基于小波变换的多聚焦图像融合方法，提取出待融合图像的低频分量A和细节分量H、V、D，根据融合规则将多幅图像融合为一幅清晰的细胞图像。本发明将光学定位器件光栅尺与显微镜相结合，利用光栅尺的定位和零点功能开发出一种新型的自动调焦智能显微镜。与人工镜检方法相比，促进了科研人员和生物医疗工作者方便快捷地分析科研和医疗进程中获取的生物样本。将自动化方法融入科研工作过程中，得到准确、科学的细胞图像。

Description

一种光栅尺辅助定位的厚液层细胞自动显微成像方法
技术领域
本发明属于数字图像处理领域和运动控制领域，具体体现为利用光栅尺、步进电机及其驱动器和相机等硬件系统完成图像采集，最终利用数字图像处理技术实现多聚焦细胞图像融合的方法。
技术背景
但在信息化时代，出于大批量样本和数据处理的需要，显微镜的人工调焦突显出效率低下，聚焦准确性不足的缺点。而且，对于具有一定深度液层中的细胞，传统的一次聚焦方法难以对所有细胞准确成像，往往需要多次复杂的对焦过程。由于人工操作显微镜费时费力，一些自动化检测设备应运而生。如今利用上述自动化检测设备进行体外检测的观察方法有两种：以流式细胞术为主要技术的间接观察法和利用数码相机采集图像的直接观察法。间接观察法的流式细胞术需要将样品处理成单细胞悬液，但这种方法不能直接观察细胞的形态特征。因此，不可能检测到单个细胞的具体结构。近年来，人们提出了基于图像的被动聚焦方法来获取清晰的显微镜图像。但是，这些方法只能聚焦在特定的单一层上，所以在自动聚焦之前，样品需要重新处理，让细胞处于同一水平面上，这样的预处理步骤使得医学以及科研工作复杂度大大增加。
随着数字图像处理技术的不断发展和工业控制精度的提高，以光栅尺作为定位元件，步进电机和相机实现自动化获取图像，利用数字图像处理领域的多聚焦图像融合技术完成厚液层细胞检测的方法成为了可能。针对厚液层细胞难以单次准确成清晰像的问题，可以通过上位机编程，利用硬件系统自动获取多幅图像，最终完成图像融合，得到一幅完整而清晰的细胞图像，实现快速而精确的体外诊断。
发明内容
本发明主要针对目前对细胞检测中存在的问题：细胞在检测前需要十分复杂的预处理步骤，例如制成涂片、定型和烘干等，因而需要专业人员的协作才能够最终完成细胞成像后的定量定性分析，而且传统的厚液层镜检模式以人工操作为主，在检测时间上消耗较大的同时，显微镜成像精度又无法保证，设计了一种光栅尺辅助定位的厚液层细胞自动显微成像系统，提出了多聚焦细胞图像的合成方案，以此达到快速、精确、低成本实现厚液层细胞镜检的目的。
本发明技术方案是一种光栅尺辅助定位的厚液层细胞自动显微成像方法，该方法包括以下步骤：
步骤1：获取细胞样本，并进行稀释处理；
步骤2：将步骤1中稀释得到的细胞样本注入具有一定深度的计数池并加以保存；
步骤3：搭建显微镜成像系统，该部分硬件包括光源、物镜、显微镜主体和相机；
步骤4：搭建显微镜载物台自动运动系统，该部分硬件包括步进电机和驱控一体的步进电机驱动器；
步骤5：在显微镜的移动部(载物台)下方安装玻璃制光栅尺，在显微镜的固定部(镜座)上安装与光栅尺相配套的读数头；
步骤6：连通24V电源为步进电机驱动器供电，打开显微镜载物台底部光源，启动上位机程序完成初始化；
步骤7：将步骤2中制备的细胞样本计数池静置3分钟后放置于显微镜载物台物镜视野正中央处，并在计数池上方滴香柏油，以便油浸物镜工作；
步骤8：步进电机开始运动，运动过程中找到光栅尺提供的参考零位时立即停止运动，此时的位置即系统零点O；
步骤9：从步骤8结束后系统所在位置开始，操作上位机程序驱动步进电机联动载物台向细胞所在区域方向继续运动，当相机视野第一次中出现明亮、较清晰的细胞图像时停止，该处即为细胞前景平面Z0；
步骤10：将步骤9过程中步进电机驱动器采集到的光栅尺差分信号周期数反馈至计算机，结合光栅尺的栅距计算得到系统零点到细胞前景平面的物理距离L0；
步骤11：从细胞前景平面继续驱动步进电机联动载物台沿z轴运动，当相机视野最后一次中出现明亮、较清晰的细胞图像时停止，该处即为细胞后景平面Z1；
步骤12：将步骤11过程中步进电机驱动器采集到的光栅尺差分信号周期数反馈至计算机，计算得到前景平面到后景平面的物理距离L1；
步骤13：操作上位机程序控制步进电机回到系统零点O；
步骤14：点击“自动拍照”按钮，系统在细胞深度区域自动运行期间拍摄3幅等距离间隔的细胞图像P1、P2、P3，最后自动返回系统零点O；
步骤15：启动图像融合软件，对细胞图像P1、P2进行基于小波变换的多聚焦图像融合；
步骤16：对步骤15中得到的融合图像与细胞图像P3进行图像融合，得到最终的厚液层细胞融合图像并输出。
其中，步骤3的具体步骤为：
步骤3-1：选用100倍油浸物镜，置于显微镜物镜转换器的工作位置；
步骤3-2：将光源安装在显微镜底部镜座，使其光线向正上方照射；
步骤3-3：将相机与显微镜目镜顶端螺纹螺旋连接，其USB线与计算机相连，负责供电和传输图像数据流；
其中，步骤4的具体步骤为：
步骤4-1：将驱动器的A+A-B-B+四个电机接口与步进电机相连接；
步骤4-2：将驱动器的RS485通信的信号线转接USB接口连接至计算机，构建串口通信通道；
步骤4-3：用传送带将电机转轴与调焦旋钮实现联动，带动载物台运动；
其中，步骤6的具体步骤为：
步骤6-1：使用24V稳压电源接入驱动器的VCC+和GND为驱动器供电，同时利用驱动器的5V输出和传感器C1+、C1-与光栅尺的供电线和信号线相连，分别实现供电和光栅尺差分信号的采集；
步骤6-2：打开底部光源；
步骤6-3：启动上位机程序，搜索驱动器所占用的串口并打开，之后通过串口通信使能步进电机；
步骤6-4：点击相机控制模块的“开始”按钮，获取相机传来的视频流并显示在界面上；
步骤6-5：点击“一键白平衡”按钮，自动调节曝光时间、色温和色彩，将橙黄色的背景转化为白色背景；
其中，步骤14中自动拍照的具体步骤为：
步骤14-1：步进电机联动载物台移动L0至前景平面Z0；
步骤14-2：等待2秒，期间发出指令，控制相机在前景平面拍摄图片P1；
步骤14-3：移动L1/2，控制相机拍摄图片P2；
步骤14-4：再次移动L1/2，在后景平面Z1拍摄图片P3；
步骤14-5：控制电机移动至步骤8中标定的系统零点O；
其中，步骤15的具体步骤为：
步骤15-1：分别对图像P1、P2进行2层小波变换，小波基函数选取Haar小波，提取出各层小波分解系数C1、C2和各层分解系数长度S1、S2；
步骤15-2：根据C1、C2提取出小波分解的低频分量A1、A2，取平均值A作为融合图像的低频分量；
步骤15-3：根据C1、C2提取出小波分解在三个方向上的细节分量：H1、H2、V1、V2、D1、D2。其中H代表水平分量，V代表垂直分量、D代表对角线方向分量；
步骤15.4：设定阈值T＝0.7，分别计算H1和H2，V1和V2，D1和D2的匹配度，若匹配度大于阈值T，则说明局部能量比较接近，采取加权平均的融合方法；若匹配度小于阈值T，说明两幅图像对应局部能量相差较大，选取局部区域能量较大的小波系数作为融合图像的小波系数；
步骤15-5：基于步骤15.4的规则可以得到融合图像的细节分量H、V、D；
步骤15.6：根据以上步骤中得到的低频分量A和细节分量H、V、D重构图像，即得到融合图像；
本发明是一种光栅尺辅助定位的厚液层细胞自动显微成像方案，该方案首先利用图像融合方法串口通信完成上位机程序的编写，然后使用光栅尺定位并控制电机驱动显微镜载物台运动和相机拍照，实现对厚液层细胞的自动聚焦，多次拍摄和融合，最后利用基于小波变换的多聚焦图像融合方法将多幅图像融合为一幅清晰的细胞图像。本发明开发出一种光栅尺辅助定位的新型自动调焦智能显微镜，与人工镜检方法相比，促进了科研人员和生物医疗工作者方便快捷地分析科研和医疗进程中获取的生物样本。将自动化方法融入科研工作过程中，得到准确、科学的细胞图像。
附图说明
图1是本发明的实物结构示意图。
图2是控制硬件的上位机程序界面。
图3是自动拍照功能流程图。
图4是图像融合软件界面。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明中一种光栅尺辅助定位的厚液层细胞自动显微成像方案进行详细说明：
步骤1：获取细胞样本，并进行稀释处理；
步骤2：将步骤1中稀释得到的细胞样本注入具有一定深度的计数池并加以保存；
步骤3：搭建显微镜成像系统，该部分硬件包括光源、物镜、显微镜主体和相机；
步骤3-1：选用100倍油浸物镜，置于显微镜物镜转换器的工作位置；
步骤3-2：将光源安装在显微镜底部镜座，使其光线向正上方照射；
步骤3-3：将相机与显微镜目镜顶端螺纹螺旋连接，其USB线与计算机相连，负责供电和传输图像数据流；
步骤4：搭建显微镜载物台自动运动系统，该部分硬件包括步进电机和驱控一体的步进电机驱动器，步进电机负责驱动显微镜载物台沿z轴运动；
步骤4-1：将驱动器的A+A-B-B+四个电机接口与步进电机相连接；
步骤4-2：将驱动器的RS485通信的信号线转接USB接口连接至计算机，构建串口通信通道；
步骤4-3：用传送带将电机转轴与调焦旋钮实现联动，带动载物台运动；
步骤5：在显微镜的移动部(载物台)下方安装玻璃制光栅尺，在显微镜的固定部(镜座)上安装与光栅尺相配套的读数头。二者的安装应当严格平行相对，在之后的检测过程中起到提供系统参考零位和反馈当前位置速度的作用；
步骤6：连通24V电源为步进电机驱动器供电，打开显微镜载物台底部光源，启动上位机程序完成初始化；
步骤6-1：使用24V稳压电源接入驱动器的VCC+和GND为驱动器供电，同时利用驱动器的5V输出和传感器C1+、C1-与光栅尺的供电线和信号线相连，分别实现供电和光栅尺差分信号的采集；
步骤6-2：打开底部光源；
步骤6-3：启动上位机程序，搜索驱动器所占用的串口并打开，之后通过串口通信使能步进电机；
步骤6-4：点击相机控制模块的“开始”按钮，获取相机传来的视频流并显示在界面上；
步骤6-5：点击“一键白平衡”按钮，自动调节曝光时间、色温和色彩，将橙黄色的背景转化为白色背景；
步骤7：将步骤2中制备的细胞样本计数池静置3分钟后放置于显微镜载物台物镜视野正中央处，确保底部光源发出的光透过样本入射进显微镜物镜内，并在计数池上方滴香柏油，以便油浸物镜工作；
步骤8：操作上位机程序，点击“归零运动”按钮使驱动器向步进电机发送运动指令。运动过程中接收到来自光栅尺的上升沿脉冲信号，即到达了其提供的参考零位时，立即停止运动，此时的位置即系统零点O；
步骤9：从步骤8结束后系统所在位置开始，操作上位机程序驱动步进电机联动载物台向细胞所在区域方向继续运动，当相机视野第一次中出现明亮、较清晰的细胞图像时停止，该处即为细胞前景平面Z0；
步骤10：将步骤9过程中步进电机驱动器采集到的光栅尺差分信号周期数反馈至计算机，结合光栅尺的栅距计算得到系统零点到细胞前景平面的物理距离L0；
步骤11：从细胞前景平面继续驱动步进电机联动载物台沿z轴运动，当相机视野最后一次中出现明亮、较清晰的细胞图像时停止，该处即为细胞后景平面Z1；
步骤12：将步骤11过程中步进电机驱动器采集到的光栅尺差分信号周期数反馈至计算机，计算得到前景平面到后景平面的物理距离L1；
步骤13：操作上位机程序控制步进电机回到系统零点O；
步骤14：将L0、L1参数写入上位机程序“自动拍照”功能中，然后点击“自动拍照”按钮，步进电机联动载物台自动运动至细胞前景平面Z0，之后遍历Z0到Z1之间的深度区域，期间拍摄3幅等距离间隔的细胞图像P1、P2、P3，最后自动返回系统零点O；
步骤14-1：步进电机联动载物台移动L0至前景平面Z0；
步骤14-2：等待2秒，期间发出指令，控制相机在前景平面拍摄图片P1；
步骤14-3：移动L1/2，控制相机拍摄图片P2；
步骤14-4：再次移动L1/2，在后景平面Z1拍摄图片P3；
步骤14-5：控制电机移动至步骤8中标定的系统零点O；
步骤15：启动图像融合软件，对细胞图像P1、P2进行基于小波变换的多聚焦图像融合；
步骤15-1：分别对图像P1、P2进行2层小波变换，小波基函数选取Haar小波，提取出各层小波分解系数C1、C2和各层分解系数长度S1、S2；
步骤15-2：根据C1、C2提取出小波分解的低频分量A1、A2，取平均值A作为融合图像的低频分量；
步骤15-3：根据C1、C2提取出小波分解在三个方向上的细节分量：H1、H2、V1、V2、D1、D2。其中H代表水平分量，V代表垂直分量、D代表对角线方向分量；
步骤15.4：设定阈值T＝0.7，分别计算H1和H2，V1和V2，D1和D2的匹配度，若匹配度大于阈值T，则说明局部能量比较接近，采取加权平均的融合方法；若匹配度小于阈值T，说明两幅图像对应局部能量相差较大，选取局部区域能量较大的小波系数作为融合图像的小波系数；
步骤15-5：基于步骤15.4的规则可以得到融合图像的细节分量H、V、D；
步骤15.6：根据以上步骤中得到的低频分量A和细节分量H、V、D重构图像，即得到融合图像；
步骤16：对步骤15中得到的融合图像与细胞图像P3进行图像融合，得到最终的厚液层细胞融合图像并输出。

Claims (6)

1.一种光栅尺辅助定位的厚液层细胞自动显微成像方法，该方法包括以下步骤：
步骤1：获取细胞样本，并进行稀释处理；
步骤2：将步骤1中稀释得到的细胞样本注入具有一定深度的计数池并加以保存；
步骤3：搭建显微镜成像系统，该部分硬件包括光源、物镜、显微镜主体和相机；
步骤4：搭建显微镜载物台自动运动系统，该部分硬件包括步进电机和驱控一体的步进电机驱动器，步进电机负责驱动显微镜载物台沿z轴运动；
步骤5：在显微镜的移动部(载物台)下方安装玻璃制光栅尺，在显微镜的固定部(镜座)上安装与光栅尺相配套的读数头。二者的安装应当严格平行相对，在之后的检测过程中起到提供系统参考零位和反馈当前位置速度的作用；
步骤6：连通24V电源为步进电机驱动器供电，打开显微镜载物台底部光源，启动上位机程序完成初始化；
步骤7：将步骤2中制备的细胞样本计数池静置3分钟后放置于显微镜载物台物镜视野正中央处，确保底部光源发出的光透过样本入射进显微镜物镜内，并在计数池上方滴香柏油，以便油浸物镜工作；
步骤8：操作上位机程序，点击“归零运动”按钮使驱动器向步进电机发送运动指令。运动过程中接收到来自光栅尺的上升沿脉冲信号，即到达了其提供的参考零位时，立即停止运动，此时的位置即系统零点O；
步骤9：从步骤8结束后系统所在位置开始，操作上位机程序驱动步进电机联动载物台向细胞所在区域方向继续运动，当相机视野第一次中出现明亮、较清晰的细胞图像时停止，该处即为细胞前景平面Z0；
步骤10：将步骤9过程中步进电机驱动器采集到的光栅尺差分信号周期数反馈至计算机，结合光栅尺的栅距计算得到系统零点到细胞前景平面的物理距离L0；
步骤11：从细胞前景平面继续驱动步进电机联动载物台沿z轴运动，当相机视野最后一次中出现明亮、较清晰的细胞图像时停止，该处即为细胞后景平面Z1；
步骤12：将步骤11过程中步进电机驱动器采集到的光栅尺差分信号周期数反馈至计算机，计算得到前景平面到后景平面的物理距离L1；
步骤13：步进电机回到系统零点O；
步骤14：将L0、L1参数写入上位机程序“自动拍照”功能中，然后自动拍照，步进电机联动载物台自动运动至细胞前景平面Z0，之后遍历Z0到Z1之间的深度区域，期间拍摄3幅等距离间隔的细胞图像P1、P2、P3，最后自动返回系统零点O；
步骤15：启动图像融合软件，对细胞图像P1、P2进行基于小波变换的多聚焦图像融合；
步骤16：对步骤15中得到的融合图像与细胞图像P3进行图像融合，得到最终的厚液层细胞融合图像并输出。
2.如权利要求1所述的一种光栅尺辅助定位的厚液层细胞自动显微成像方案，其特征在于步骤3的具体步骤为：
步骤3-1：选用100倍油浸物镜，置于显微镜物镜转换器的工作位置；
步骤3-2：将光源安装在显微镜底部镜座，使其光线向正上方照射；
步骤3-3：将相机与显微镜目镜顶端螺纹螺旋连接，其USB线与计算机相连，负责供电和传输图像数据流。
3.如权利要求1所述的一种光栅尺辅助定位的厚液层细胞自动显微成像方案，其特征在于步骤4的具体步骤为：
步骤4-1：将驱动器的A+A-B-B+四个电机接口与步进电机相连接；
步骤4-2：将驱动器的RS485通信的信号线转接USB接口连接至计算机，构建串口通信通道；
步骤4-3：用传送带将电机转轴与调焦旋钮实现联动，带动载物台运动。
4.如权利要求1所述的一种光栅尺辅助定位的厚液层细胞自动显微成像方案，其特征在于步骤6的具体步骤为：
步骤6-1：使用24V稳压电源接入驱动器的VCC+和GND为驱动器供电，同时利用驱动器的5V输出和传感器C1+、C1-与光栅尺的供电线和信号线相连，分别实现供电和光栅尺差分信号的采集；
步骤6-2：打开底部光源；
步骤6-3：启动上位机程序，搜索驱动器所占用的串口并打开，之后通过串口通信使能步进电机；
步骤6-4：点击相机控制模块的“开始”按钮，获取相机传来的视频流并显示在界面上；
步骤6-5：点击“一键白平衡”按钮，自动调节曝光时间、色温和色彩，将橙黄色的背景转化为白色背景。
5.如权利要求1所述的一种光栅尺辅助定位的厚液层细胞自动显微成像方案，其特征在于步骤14的具体步骤为：
步骤14-1：步进电机联动载物台移动L0至前景平面Z0；
步骤14-2：等待2秒，期间发出指令，控制相机在前景平面拍摄图片P1；
步骤14-3：移动L1/2，控制相机拍摄图片P2；
步骤14-4：再次移动L1/2，在后景平面Z1拍摄图片P3；
步骤14-5：控制电机移动至步骤8中标定的系统零点O。
6.如权利要求1所述的一种光栅尺辅助定位的厚液层细胞自动显微成像方案，其特征在于步骤15的具体步骤为：
步骤15-1：分别对图像P1、P2进行2层小波变换，小波基函数选取Haar小波，提取出各层小波分解系数C1、C2和各层分解系数长度S1、S2；
步骤15-2：根据C1、C2提取出小波分解的低频分量A1、A2，取平均值A作为融合图像的低频分量；
步骤15-3：根据C1、C2提取出小波分解在三个方向上的细节分量：H1、H2、V1、V2、D1、D2；其中H代表水平分量，V代表垂直分量、D代表对角线方向分量；
步骤15.4：设定阈值T＝0.7，分别计算H1和H2，V1和V2，D1和D2的匹配度，若匹配度大于阈值T，则说明局部能量比较接近，采取加权平均的融合方法；若匹配度小于阈值T，说明两幅图像对应局部能量相差较大，选取局部区域能量较大的小波系数作为融合图像的小波系数；
步骤15-5：基于步骤15.4的规则可以得到融合图像的细节分量H、V、D；
步骤15.6：根据以上步骤中得到的低频分量A和细节分量H、V、D重构图像，即得到融合图像。
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