CN111363817A - 基于hoxd12基因的肺癌诊断剂及试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药领域，涉及一种肺癌检测/诊断试剂和试剂盒，所述的试剂或试剂盒包括针对HOXD12基因甲基化的检测试剂，用于检测HOXD12基因经亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐或肼盐修饰后的序列。本发明的试剂经试验证实，可以高灵敏、高特异地检测和诊断肺癌，有极高的临床应用价值。

Description

基于HOXD12基因的肺癌诊断剂及试剂盒
技术领域
本发明属于基因诊断领域，更具体地，本发明涉及一种用于肺癌检测的人HOXD12基因甲基化的检测/诊断试剂以及含有该试剂的试剂盒。
背景技术
肺癌是起源于支气管粘膜、腺体或肺泡上皮的肺部恶性肿瘤。按照病理类型可以分为：1)小细胞肺癌(small cell lung cancer，SCLC)：一种特殊病理学类型的肺癌，有明显的远处转移倾向，预后较差，但多数病人对放化疗敏感；2)非小细胞肺癌(non-smallcell lung cancer，NSCLC)：除小细胞肺癌以外其他病理学类型的肺癌，包括鳞状细胞癌、腺癌、大细胞癌等。在生物学行为和临床病程方面具有一定差异。按照发生位置又可以分为：1)中心型肺癌(central lung cancer)：生长在肺段支气管开口及以上的肺癌；2)周围型肺癌(peripheral lung cancer)：生长在肺段支气管开口以远的肺癌。
近年来，人口老龄化、大气污染及吸烟等因素的影响，致使中国肺癌的发病率和死亡率逐年递增，根据国家癌症中心发布的《2017中国肿瘤登记年报》显示，全国每分钟约7人确诊患癌，其中肺癌发病率与死亡率均为第一位。中国已成为世界上肺癌人数最多的国家，专家预测到2025年中国肺癌的人数将达到100万。而根据流行病学研究显示：吸烟是引起肺癌的重要因素。世界上约80％-90％的肺癌可归因于吸烟。与非吸烟者相比，45-64岁每日吸香烟1-19支和20支以上者患肺癌的相对危险度分别为4.27和8.61，与从不吸烟者比较，长期每日吸烟1-19支和20支以上者死于肺癌的相对危险度分别为6.14和10.73。虽然肺癌的治疗技术日新月异，但5年生存率从4％仅上升至12％左右，现有的抗肿瘤药物仍只能起到缓解病情作用，患者无进展生存期平均仅延长3个月～5个月，但对于Ⅰ期肺癌患者，手术后5年生存率高达约60％～70％。因此肺癌的早期诊断与早期手术是提高肺癌5年生存率、降低死亡率最有效的方法之一。
肺癌目前的临床辅助诊断主要有以下几种，但是他们都不能完全做到早发现，早诊断：
(1)血液生化检查：对于原发性肺癌，目前无特异性血液生化检查。肺癌病人血液碱性磷酸酶或血钙升高考虑骨转移的可能，血液碱性磷酸酶、谷草转氨酶、乳酸脱氢酶或胆红素升高考虑肝转移的可能。
(2)肿瘤标志物检查：1)CEA：30％～70％肺癌患者血清中有异常高水平的CEA，但主要见于较晚期肺癌患者。目前血清中CEA的检查主要用于估计肺癌预后以及对治疗过程的监控。2)NSE：是小细胞肺癌首选标志物，用于小细胞肺癌的诊断和监测治疗反应，根据检测方法和使用试剂的不同，参考值不同。3)CYFRA21-1：是非小细胞肺癌的首选标记物，对肺鳞癌诊断的敏感性可达60％，根据检测方法和使用试剂的不同，参考值不同。
(3)影像学检查：1)胸部X线检查：应包括胸部正位和侧位片。在基层医院，胸部正侧位片仍是肺癌初诊时最基本和首选的影像诊断方法。一旦诊断或疑诊肺癌，即行胸部CT检查。2)CT检查：胸部CT是肺癌的最常用和最重要的检查方法，用于肺癌的诊断与鉴别诊断、分期及治疗后随诊。CT引导下肺穿刺活检是肺癌的重要诊断技术，有条件的医院可将其用于难以定性的肺内病变的诊断，以及临床诊断肺癌需经细胞学、组织学证实而其它方法又难以取材的病例。近年来，多层螺旋CT和低剂量CT(LDCT)是发现早期肺癌和降低死亡率的有效筛查工具，全美国家肺癌筛查研究(NLST)已经表明LDCT相比胸部X线筛查可降低20％肺癌的死亡率。低剂量螺旋CT被推荐为早期肺癌筛查的重要手段，但是人为影响因素较多，假阳性率非常高。3)超声检查：主要用于发现腹部重要器官及腹腔、腹膜后淋巴结有无转移，也用于颈部淋巴结的检查。对于贴邻胸壁的肺内病变或胸壁病变，可鉴别其囊实性及进行超声引导下穿刺活检；超声还常用于胸水抽取定位。4)骨扫描：对肺癌骨转移检出的敏感性较高，但有一定的假阳性率。可用于以下情况：肺癌的术前检查；伴有局部症状的病人。
(4)其它检查：1)痰细胞学检查：目前肺癌简单方便的无创诊断方法，连续涂片检查可提高阳性率约达60％，是可疑肺癌病例的常规诊断方法。2)纤维支气管镜检查：肺癌诊断中最重要的手段之一，对于肺癌的定性定位诊断和手术方案的选择有重要的作用。对拟行手术治疗的患者为必需的常规检查项目。而经支气管镜穿刺活检检查(TBNA)，虽利于治疗前分期，但因技术难度和风险较大，有需要者应转上级医院进一步检查。3)其他：如经皮肺穿刺活检、胸腔镜活检、纵隔镜活检、胸水细胞学检查等，在有适应证的情况下，可根据现有条件分别采用以协助诊断。
在临床实践工作中证明，任何肺癌筛查项目的成败取决于高危人群的识别，融合多重高危因素的风险预测模型已被世界公认是识别肺癌高危人群的方法之一。随着技术的飞速发展，肿瘤标志物检测成为继影像学诊断，病理诊断之后的肿瘤诊断治疗新领域，能够对肿瘤的诊断，检测，治疗产生重大的影响。肿瘤标志物可以在体液或者是组织中检测到，能够反映肿瘤的存在，分化程度，预后估计和个性化用药以及治疗效果等。早期肺癌患者没有明显的症状，难以被医生和患者察觉，再加之其在血液或生化项目上没有明显的特异性的标识物，因此难以通过常规的诊断方法进行早期发现和早期诊断，因此对肺癌早期诊断，尤其是大规模应用人群筛查上较为困难。
越来越多的研究表明，在肿瘤形成过程中包含两大类机制。一个是通过DNA核苷酸序列改变而形成突变，即遗传学机制。肿瘤作为一种遗传学疾病在分子生物学领域已经得到证实。另外一个就是表观遗传学(epigenetics)机制，即不依赖DNA序列改变导致基因表达水平的变化，它在肿瘤形成过程中的作用越来越受到重视。遗传学与表观遗传学两种机制相互交叉存在，共同促进了肿瘤的形成。基因的异常甲基化在肿瘤发生的早期就可出现，并且在肿瘤逐步发展的过程中，基因异常甲基化的程度增加。对常见的98种人类原发肿瘤的基因组进行分析，发现每种肿瘤至少有600个异常甲基化的CpG岛。
许多研究显示启动子异常甲基化在许多肿瘤的发生过程中是一个频发的早期事件，因此肿瘤相关基因的甲基化状态是肿瘤发生的一个早期敏感指标，被认为是一种有前景的肿瘤分子生物标志物(biomarker)。更为重要的是，癌变细胞可以释放DNA到外周血中。正常人外周血中都存在纳克级的游离DNA。研究发现外周血血浆/血清、肿瘤累及器官相关的体液(如唾液、痰等)中同样可以检测到肿瘤组织中存在的肿瘤相关基因的启动子异常甲基化。这些生物样品比较容易获得，并且通过PCR技术将其中的DNA进行大量的扩增后能够很灵敏的检测到，因此检测其中某些肿瘤相关基因的启动子区甲基化状态，可以为肿瘤的早期诊断提供非常有价值的信息。与其它类型的肿瘤分子标记物相比，检测启动子异常甲基化有更多的优点。某一基因在不同类型肿瘤中，其启动子异常甲基化的区域是相同的，检测比较方便；另外与等位基因缺失这样的标志物相比，异常甲基化是一个阳性信号，很容易与正常组织中的阴性背景区分。Esteller等检测了22例非小细胞肺癌(NSCLC)的肿瘤组织和血清中p16、DAPK、GSTP1及MGM T等基因的启动子区异常甲基化状态，发现68％(15/22)的肿瘤组织中存在至少一种基因的启动子甲基化；而在15例组织阳性病例中，有11例同时在血清中也检测到了启动子异常甲基化的存在。另有许多研究者也分别从肝癌、头颈部癌、食管癌及结肠癌患者的肿瘤组织和血清中同时检测出了某些肿瘤相关基因的启动子甲基化。Palmisano等检测了21例肺鳞癌患者的肿瘤组织和痰液中p16、MGMT启动子异常甲基化情况，发现所有痰样品中都存在一种或两种基因的启动子区异常甲基化。其中10例痰样是在肿瘤确诊后采集的；另11例痰样来自有吸烟史或其它暴露的高危人群，这11例监测对象在随后5～35月都被确诊为肺癌。而这21例痰样经痰细胞形态学检验为阳性的仅有4例。因此检测基因启动子区异常甲基化是一个非常敏感的指标。这些研究结果表明：DNA甲基化的检测可以作为癌症的早期症断和风险评估的手段。
早期肺癌患者往往无明显的症状和体征，很容易被患者忽视，很少因症就诊。临床常规的胸片X光和痰脱落细胞学检查远远达不到筛查早期肺癌的要求，均未被证实能降低死亡率。胸部X线的筛查漏检率可高达54％-90％，痰脱落细胞学检查虽然成本低，不需要昂贵设备，但是漏检率高，结果判断的人为因素干扰较多，而且需要多次送检。低剂量螺旋CT被推荐为早期肺癌筛查的重要手段，但是人为影响因素较多，假阳性率非常高。
目前，有很多研究检测血液，痰液，肺泡灌洗液中的细胞或者DNA甲基化状态，以期找到用于肺癌早期诊断的标志物。尽管现有技术中已经发现了一些基因的DNA甲基化与肺癌相关，但是目前本领域中仍然需要进一步研究能够切实地应用的于肺癌诊断的相关基因，以及开发出具有较高检测准确性的检测试剂。
发明内容
本发明的目的在于提供一种HOXD12基因的核酸片段在制备肿瘤检测/诊断试剂或试剂盒中的应用。
本发明的另一个目的在于提供一种引物对在制备肿瘤检测/诊断试剂或试剂盒中的应用。
本发明的另一个目的在于提供一种探针在制备肿瘤检测/诊断试剂或试剂盒中的应用。
本发明的进一步目的在于提供一种诊断人HOXD12基因甲基化的试剂、试剂盒和方法。
本发明的进一步目的在于提供一种特异性强、敏感度高的肺癌检测/诊断试剂和试剂盒。
本发明的进一步目的在于提供一种对肺癌应用范围广的肺癌检测/诊断试剂和试剂盒。
本发明的进一步目的在于提供一种使用方便的肺癌检测/诊断试剂和试剂盒。
本发明的上述目的通过以下技术手段实现：
一方面，本发明提供了一种核酸片段在制备肿瘤检测/诊断试剂或试剂盒中的应用。其中，所述的核酸片段来源于HOXD12基因，具体来源于HOXD12基因2号染色体176964062至176965509之间。
具体地，所述的核酸片段选自SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：21、。作为本发明中优选的实施方式，所述的核酸片段选自SEQ ID NO：19。
另一方面，本发明还提供了一种引物对，所述的引物对选自SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：2，SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：31和SEQID NO：32，SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：35，SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：44，SEQ ID NO：46和SEQ ID NO：47，SEQ ID NO：49和SEQ ID NO：50中所示的任意一对；优选地，所述的引物选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：31和SEQ IDNO：32，SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：35，SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：43和SEQID NO：44所示的引物对；更优选地，所述的引物选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，SEQ IDNO：25和SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32，SEQID NO：34和SEQ ID NO：35，SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38所示的引物对；。作为本发明中优选的实施方式，所述的引物选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。
另一方面，本发明还提供了一种探针，所述的探针选自SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：42、SEQ IDNO：45、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：51、中任一所示；优选地，所述的探针选自SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：45中任一所示；更优选地，所述的探针选自SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：33、SEQID NO：36、SEQ ID NO：39中任一所示。作为本发明中优选的实施方式，所述的核酸探针选自SEQ ID NO：3。
另一方面，本发明还提供了上述的引物对或者探针在制备肿瘤检测/诊断试剂或试剂盒中的应用。
另一方面，本发明提供了一种肿瘤检测/诊断试剂，该试剂含有HOXD12基因的甲基化检测试剂。
HOXD12基因，属于同源异型盒(homeobox)家族的D基因群，位于人类2号染色体176964062至176965509之间。
甲基化的发生是胞嘧啶上多了一个甲基，经过经亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐或肼盐处理后，胞嘧啶会变成脲嘧啶，因为在进行PCR扩增时尿嘧啶与胸腺嘧啶相似而会被识别为胸腺嘧啶，体现在PCR扩增序列上就是没有发生甲基化的胞嘧啶变成了胸腺嘧啶(C变成T)，甲基化的胞嘧啶(C)则不会发生变化。PCR检测甲基化基因的技术通常为MSP，针对处理后的甲基化片段(即片段中未改变的C)设计引物，进行PCR扩增，如果有扩增则说明发生了甲基化，无扩增则没有甲基化。
进一步地，HOXD12基因的甲基化检测试剂检测的是HOXD12基因经亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐或肼盐修饰后的序列。
作为一种示范性的实施方式，检测HOXD12基因经亚硫酸氢盐修饰后的序列。
作为优选的实施方式，试剂所针对HOXD12基因的检测区域选自如SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：21所示；更为优选以SEQ ID NO：19作为检测区域。
本发明的试剂中，含有扩增引物。
作为优选的实施方式，所述的引物如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32，SEQ IDNO：34和SEQ ID NO：35，SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：41，SEQID NO：43和SEQ ID NO：44，SEQ ID NO：46和SEQ ID NO：47，SEQ ID NO：49和SEQ ID NO：50中所示的任意一对；优选地，所述的引物选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32，SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：35，SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：44所示的引物对；更优选地，所述的引物选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：25和SEQ IDNO：26，SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32，SEQ ID NO：34和SEQID NO：35，SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38所示的引物对；。作为本发明中优选的实施方式，所述的引物选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。
所述的引物用于扩增HOXD12基因的特定区域。本领域公知，引物的成功设计对于PCR是至关重要。相对于一般的PCR，在基因的甲基化检测中，引物的设计影响更为关键，这是由于甲硫化反应促使DNA链中的“C”转化为“U”，导致GC含量降低，使PCR反应后在序列中出现长的连续“T”，容易引起DNA链的断裂，导致很难选择具有合适的Tm值及稳定的引物；另一方面，为了区别硫化处理和没有硫化处理以及未完全处理的DNA，需要引物有足够数量的“C”，这些都增加了选择稳定引物的困难。因此，DNA甲基化检测中，引物所针对的扩增片段的选择，如扩增片段长短和位置，以及引物的选择等等都对检测的灵敏度和特异性产生影响。发明人经实验也发现，不同的扩增目的片段和引物对检测效果有所区别。很多时候，发现了某些基因或核酸片段在肿瘤和非肿瘤中具有表达差异，然而其距离转化为肿瘤的标志物，应用到临床中，仍存在很长的距离。其中最主要的原因是因为检测试剂的限制，导致该潜在肿瘤标志物的检测灵敏度和特异性难以满足检测需求，或者检测方法操作复杂、成本高，难以在临床中大规模应用。
作为一种可选的实施方式，本发明的试剂盒中，还含有探针。作为优选的实施方式，所述的探针如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：51、中任一所示；优选地，所述的探针选自SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：45中任一所示；更优选地，所述的探针选自SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：27、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：39中任一所示。作为本发明中优选的实施方式，所述的核酸探针选自SEQ ID NO：3。作为一种优选的实施方式，本发明的试剂盒中，同时含有引物和探针，较佳的，所述的引物如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，同时，所述的探针如SEQ ID NO：3所示。
作为一种可选的实施方式，所述的试剂含包括内参基因的检测试剂。作为优选的实施方式，所述的内参基因为β-actin、COL2A1。作为一种优选的实施方式，所述的内参基因的检测试剂为针对内参基因的引物和探针。作为一种更为优选的实施方式，所述的内参基因的检测试剂为SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17所示的引物对和SEQ ID NO：18所示的探针。
作为优选的实施方式，所述的试剂还包括亚硫酸氢盐、重亚硫酸氢盐或肼盐，以对HOXD12基因进行修饰，当然可以不包括。
作为优选的实施方式，所述的试剂含包括DNA聚合酶、dNTPs、Mg2+离子、缓冲液中的一种或几种，优选包括DNA聚合酶、dNTPs、Mg2+离子和缓冲液的PCR反应体系，用于对经修饰后的HOXD12基因扩增。
本发明的检测/诊断试剂所检测的样品可以选自肺泡灌洗液、组织、胸水、痰液、血液、血清、血浆、尿液、前列腺液或粪便。作为优选的实施方式，所述的样品选自肺泡灌洗液、组织、痰液；更优选地，所述样品选自肺泡灌洗液或痰液。
本发明的检测/诊断试剂针对肿瘤选自肺癌组织和癌旁正常组织(或者良性肺部疾病组织)。
另一方面，本发明还提供了包含上述检测/诊断试剂的试剂盒。
另一方面，本发明还提供了一种检测HOXD12基因的DNA甲基化的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将待测样品进行亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐或肼盐处理，获得经修饰的待测样品；
(2)利用上述试剂或试剂盒对步骤(1)的经修饰的待测样品进行HOXD12基因甲基化情况检测。
作为优选的实施方式，步骤(2)中，采用实时荧光定量甲基化特异性聚合酶链反应进行检测。
另一方面，本发明还提供了一种肺癌的检测/诊断系统。所述的系统含有：
(1)HOXD12基因的DNA甲基化检测构件，以及，
(2)结果判断系统；
优选地，所述的HOXD12基因的DNA甲基化检测构件含有权利要求5-14所述任一所述试剂或试剂盒；
优选地，所述的结果判断构件用于根据检测系统检测的HOXD12基因的DNA甲基化结果，输出肺癌的患病风险和/或肺癌类型；
更优选地，所述的患病风险是根据通过结果判断比较待测样本与正常样本的甲基化结果，当待测样本与正常样本的甲基化具有显著差异或极显著差异时，结果判断待测样本患病风险高。
作为优选的实施方式，若HOXD12基因基因DNA甲基化阳性，则表明待测样品的提供者为肺癌高危或肺癌患者。作为一种优选的实施方式，所述的阳性是指将所获得检测结果与正常样本的检测结果比较，当待测样本与正常样本的扩增结果具有显著或极显著的差异时，所述待测样本的供体呈阳性。
本发明的有益效果：
虽然，现有技术中，已经报道了HOXD12基因甲基化可以作为肺癌的肿瘤标志物之一。然而，有关肺癌的肿瘤标志物的报道，不计其数，真正能够用于临床中，作为肺癌检测的标志物的却少之又少。本发明针对HOXD12基因的检测试剂对肺癌具有很高的灵敏度和特异性，十分有希望作为肺癌临床诊断的肿瘤标志物。
HOXD12基因对肺癌具有很高的灵敏度和特异性是基于本发明优化的HOXD12基因的甲基化的检测区域以及检测试剂，才能使得该标志物在组织标本中能够达到特异性为100％，敏感性78.6％的肺癌检出率。其中鳞癌能够全部检出。在最难检出的腺癌中，其特异性达到了100.0％，灵敏度达到了72.8％。
目前市面上已有基于SHOX2基因的肺癌检测试剂盒。在本发明的一个实施例中，对痰液标本进行检测，无论将肺癌作为一个整体进行比较分析，还是按照肺癌的亚型进行比较分析，HODX12的检测效果都要优于SHOX2基因的检测效果。特别是对腺癌的检测效果，HODX12检出率为55.6％，而SHOX2基因检出率为0％。在本发明的另一个实施例中，对肺泡灌洗液进行检测，将肺癌作为一个整体进行比较分析，HODX12的检出率为66.7％，远远高于SHOX2的47.6％，按照肺癌的亚型进行比较分析，鳞癌组HODX12的检测结果比SHOX2的要高出16.7％。特别是对腺癌的检测效果，其灵敏性达到63.6％，远远高于SHOX2的36.4％。
此外，本发明的检测标志物针对不同类型的肺癌，包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌中的鳞癌、腺癌均具有很高的特异性和灵敏度，其适用范围广，基本上能作为所有肺癌的肿瘤标志物。而现有的用于临床的肺癌标志物，其一般仅能适用于一类肺癌的检测，如NSE用于小细胞肺癌的诊断和监测治疗反应，而CYFRA21-1是非小细胞肺癌的首选标记物。
本发明提供的含有HOXD12基因的检测试剂和方法能非常方便、准确地判断出肺癌和肺部良性疾病患者，该基因的检测方法有望转化为基因检测试剂盒，并服务于肺癌的筛查、临床检测和预后监测。
附图说明
图1 HOXD12、SIX3、PCDHGA12、HOXD8、GATA3五个候选基因检测肺癌的ROC曲线
图2 HOXD12基因在对照组和肺癌组的甲基化程度
图3 HOXD12在临床组织标本中检测肺癌的ROC曲线
图4 HOXD12和SHOX2基因在痰液样本中检测的ROC曲线
图5 HOXD12和SHOX2基因在灌洗液样本中检测的ROC曲线
具体实施方式
以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，具体实施例不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。
实施例1：检测靶基因的选择
甲基化DNA作为检测靶标具有明显的优点，相比蛋白质类标志物，DNA是可以扩增的，并且很容易检测到；与突变类标志物相比，DNA发生甲基化的部位都位于基因的特定部位，一般在启动子区，使检测变得更容易和方便。为了完成本发明，发明人筛选了数百个基因，并从中选择出较好的HOXD12、SIX3、PCDHGA12、HOXD8、GATA3作为候选的检测基因，β-actin基因作为内参基因，研究各个基因甲基化位点分布情况，设计检测的引物探针分别用于检测。各基因检测引物探针如下：
HOXD12的检测引物和探针为：
SEQ ID NO：1HOXD12引物F1：TTAGAGGAGCGCGGTCGTATTC
SEQ ID NO：2HOXD12引物R1：ATCGTAAAACCCGACGTAACACG
SEQ ID NO：3HOXD12探针P1：FAM-TCGTTTTTCGTTTTCGAGTTTAGTTTG-BQ1
SIX3的检测引物和探针为：
SEQ ID NO：4SIX3引物F：CGTTTTATATTTTTGGCGAGTAGC
SEQ ID NO：5SIX3引物R：ACTCCGCCAACACCG
SEQ ID NO：6SIX3探针：FAM-CGGCGGCGGCGCGGGAGGCGG-BQ1
PCDHGA12的检测引物和探针为：
SEQ ID NO：7PCDHGA12引物F：TTGGTTTTTACGGTTTTCGAC
SEQ ID NO：8PCDHGA12引物R：AAATTCTCCGAAACGCTCG
SEQ ID NO：9PCDHGA12探针：FAM-ATTCGGTGCGTATAGGTATCGCGC-BQ1
HOXD8的检测引物和探针为：
SEQ ID NO：10HOXD8引物F：TTAGTTTCGGCGCGTAGC
SEQ ID NO：11HOXD8引物R：CCTAAAACCGACGCGATCTA
SEQ ID NO：12HOXD8探针：FAM-AAAACTTACGATCGTCTACCCTCCG-BQ1
GATA3的检测引物和探针为：
SEQ ID NO：13GATA3引物F：TTTCGGTAGCGGGTATTGC
SEQ ID NO：14GATA3引物R：AAAATAACGACGAACCAACCG
SEQ ID NO：15GATA3探针：FAM-CGCGTTTATGTAGGAGTGGTTGAGGTTC-BQ1
β-actin的检测引物和探针为：
SEQ ID NO：16β-actin引物F：TTTTGGATTGTGAATTTGTG
SEQ ID NO：17β-actin引物R：AAAACCTACTCCTCCCTTAAA
SEQ ID NO：18β-actin探针：FAM-TTGTGTGTTGGGTGGTGGTT-BQ1
样本信息：肺组织样本共计36例，其中作为对照的肺组织标本共11例，包括4例癌旁正常组织和良性肺部疾病组织；癌组织样本25例，包括鳞癌4例，腺癌21例.
试验过程：
a.收集确诊为肺癌或者良性疾病肺部的手术切除标本，用石蜡进行包埋，进行病理组织切片染色，鉴定其组织类型和纯度。组织切片使用Magen的DNA提取试剂盒(HiPureFFPE DNA Kit，D3126-03)来提取DNA。
b.使用ZYMO RESEARCH生物公司的DNA转化试剂盒(EZ DNA Methylation Kit，D5002)进行DNA的亚硫酸氢盐修饰。
c.扩增检测体系和检测体系如表1-2：
表1配液体系
Figure BDA0001922288860000091
Figure BDA0001922288860000101
表2 PCR反应过程
Figure BDA0001922288860000102
d.利用标准曲线计算基因在标本中的甲基化拷贝数，采用比值＝拷贝数/ACTB拷贝数*100来进行判断两组组织的甲基化程度，最后选取一个阈值作为判断癌症组和对照组的标准，换算后的比值超过设定阈值可判断为阳性，等于或小于设定阈值可判断为阴性。根据此标准，36例组织标本的检测结果如表3-4：
表3组织中的检测结果
Figure BDA0001922288860000111
注：“+”表示检测结果为阳性样本；“-”表示检测结果为阴性样本。
表4统计结果
Figure BDA0001922288860000121
在36例肺石蜡标本中，所有对照组的标本均可判定位HOXD12甲基化阴性，HOXD12基因的检测敏感性是92.0％，只有2例肺腺癌被判定为阴性，阳性检出率远高于另外4个基因。同时比较了肺良性疾病组织样本和肺癌旁正常的检出结果，HOXD12基因均显示出一致性，即HOXD12基因具有较好的特异性。提示HOXD12在对肺癌临床检测诊断中具有重要的意义。
因此，发明人选择HOXD12为候选基因，对其检测条件进行了优化，具体见实施例2。
HOXD12、SIX3、PCDHGA12、HOXD8、GATA3五个候选基因检测肺癌的ROC曲线见图1，HOXD12基因的ROC曲线下面积是0.978。
实施例2：HOXD12基因在临床标本中的检测
a.检测引物探针如下：
HOXD12的检测引物和探针为：
SEQ ID:1HOXD12引物F1：TTAGAGGAGCGCGGTCGTATTC
SEQ ID:2HOXD12引物R1：ATCGTAAAACCCGACGTAACACG
SEQ ID:3HOXD12探针P1：FAM-TCGTTTTTCGTTTTCGAGTTTAGTTTG-BQ1
β-actin的检测引物和探针为：
SEQ ID NO：16β-actin引物F：TTTTGGATTGTGAATTTGTG
SEQ ID NO：17β-actin引物R：AAAACCTACTCCTCCCTTAAA
SEQ ID NO：18β-actin探针：FAM-TTGTGTGTTGGGTGGTGGTT-BQ1
b.样本信息：28对肺癌组织样本及其对应癌旁组织作为非肺癌对照，合共56例肺石蜡组织标本。其中包括6例鳞癌，22例腺癌。
c.收集确诊为肺癌的手术切除标本，分离患癌组织和癌旁组织，分别用石蜡进行包埋，进行病理组织切片染色，鉴定其组织类型和纯度。组织切片使用Magen的DNA提取试剂盒(HiPure FFPE DNA Kit，D3126-03)来提取DNA。
d.使用ZYMO RESEARCH生物公司的DNA转化试剂盒(EZ DNA Methylation Kit，D5002)进行DNA的亚硫酸氢盐修饰。
e.扩增检测体系和检测体系如下：
表5配液体系
Figure BDA0001922288860000131
表6 PCR反应过程
Figure BDA0001922288860000132
f.检测结果
利用标准曲线计算HOXD12基因在标本中的甲基化拷贝数，采用比值＝HOXD12拷贝数/ACTB拷贝数*100来进行判断两组组织的甲基化程度，最后选取作为判断癌症组和对照组的标准，换算后的比值超过“13.8”可判断为阳性，等于或小于“13.8”可判断为阴性。根据此标准，36例组织标本的检测结果如下：
表7检测结果
Figure BDA0001922288860000141
注：“+”表示检测结果为阳性样本；“-”表示检测结果为阴性样本。
表8统计结果
Figure BDA0001922288860000142
上述结果表明，28对标本中，28例为肺癌标本，在特异性为100.0％的情况下，检出甲基化DNA阳性25例，灵敏性为78.6％，其中鳞癌能够全部检出，腺癌漏检6例。从箱形图和散点图(图2)看，HOXD12基因检测DNA甲基化在肺癌组和非肺癌组有较明显的区分度。再次证明了HOXD12基因可作为肺癌临床诊断的分子标志物。
尤其是针对腺癌，其特异性达到了100.0％，灵敏度达到了72.8％，具有极高的临床应用价值。肺腺癌较容易发生于女性及不抽烟者，早期一般没有明显的临床症状，且腺癌周围型，由于支气管的树状生理结构，漏检率更高，因此对这部分的检测更加困难和有意义。且HOXD12在组织标本中检测的ROC曲线见图3，AUC值为0.914。
实施例3：HOXD12基因在痰液标本中的检测
大量文献显示SHOX2可用作检测肺癌的标志物，SHOX2在肺泡灌洗液、病变部位组织、胸水、痰液等样本中具有较高的检出率。为了验证HOXD12的检测效果，本发明人同时检测HOXD12与SHOX2基因在痰液中的检出效率。
各基因检测引物探针如下：
HOXD12的检测引物和探针为：
SEQ ID NO：1HOXD12引物F1：TTAGAGGAGCGCGGTCGTATTC
SEQ ID NO：2HOXD12引物R1：ATCGTAAAACCCGACGTAACACG
SEQ ID NO：3HOXD12探针P1：FAM-TCGTTTTTCGTTTTCGAGTTTAGTTTG-BQ1
SHOX2的检测引物和探针为：
SHOX2_T_MF3引物F：TTTAAAGGGTTCGTCGTTTAAGTC
SHOX2_T_MR3引物R：AAACGATTACTTTCGCCCG
SHOX2_Taq_P3_探针：FAM-TTAGAAGGTAGGAGGCGGAAAATTAG-BQ1
样本信息：测试痰样本共计60例，其中正常对照组样本31例，癌症组对照样本29例，29例癌症组样本中有鳞癌9例，小细胞癌6例，腺癌9例，大细胞癌1例，未明确分类的肺癌4例。
试验过程：
a.收集确诊为肺癌患者和非肺癌患者的痰液标本，使用DTT解稠后，离心取沉淀分离细胞，使用PBS洗涤2遍，然后使用Magen的DNA提取试剂盒(HiPure FFPE DNA Kit，D3126-03)提取DNA。
b.使用ZYMO RESEARCH生物公司的DNA转化试剂盒(EZ DNA Methylation Kit，D5002)进行DNA的重亚硫酸盐修饰。
c.配液体系如表9：
表9配液体系
Figure BDA0001922288860000151
Figure BDA0001922288860000161
d.扩增体系如表10：
表10 PCR反应过程
Figure BDA0001922288860000162
e.检测结果如下：
利用标准曲线计算各基因在标本中的甲基化拷贝数，采用比值＝拷贝数/ACTB拷贝数*100来进行判断两组组织的甲基化程度，最后选取HOXD12的阈值为5.8，SHOX2的阈值为5.1，作为判断癌症组和对照组的标准，换算后的比值超过设定阈值可判断为阳性，等于或小于设定阈值可判断为阴性。根据此标准，60例痰液标本的检测结果如表11：
表11痰液标本检测结果
Figure BDA0001922288860000163
Figure BDA0001922288860000171
Figure BDA0001922288860000181
注：“+”表示检测结果为阳性样本；“-”表示检测结果为阴性样本。
f.结果分析
表12统计结果
Figure BDA0001922288860000182
从以上结果可以看出，无论将肺癌作为一个整体进行比较分析，HOXD12的检测效果要优于SHOX2基因的检测效果。特别是对腺癌的检测效果，HOXD12检出率为55.6％，而SHOX2基因检出率为0％，腺癌一般为周围型，由于支气管的树状生理结构，肺深部的脱落细胞更加难以通过痰液咳出，因此对这部分的检测更加困难和有意义。HOXD12和SHOX2在痰液标本中检测的ROC曲线见图4，HOXD12的AUC值为0.814，SHOX2的AUC值为0.847。
实施例4：HOXD12基因在灌洗液标本中的检测
样本信息：测试肺泡灌洗液样本共计79例，其中正常对照组样本58例，癌症组对照样本21例，21例癌症组样本中有鳞癌6例，小细胞癌4例，腺癌11例。
试验过程：
a.收集确诊为肺癌患者和非肺癌患者的肺泡灌洗液标本，离心分离细胞，然后使用Magen的DNA提取试剂盒(HiPure FFPE DNA Kit，D3126-03)提取DNA。
b.使用ZYMO RESEARCH生物公司的DNA转化试剂盒(EZ DNA Methylation Kit，D5002)进行DNA的亚硫酸氢盐修饰。
c.配液体系同表9。
d.扩增检测体系同表10。
e.检测结果如下：
利用标准曲线计算各基因在标本中的甲基化拷贝数，采用比值＝拷贝数/ACTB拷贝数*100来进行判断两组组织的甲基化程度，最后选取HOXD12的阈值为8.9，SHOX2的阈值为0.6，作为判断癌症组和对照组的标准，换算后的比值超过设定阈值可判断为阳性，等于或小于设定阈值可判断为阴性。根据此标准，79例灌洗液标本的检测结果表13：
表13灌洗液标本检测结果
Figure BDA0001922288860000191
Figure BDA0001922288860000201
Figure BDA0001922288860000211
注：“+”表示检测结果为阳性样本；“-”表示检测结果为阴性样本。
表14统计结果
Figure BDA0001922288860000212
f.从以上结果可以看出，同时检测HOXD12和SHOX2，将肺癌作为一个整体进行比较分析，HOXD12的检出率为66.7％，远远高于SHOX2的47.6％，按照肺癌的亚型进行比较分析，鳞癌组HOXD12的检测结果比SHOX2的要高出16.7％。特别是对腺癌的检测效果，其灵敏性达到63.6％，远远高于SHOX2的36.4％。因为腺癌一般为周围型，由于支气管的树状生理结构，肺泡灌洗液不容易接触到肺深部的肺泡或者癌组织，因此对这部分的检测更加困难和有意义。HOXD12和SHOX2在肺泡灌洗液标本中检测的ROC曲线见图5，HOXD12的AUC值为0.855，SHOX2的AUC值为0.784。
综合实施例1-4，能够充分的说明HOXD12在对肺癌检测诊断，尤其是应用痰液，肺泡灌洗液等生物样本上具有更好的检测效果。能够更加容易的应用于大规模的人群筛查。具有更加优越的社会经济学价值。
实施例5：HOXD12基因的区域的选择
各种研究资料表明，同一个基因的甲基化状态和分布并不均匀，因此对于同一个基因来说，选择不同的区域设计的甲基化引物、探针检测体系对同一样本，同一肿瘤的诊断检测效能并不一样，甚至有时候选择的区域不合适造成对肿瘤完全没有诊断效果，本发明人经过反复的研究和比较后，选择HOXD12基因的启动子的不同区域序列如表15：
表15 HOXD12基因不同区域的序列
Figure BDA0001922288860000221
Figure BDA0001922288860000231
Figure BDA0001922288860000241
Figure BDA0001922288860000251
Figure BDA0001922288860000261
根据区域1和区域2设计不同的甲基化引物和探针，各引物探针信息见表16，其中组1、组2、组3、组4、组5、组6是根据区域1设计的甲基化引物和探针；、组7、组8、组9、组10是根据区域2设计的甲基化引物和探针。所有的引物和探针均由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。
表16根据HOXD12基因的不同区域设计的引物和探针
Figure BDA0001922288860000262
Figure BDA0001922288860000271
Figure BDA0001922288860000281
在36例肺组织样本检测表16中10组引物探针组合，其中正常组织样本11例，癌组织样本25例，25例癌症组样本中有鳞癌4例，腺癌21例。检测结果如表17。
样品处理、检测结果判断、统计方式同实施例1；PCR配液体系、反应过程为本领域常规操作。
表17不同引物探针组合在组织中的检测结果
Figure BDA0001922288860000282
Figure BDA0001922288860000291
结果显示，结果显示组1、组2、组3、组5、组6、组8均有较好的检出率。但无论采用本发明设计的何种引物和探针，区域1的检测灵敏度最低也可达到64％，最高达到92％，检出率要远远高于针对区域2设计的几对引物，因此，区域1的检出率明显较其他区域高(见表17)。
实施例6引物和探针组合的选择
为了进一步验证不同引物和探针的组合在痰液中的检出率，发明人选取了22例痰液标本，采用表16中的引物和探针进行验证，其中包括7例正常对照，15例肺癌对照，15例肺癌中有鳞癌7例，腺癌7例，大细胞癌1例，检测结果如表18。
样品处理、检测结果判断、统计方式同实施例3；PCR配液体系、反应过程为本领域常规操作。
表18在痰液中的检测结果
组别 引物探针组合 特异性 灵敏性
组1 HD12-F1,HD12-R1,HD12-P1 100％ 73.3％
组2 HD12-F2,HD12-R2,HD12-P2 100％ 60％
组3 HD12-F3,HD12-R3,HD12-P3 100％ 60％
组5 HD12-F4,HD12-R4,HD12-P4 100％ 46.7％
组6 HD12-F5,HD12-R5,HD12-P5 100％ 53.3％
组8 HD12-F10,HD12-R10,HD12-P10 100％ 40％
从22例痰液标本的检测结果显示，组1：HD12-F1，HD12-R1，HD12-P1的检出率最高，达到80％。
虽然在组织样本中，组1的灵敏度达到92％，组2的灵敏度达到72％，但针对痰液检测样本，组2的灵敏度却大幅下降至60％，这也从一方面证实了针对痰液样本，设计具有高灵敏度的检测试剂尤其不易。
最终，根据各组引物探针的检测结果，最优选的引物探针序列为组1的组合：HD12-F1，HD12-R1，HD12-P1。
序列表
<110> 广州市康立明生物科技有限责任公司
<120> 基于HOXD12基因的肺癌诊断剂及试剂盒
<160> 57
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttagaggagc gcggtcgtat tc 22
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atcgtaaaac ccgacgtaac acg 23
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tcgtttttcg ttttcgagtt tagtttg 27
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cgttttatat ttttggcgag tagc 24
<210> 5
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
actccgccaa caccg 15
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cggcggcggc gcgggaggcg g 21
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ttggttttta cggttttcga c 21
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aaattctccg aaacgctcg 19
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
attcggtgcg tataggtatc gcgc 24
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ttagtttcgg cgcgtagc 18
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cctaaaaccg acgcgatcta 20
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
aaaacttacg atcgtctacc ctccg 25
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tttcggtagc gggtattgc 19
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
aaaataacga cgaaccaacc g 21
<210> 15
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
cgcgtttatg taggagtggt tgaggttc 28
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ttttggattg tgaatttgtg 20
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
aaaacctact cctcccttaa a 21
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ttgtgtgttg ggtggtggtt 20
<210> 19
<211> 480
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 19
gcgcgctgcc ctgggccgcc acgcccgcct cctgcgcccc cgcgcagcct gcgggcgcca 60
ctgccttcgg cggcttctcg cagccctacc tggctggctc cgggcctctc ggcctgcagc 120
ccccaacagc caaagacgga cccgaagagc aggctaagtt ctatgcgccc gaagcggccg 180
ctgggccaga ggagcgcggt cgtacccggc cgtccttcgc ccccgagtct agcctggctc 240
ctgcagtggc tgctctcaaa gcggccaagt atgactacgc tggtgtgggt cgtgccacgc 300
cgggctccac gaccctgctc cagggggctc cctgcgcccc tggcttcaag gacgacacca 360
agggcccgct caacttgaac atgacagtgc aggcggcggg cgttgcctct tgcctgcgac 420
cttcactgcc cgacggtaaa cggtgcccat gctccccggg ccggtttggg ccgggatggg 480
<210> 20
<211> 480
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gcgcgttgtt ttgggtcgtt acgttcgttt tttgcgtttt cgcgtagttt gcgggcgtta 60
ttgttttcgg cggtttttcg tagttttatt tggttggttt cgggtttttc ggtttgtagt 120
ttttaatagt taaagacgga ttcgaagagt aggttaagtt ttatgcgttc gaagcggtcg 180
ttgggttaga ggagcgcggt cgtattcggt cgtttttcgt tttcgagttt agtttggttt 240
ttgtagtggt tgtttttaaa gcggttaagt atgattacgt tggtgtgggt cgtgttacgt 300
cgggttttac gattttgttt tagggggttt tttgcgtttt tggttttaag gacgatatta 360
agggttcgtt taatttgaat atgatagtgt aggcggcggg cgttgttttt tgtttgcgat 420
ttttattgtt cgacggtaaa cggtgtttat gtttttcggg tcggtttggg tcgggatggg 480
<210> 21
<211> 2211
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 21
ctgcgccccg ataggcatgg agcgcgctcg ccatctcctg ggcattgggc ggcattggca 60
gagctctcta ttcgctcctc agccaaatcc tgttccattc tcttaatcac cagccaagcc 120
actctcccgc cactactttc caccccgatc ctccctcgat caggttcccc agctcgcata 180
agactttgcc tgccagacct cgaaagtcat aaacccgggg gatgaagtgg gaagactgtc 240
caaggagcaa tggagggaac ctagttgttc ttgtttttcc tgtttttcac tgagttcttt 300
tatgccttta gtcctgaggc gcaaacagct gttgtagggc tgcctaaagg tccgaaagag 360
acacccctcg gcttggaaat aacgaggaat cgtcgtgcac tgaaacgtga ggagagactg 420
cagggacccc tggagctgga gctttcggga gtaacgaagc tgcagctcct cgaaaatagg 480
atgggttccc caaaataaga gctcttaggg atctgaggct tgtattccct tgagtatcta 540
ggaactggga ttgcagtttg tgcttgcccc cacctcccaa gagaggacga gagcgagtga 600
gtctctatgc ctgggctcct aaggaaactc tctggcagag ccagaggagc cccagacatc 660
cccacccccc cgtcctcact ccctctctcc cccccaccag agcaggagga agaggccgat 720
tgcgttcccc agagccaccc aattggtcgc cataactcac acaataaagt ggcagcgcgg 780
cggtcagtct tgccctccgg cggcgcctgt gtggtctcag tgcaggagcc cgcgatctaa 840
ccaattccag cttggctcgg agaccgaggg tcctgctgca ggctgagact ggcgccggtc 900
accgggtctc ccagggtctt gggatcagag gcaggagggg aggaccccta gtcctctggc 960
cggactaggc aagagggcca gcgacggggt ctgagcacac cgctcccggc taagaactgc 1020
tgcctttccc acttccctgt ttgtcagacc cgtgaactcc ctatccccgg cacccctggg 1080
ggcgctgagg caaggaactc tgctagccag ctgcctccga acgcccgctg ttccccggcc 1140
aggtggttct ggctcttctg cctttccaca cccagtcggg ggagttcgtc ctgctttgcc 1200
ctccacttgg tggatgggga cacctcggag ttctggtttg cagtgtgtag tcctggagag 1260
gactcctgaa gataaaagga atgtagcctt tggccacgat tggtggatcg agctgatggg 1320
ttccctggcg gacattctcc atggacctgt atggcaattt ccctatgatc agagttctta 1380
gccatgggga cacaaaccag aaatagtgtg gcctccttcc tggatcccaa aattgggtag 1440
tttgtgatgc cctttttgtg tctgcggcct gggactgagg gctcaagtag cgaatgggtc 1500
tttgctgcca gatcctcagg cagaggtctc tggagaaacc ctctctgtgg gagtgattgg 1560
ggtaaaagtg acattgctca ggccaaggga cagagctcct ggtgccgccg gaccgcgccc 1620
tctccggata agtcgagagg cgccggttaa tggaaaatgc ctccgctgca acttaaagcc 1680
ggtagaagca agccgggccc agaaagcctg cggaaaacga atcgcaaagc caatcacgac 1740
caagaagagt cccaggggac acttgggcag agtcaccctc ttgcccgatg tccccagctg 1800
ctgaagccgg gcctggaaac ccgcagacag ttagtcttcg ctcaacctga tttggctctg 1860
ctggcagcct cgtccttcgc catcgaacat tgcgggtgtt atcataatac tctgaagggg 1920
gggaaaacgg gtcgggggga tgtaggcggt gctgaaatga ccggctttga agaacctgca 1980
ggcaaagttt cgtccaatcg tctgagcctg tcctcttatt cccggttgta actaaatact 2040
gttgcgagcg cagccgaagc cctttgttgg agatgtgtga gcgcagtctc tacagagcgg 2100
gctatgtggg ctcgcttctg aatctgcagt cgccagactc tttctacttc tccaacctga 2160
ggccgaatgg cggccagttg gccgcgcttc cccctatctc ctacccgcgc g 2211
<210> 22
<211> 2211
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
ttgcgtttcg ataggtatgg agcgcgttcg ttattttttg ggtattgggc ggtattggta 60
gagtttttta ttcgtttttt agttaaattt tgttttattt ttttaattat tagttaagtt 120
attttttcgt tattattttt tatttcgatt ttttttcgat taggtttttt agttcgtata 180
agattttgtt tgttagattt cgaaagttat aaattcgggg gatgaagtgg gaagattgtt 240
taaggagtaa tggagggaat ttagttgttt ttgttttttt tgttttttat tgagtttttt 300
tatgttttta gttttgaggc gtaaatagtt gttgtagggt tgtttaaagg ttcgaaagag 360
atatttttcg gtttggaaat aacgaggaat cgtcgtgtat tgaaacgtga ggagagattg 420
tagggatttt tggagttgga gttttcggga gtaacgaagt tgtagttttt cgaaaatagg 480
atgggttttt taaaataaga gtttttaggg atttgaggtt tgtatttttt tgagtattta 540
ggaattggga ttgtagtttg tgtttgtttt tattttttaa gagaggacga gagcgagtga 600
gtttttatgt ttgggttttt aaggaaattt tttggtagag ttagaggagt tttagatatt 660
tttatttttt cgtttttatt tttttttttt tttttattag agtaggagga agaggtcgat 720
tgcgtttttt agagttattt aattggtcgt tataatttat ataataaagt ggtagcgcgg 780
cggttagttt tgtttttcgg cggcgtttgt gtggttttag tgtaggagtt cgcgatttaa 840
ttaattttag tttggttcgg agatcgaggg ttttgttgta ggttgagatt ggcgtcggtt 900
atcgggtttt ttagggtttt gggattagag gtaggagggg aggattttta gttttttggt 960
cggattaggt aagagggtta gcgacggggt ttgagtatat cgttttcggt taagaattgt 1020
tgtttttttt atttttttgt ttgttagatt cgtgaatttt ttattttcgg tatttttggg 1080
ggcgttgagg taaggaattt tgttagttag ttgttttcga acgttcgttg tttttcggtt 1140
aggtggtttt ggtttttttg tttttttata tttagtcggg ggagttcgtt ttgttttgtt 1200
ttttatttgg tggatgggga tatttcggag ttttggtttg tagtgtgtag ttttggagag 1260
gatttttgaa gataaaagga atgtagtttt tggttacgat tggtggatcg agttgatggg 1320
ttttttggcg gatatttttt atggatttgt atggtaattt ttttatgatt agagttttta 1380
gttatgggga tataaattag aaatagtgtg gttttttttt tggattttaa aattgggtag 1440
tttgtgatgt tttttttgtg tttgcggttt gggattgagg gtttaagtag cgaatgggtt 1500
tttgttgtta gatttttagg tagaggtttt tggagaaatt ttttttgtgg gagtgattgg 1560
ggtaaaagtg atattgttta ggttaaggga tagagttttt ggtgtcgtcg gatcgcgttt 1620
ttttcggata agtcgagagg cgtcggttaa tggaaaatgt tttcgttgta atttaaagtc 1680
ggtagaagta agtcgggttt agaaagtttg cggaaaacga atcgtaaagt taattacgat 1740
taagaagagt tttaggggat atttgggtag agttattttt ttgttcgatg tttttagttg 1800
ttgaagtcgg gtttggaaat tcgtagatag ttagttttcg tttaatttga tttggttttg 1860
ttggtagttt cgtttttcgt tatcgaatat tgcgggtgtt attataatat tttgaagggg 1920
gggaaaacgg gtcgggggga tgtaggcggt gttgaaatga tcggttttga agaatttgta 1980
ggtaaagttt cgtttaatcg tttgagtttg tttttttatt ttcggttgta attaaatatt 2040
gttgcgagcg tagtcgaagt tttttgttgg agatgtgtga gcgtagtttt tatagagcgg 2100
gttatgtggg ttcgtttttg aatttgtagt cgttagattt tttttatttt tttaatttga 2160
ggtcgaatgg cggttagttg gtcgcgtttt tttttatttt ttattcgcgc g 2211
<210> 23
<211> 972
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 23
agcccggggc ggggtggggc tggagctcct gtctcttggc cagctgaatg gaggcccagt 60
ggcaacacag gtcctgcctg gggatcaggt ctgctctgca ccccaccttg ctgcctggag 120
ccgcccacct gacaacctct catccctgct ctgcagatcc ggtcccatcc ccactgccca 180
ccccaccccc ccagcactcc acccagttca acgttccacg aacccccaga accagccctc 240
atcaacaggc agcaagaagg gccccccgcc catcgcccca caacgccagc cgggtgaacg 300
ttggcaggtc ctgaggcagc tggcaagacg cctgcagctg aaagatacaa ggccagggac 360
aggacagtcc catccccagg aggcagggag tatacaggct ggggaagttt gcccttgcgt 420
ggggtggtga tggaggaggc tcagcaagtc ttctggactg tgaacctgtg tctgccactg 480
tgtgctgggt ggtggtcatc tttcccacca ggctgtggcc tctgcaacct tcaagggagg 540
agcaggtccc attggctgag cacagccttg taccgtgaac tggaacaagc agcctccttc 600
ctggccacag gttccatgtc cttatatgga ctcatctttg cctattgcga cacacactca 660
gtgaacacct actacgcgct gcaaagagcc ccgcaggcct gaggtgcccc cacctcacca 720
ctcttcctat ttttgtgtaa aaatccagct tcttgtcacc acctccaagg agggggagga 780
ggaggaaggc aggttcctct aggctgagcc gaatgcccct ctgtggtccc acgccactga 840
tcgctgcatg cccaccacct gggtacacac agtctgtgat tcccggagca gaacggaccc 900
tgcccacccg gtcttgtgtg ctactcagtg gacagaccca aggcaagaaa gggtgacaag 960
gacagggtct tc 972
<210> 24
<211> 972
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
agttcggggc ggggtggggt tggagttttt gttttttggt tagttgaatg gaggtttagt 60
ggtaatatag gttttgtttg gggattaggt ttgttttgta ttttattttg ttgtttggag 120
tcgtttattt gataattttt tatttttgtt ttgtagattc ggttttattt ttattgttta 180
ttttattttt ttagtatttt atttagttta acgttttacg aatttttaga attagttttt 240
attaataggt agtaagaagg gtttttcgtt tatcgtttta taacgttagt cgggtgaacg 300
ttggtaggtt ttgaggtagt tggtaagacg tttgtagttg aaagatataa ggttagggat 360
aggatagttt tatttttagg aggtagggag tatataggtt ggggaagttt gtttttgcgt 420
ggggtggtga tggaggaggt ttagtaagtt ttttggattg tgaatttgtg tttgttattg 480
tgtgttgggt ggtggttatt ttttttatta ggttgtggtt tttgtaattt ttaagggagg 540
agtaggtttt attggttgag tatagttttg tatcgtgaat tggaataagt agtttttttt 600
ttggttatag gttttatgtt tttatatgga tttatttttg tttattgcga tatatattta 660
gtgaatattt attacgcgtt gtaaagagtt tcgtaggttt gaggtgtttt tattttatta 720
ttttttttat ttttgtgtaa aaatttagtt ttttgttatt atttttaagg agggggagga 780
ggaggaaggt aggttttttt aggttgagtc gaatgttttt ttgtggtttt acgttattga 840
tcgttgtatg tttattattt gggtatatat agtttgtgat tttcggagta gaacggattt 900
tgtttattcg gttttgtgtg ttatttagtg gatagattta aggtaagaaa gggtgataag 960
gatagggttt tt 972
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
ttttatgcgt tcgaagcggt c 21
<210> 26
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
aacgtaatca tacttaaccg ctttaa 26
<210> 27
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
agaggagcgc ggtcgtattc ggtc 24
<210> 28
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
cgggcgttat tgttttcg 18
<210> 29
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
cttaacctac tcttcgaatc cg 22
<210> 30
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
cgtagtttta tttggttggt ttcgggt 27
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
gttttgggtc gttacgttcg 20
<210> 32
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
cgaaaccaac caaataaaac tacg 24
<210> 33
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
cgtagtttgc gggcgttatt gttt 24
<210> 34
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
gttttatgcg ttcgaagcg 19
<210> 35
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
aaccaaacta aactcgaaaa cg 22
<210> 36
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
cgcggtcgta ttcggtcgtt ttt 23
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
gtgttacgtc gggttttacg 20
<210> 38
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
gcctacacta tcatattcaa attaaacg 28
<210> 39
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
tttttggttt taaggacgat attaaggg 28
<210> 40
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
gttggtagtt tcgtttttcg ttatc 25
<210> 41
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
aaaaaacttc gactacgctc g 21
<210> 42
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
cggtgttgaa atgatcggtt ttg 23
<210> 43
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
ttttggtgtc gtcggatcg 19
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
aacccgactt acttctaccg 20
<210> 45
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
cgagaggcgt cggttaatgg aaaa 24
<210> 46
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
aggaagaggt cgattgcg 18
<210> 47
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
ctacactaaa accacacaaa cg 22
<210> 48
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
cgcggcggtt agttttgttt ttcg 24
<210> 49
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
cggttaatgg aaaatgtttt cg 22
<210> 50
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
cccctaaaac tcttcttaat cg 22
<210> 51
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
cgggtttaga aagtttgcgg aaaa 24
<210> 52
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
ttttggattt aaggggaaga taaa 24
<210> 53
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
tttttccttc tctacatctt tctacct 27
<210> 54
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
aagggaaatt gagaaatgag agaaggga 28
<210> 55
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
tttaaagggt tcgtcgttta agtc 24
<210> 56
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
aaacgattac tttcgcccg 19
<210> 57
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
ttagaaggta ggaggcggaa aattag 26

Claims (17)

1.一种核酸片段在制备肿瘤检测/诊断试剂或试剂盒中的应用：所述的核酸片段选自SEQ ID NO：19、或SEQ ID NO：21；优选地，所述的核酸片段选自SEQ ID NO：19。
2.一种引物，其特征在于，所述的引物选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32，SEQ IDNO：34和SEQ ID NO：35，SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：41，SEQID NO：43和SEQ ID NO：44，SEQ ID NO：46和SEQ ID NO：47，SEQ ID NO：49和SEQ ID NO：50中所示的任意一对；优选地，所述的引物选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32，SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：35，SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：44所示的引物对；更优选地，所述的引物选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：25和SEQ IDNO：26，SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32，SEQ ID NO：34和SEQID NO：35，SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38所示的引物对；最优选地，所述的引物选自SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：2所示的引物对。
3.一种核酸探针，其特征在于，所述的探针选自SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：27、SEQ IDNO：30、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：45、SEQ IDNO：48、SEQ ID NO：51、中任一所示；优选地，所述的探针选自SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：45中任一所示；更优选地，所述的探针选自SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：36、SEQID NO：39中任一所示；最优选地，所述的核酸探针选自SEQ ID NO：3。
4.权利要求2或3所述的引物对或核酸探针在制备肿瘤检测/诊断试剂或试剂盒中的应用。
5.一种肿瘤检测/诊断试剂，其特征在于，所述的试剂含有HOXD12基因甲基化的检测试剂。
6.根据权利要求5所述的检测/诊断试剂，其特征在于，所述的HOXD12基因甲基化的检测试剂检测HOXD12基因经亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐或肼盐修饰后的序列；优选地，经亚硫酸氢盐修饰。
7.根据权利要求5所述的检测/诊断试剂，其特征在于，所述试剂针对HOXD12基因的检测区域如SEQ ID NO：19、或SEQ ID NO：21所示；优选地，如SEQ ID NO：19所示。
8.根据权利要求5所述的检测/诊断试剂，其特征在于，所述的试剂含有扩增引物；优选地，所述的引物如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32，SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：35，SEQ IDNO：37和SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：44，SEQID NO：46和SEQ ID NO：47，SEQ ID NO：49和SEQ ID NO：50中所示的任意一对；优选地，所述的引物选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32，SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：35，SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：44所示的引物对；更优选地，所述的引物选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：28和SEQ IDNO：29，SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32，SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：35，SEQ ID NO：37和SEQID NO：38所示的引物对；最优选地，所述的引物选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的引物对。
9.根据权利要求5所述的检测/诊断试剂，其特征在于，所述的试剂还有探针；优选地，所述的探针如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：51、中任一所示；优选地，所述的探针选自SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：33、SEQID NO：36、SEQ ID NO：45中任一所示；更优选地，所述的探针选自SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：39中任一所示；最优选地，所述的核酸探针选自SEQ ID NO：3。
10.根据权利要求5所述的检测/诊断试剂，其特征在于，所述的试剂含包括内参基因的检测试剂；优选地，所述的内参基因为β-actin、COL2A1
优选地，所述的内参基因的检测试剂为针对内参基因的引物和探针；
更优选地，所述的内参基因的检测试剂为SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17所示的引物对和SEQ ID NO：18的探针。
或者优选地，所述的内参基因的检测试剂为SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72所示的引物对和SEQ ID NO：73的探针。
11.根据权利要求5所述的检测/诊断试剂，其特征在于，所述的试剂还包括亚硫酸氢盐、重亚硫酸氢盐或肼盐。
12.根据权利要求5所述的检测/诊断试剂，其特征在于，所述的试剂还包括DNA聚合酶、dNTPs、Mg2+离子、缓冲液中的一种或几种；优选地，包括DNA聚合酶、dNTPs、Mg2+离子和缓冲液。
13.根据权利要求5所述的检测/诊断试剂，其特征在于，所述的试剂的检测样品选自肺泡灌洗液、组织、胸水、痰液、血液、血清、血浆、尿液、前列腺液或粪便；优选地，所述样品选自肺泡灌洗液、组织、痰液；更优选地，所述样品选自肺泡灌洗液或痰液。
14.根据权利要求1、5-13任一核酸片段或应用或检测/诊断试剂或试剂盒，其特征在于所述的肿瘤选自肺癌；优选地，所述的肺癌选自小细胞肺癌和非小细胞肺癌；更优选地，所述的非小细胞肺癌选自鳞状细胞癌、腺癌。
15.包含权利要求5-14任一所述肿瘤检测/诊断试剂的试剂盒。
16.一种检测HOXD12基因的DNA甲基化的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将待测样品进行亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐或肼盐处理，获得经修饰的待测样品；
(2)利用权利要求5-14任一所述试剂或试剂盒对步骤(1)经修饰的待测样品进行HOXD12基因甲基化情况检测；
优选地，步骤(2)中，采用实时荧光定量甲基化特异性聚合酶链反应进行检测。
17.一种肺癌的检测/诊断系统，其特征在于，所述的系统含有：
a.HOXD12基因的DNA甲基化检测构件，以及，
b.结果判断系统；
优选地，所述的HOXD12基因的DNA甲基化检测构件含有权利要求5-14所述任一所述试剂或试剂盒；
优选地，所述的结果判断构件用于根据检测系统检测的HOXD12基因的DNA甲基化结果，输出肺癌的患病风险和/或肺癌类型；
更优选地，所述的患病风险是根据通过结果比较待测样本与正常样本的甲基化结果，当待测样本与正常样本的甲基化具有显著差异或极显著差异时，结果判断待测样本患病风险高。
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