CN111363741B - 一种用于检测人眼表腺病毒的引物组及其应用 - Google Patents

一种用于检测人眼表腺病毒的引物组及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种用于检测人眼表腺病毒的引物组及其应用。实验表明，本发明提供的引物组具有良好的准确性、灵敏性和特异性。对已知样品进行检测，所得结果与预期100％匹配，最低检测限可达可达100fg/μL，而该引物组对其他病毒，如单纯疱疹病毒I型、单纯疱疹病毒II型、水痘带状疱疹病毒均未产生非特异扩增。

Description

一种用于检测人眼表腺病毒的引物组及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种用于检测人眼表腺病毒的引物组及其应用。
背景技术
病毒性结膜炎是一种常见的感染性眼病，是最常见的“红眼”原因之一，主要表现为急性滤泡性结膜炎，常合并有角膜病变，传染性强，可散在或流行性发病。主要表现为两大类型，即流行性角结膜炎和咽结膜热。
腺病毒(adenovirus，Ad)是一种脱氧核糖核酸(DNA)病毒，可分为31个血清型。腺病毒血清型中至少有19种血清型被报道为流行性或散发性结膜炎或角结膜炎的病原体。不同型别的腺病毒引起的病毒性结膜炎可有不同的临床表现；而同样的临床表现也可由几种不同血清型的腺病毒所引起。与流行性角结膜炎(EKC)相关的血清型通常为Ad8型、Ad19型、Ad37型，伴有咽结膜热(PCF)的是Ad3型、Ad7型，伴有非特异性滤泡性结膜炎(NFC)的是Ad1型、Ad2型、Ad4型、Ad5型和Ad6型。通常Ad8型腺病毒感染的患者眼部病变通常最为严重。
目前对于感染腺病毒的的常用诊断方法主要有：病原体分离培养法、聚合酶链反应(PCR)法、荧光定量PCR法、免疫学方法等，但是这些方法均存在明显的不足，不能满足临床快速检测的要求。其中：
病原体分离培养法曾被认为是诊断病毒感染的金标准，但是分离培养并不总是成功的，同时病毒在培养过程中增殖非常缓慢，需要一个月左右引起细胞病变后进行首次分离，耗时比较长，并且随着抗病毒药物的广泛使用，病毒培养的阳性率逐年下降。耗时费力，易贻误诊断治疗的最佳时机。
PCR方法是目前实验室比较常用的检测方法，包括普通PCR，实时定量PCR等。该方法敏感、准确，但是需要昂贵的仪器设备，如PCR仪、荧光定量PCR仪、电泳仪、紫外凝胶成像系统等，并且检测时间长，较高检测费用以及对检测人员较高的技术要求而使其不适用于现场快速检测及基层普及应用。
免疫学方法操作简便，应用较广泛，但存在一定的局限性，腺病毒具有潜伏感染和反复发作的特性，患者感染病毒后需要一段时间才会产生抗体，所以免疫学方法不适用于疾病的早期诊断，并且许多检测的抗体不易获得，当抗原稀释后也影响检出率，敏感性和特异性较差。
综上所述，目前现有的方法都不适用于临床的快速诊断，而目前眼科的临床诊断主要是凭借医生的经验，没有准确的病原微生物分型检测，因而导致误诊，过度医疗、抗生素滥用等诸多问题，不仅增加了医疗成本还加大了医疗风险。腺病毒8型在流行病学上占有主要地位，引起的病症也最为严重，所以，目前急需研发一种能够准确、高效检测眼表腺病毒8型的方法。目前并没有报道一种在低反应量状态下即能快速准确检测人眼表腺病毒的诊断试剂盒。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种用于检测人眼表腺病毒的引物组及其应用，该引物组准确性、敏感性、特异性较高。
本发明提供的LAMP引物组，包括如SEQ ID NO:1～6所示核苷酸序列的6条引物。
本发明提供的LAMP引物组采用两对不同的特异性引物靶定目的基因的特定区域，只有当2对引物与目的片段的六个区域都匹配上时才能进行扩增。具体的，本发明的引物组由6条引物组成，包括序列如SEQ ID NO:1～2所示的内引物(FIP/BIP)、序列如SEQ ID NO:3～4所示的外引物(F3/B3)和序列如SEQ ID NO:5～6所示的环引物(LPF/LPB)。其中，FIP/BIP分别为上下游内部引物，由F2区和F1C区域组成，F2区与靶基因3’端的F2c区域互补，F1C区与靶基因5’端的Flc区域序列相同。F3/B3分别为上下游外部引物，由F3区组成，并与靶基因的F3c区域互补。LF/LB分别为上下游环引物，与扩增过程中形成的茎环结构结合的区域在F2和F1之间。这样的设计可以保证引物具有更高的特异性，从而避免在检测过程中出现假阳性。
本发明还提供了SEQ ID NO:1～6所示核苷酸序列的引物组在制备检测腺病毒8型试剂中的应用。
本发明提供的引物组可实现对待测物的直接检测，而不需对待测样品进行DNA的提取。并且，本发明提供的引物组对样品的需求量较小，而灵敏性较高，可以达到菲克级别，高于常规实验室检测需求。因此，其可用于多种来源样品的检测。对生物样品的检测可以判断该样品是否被腺病毒8型感染，而对非生物样品的检测可以判断该样品是否被腺病毒8型污染。本发明中，所述检测的样品来自眼部、体表、口腔、鼻腔、医疗器械、药品、食品或化妆品。
本发明中，来自眼部的样品为眼睑组织、角膜组织、泪液、房水或玻璃体腔液。一些具体实施例中，所述检测的样品为角膜组织。
实验表明，本发明提供的引物在对药物是否感染Ad8进行检测的过程中，不受药物组分的干扰。本发明中，所述药物为眼部用药：具体包括染色剂类，麻醉剂类、消炎抗生素类、皮质类固醇激素类、抗青光眼类或散瞳类。其中：
染色剂类：如荧光素钠，用于角膜、结膜损伤及异物的术前检查。
麻醉剂类：如地卡因，这是做眼科检查前必用的，也是很多角膜损伤必用的药物，也用于眼科表面麻醉。
消炎抗生素类：如利福平，主要适用于眼睑、泪道、结膜、角膜等部位的感染性炎症，或手术后感染的预防与治疗。
皮质类固醇激素类：如可的松，主要适用于过敏性炎症、内因性非感染性炎症以及外伤、手术后反应性炎症，也可以用于近视眼手术后。
抗青光眼类：如匹罗卡品。
散瞳类：如阿托品，主要用于验光、眼底等散瞳检查，也可用于严重的角膜炎、虹膜睫状体炎和手术前后。
具体的，眼部用药为：荧光素钠、地卡因、氢化可的松、阿托品、匹罗卡品、利福平等。
本发明还提供了一种检测腺病毒8型的试剂盒，其包括本发明所述的LAMP引物组。
作为优选，本发明提供的试剂盒中还包括：LAMP反应液、LAMP密封液和LAMP显色液。
优选的，所述LAMP反应液中，包括：Bst聚合酶，LAMP反应缓冲液，超纯水。
更优选的，LAMP反应缓冲液中包括：硫酸镁、甜菜碱、dNTP、Tris-HCl、超纯水。
优选的，LAMP密封液为甘油。
优选的，LAMP显色液中包括SYBR green I或钙黄绿素。
由于本发明提供的试剂盒或方法无需昂贵的仪器、也无需复杂的操作就可完成对Ad8的快速准确检测，因此，适用于门诊或基层医生对病毒性结膜炎疾病的快速诊断，同样也适合于其他非诊断目的的Ad8检测。
本发明还提供了一种非诊断目的检测腺病毒8型的方法，包括：以本发明所述引物组对样品进行LAMP扩增，经显色后，根据显色结果判断样品是否含有腺病毒8型。
本发明所述的检测方法中，所述LAMP扩增的温度为60℃时间为30min。
本发明所述的检测方法中，所述LAMP扩增的反应液体系包括：引物组工作液、LAMP反应液、样品混悬液、超纯水和LAMP密封液，
所述引物组工作液、LAMP反应液、样品混悬液、超纯水和LAMP密封液的体积比为1:12.5:2:9.5:20。
作为优选，引物组工作液中，
如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的引物的浓度为25μmol/L～50μmol/L；
如SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的引物的浓度为25μmol/L～50μmol/L；
如SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的引物的浓度为15μmol/L～30μmol/L；
如SEQ ID NO:4所示核苷酸序列的引物的浓度为15μmol/L～30μmol/L；
如SEQ ID NO:5所示核苷酸序列的引物的浓度为5μmol/L～10μmol/L；
如SEQ ID NO:6所示核苷酸序列的引物的浓度为5μmol/L～10μmol/L。
优选的，引物组工作液中，
如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的引物的浓度为40μmol/L；
如SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的引物的浓度为40μmol/L；
如SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的引物的浓度为20μmol/L；
如SEQ ID NO:4所示核苷酸序列的引物的浓度为20μmol/L；
如SEQ ID NO:5所示核苷酸序列的引物的浓度为5μmol/L；
如SEQ ID NO:6所示核苷酸序列的引物的浓度为5μmol/L。
作为优选，LAMP显色液与扩增反应液的体积比为1：45。
具体的，该方法包括以下步骤：
步骤1：取待测样品与灭菌生理盐水混合，获得样品混悬液；取本发明所述的引物组与水混合，制得引物组工作液；
步骤2：取所述样品混悬液、所述引物组工作液与LAMP反应液、超纯水、LAMP密封液混合，制得扩增反应液；
步骤3：取所述扩增反应液，65℃反应30min，显色，根据显色结果判断样品是否含有腺病毒8型。
所述待测样品可为提取获得的DNA样品，也可不经提取，仅将样品与灭菌生理盐水混合后的样品混悬液。
作为优选，显色采用LAMP显色液，其中包含SYBR green I或钙黄绿素，显色结果呈现绿色则待测样品中含有Ad8，不呈现绿色则待测样品中不含有Ad8。所述不呈现绿色的情况包括：显色结果为橙色、其它颜色或无色。
LAMP反应过程快速而且高效，能够在15～45min扩增109个拷贝，而且这一过程是在60℃的恒温下进行的。因此，采用本发明提供的方法进行检测，就能够摆脱昂贵仪器的束缚。另外LAMP反应中产生大量的副产物-白色焦磷酸镁沉淀，扩增结果不需要通过电泳可以直接肉眼观察或者通过浊度仪进行判定，这些在一定程度上降低了实验的操作成本。基于LAMP反应体系的上述优点，其使用的样品可以不经过其他的提纯处理，直接就可以进行扩增反应，这为野外实地检测，临床快速检测，门诊大量检测工作等提供了技术支持。
相对于现有技术中的病原体分离法、免疫学方法、PCR法等，本发明采用的方法优势如表1：
表1本发明的优势
Figure BDA0001921826430000051
Figure BDA0001921826430000061
可见，以往方法存在着操作复杂、时间长、检测条件要求高、敏感性低、特异性差、成本高等问题，阻碍了临床推广应用。而本发明恰恰解决了上述问题。本发明分析了腺病毒8型的全基因组序列，并与其他亚型基因组进行序列比对，找到腺病毒8型的特异性保守序列(六邻体位置)，采用LAMP引物设计软件，设计了2组LAMP特异性引物，基于LAMP技术实现对腺病毒8型的特异性快速检测。本发明具有高灵敏、特异强、成本低、操作简单快速等特点，能够快速准确的检测腺病毒8型。本发明可以采用样品直接进行检测，省去了DNA提取纯化步骤，使得检测更加便捷，是腺病毒角膜炎检测方法研究的巨大进步。
实验表明，本发明提供的引物组具有良好的准确性、灵敏性和特异性。对已知样品进行检测，所得结果与预期100％匹配，最低检测限可达可达100fg/μL，而该引物组对其他病毒，如单纯疱疹病毒I型、单纯疱疹病毒II型、水痘带状疱疹病毒均未产生非特异扩增。
附图说明
图1示实施例2本发明引物组的灵敏度检测结果；
图2示实施例3本发明引物组的特异性检测结果；
图3示实施例3检测引物电泳结果。
具体实施方式
本发明提供了一种用于检测人眼表腺病毒的引物组及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的仪器、试剂皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1：本发明提供的LAMP引物组的准确性
利用本发明提供的LAMP引物组检测Ad8，实验设待测样品组合阴性对照。LAMP引物组包含如SEQ ID NO:1～6所示序列的引物。
F3:CTTACGCCGAACGAGTTTGA
B3:GCAACGGCCTTGTAATCCTT
FIP:GCATCTGGACCAGGAACCAGTC-GACGGGGAGGGCTATAACG
BIP:ATGTGCCTGAGGGCTACAAGG-CAACCACCTGCCTACTCATG
LPF:CTTGGTCATGTTGCATTGGGC
LPB:CTCCTTCTTTCGCAACTTCCAGCC
实验分组如表2所示：
表2实验分组与所用样品
待测样品1 病变角膜处组织 阴性对照1 正常角膜组织
待测样品2 病变玻璃体腔液 阴性对照2 正常玻璃体腔液
待测样品3 感染Ad8的滴眼液 阴性对照3 正常滴眼液
待测样品4 感染Ad8的镊子 阴性对照4 消毒镊子
各组实验设10次重复。
LAMP实验操作具体为：
1、样本的处理：
角膜组织：用棉拭子取病变处角膜组织和正常角膜组织，分别加入500μL灭菌生理盐水后充分震荡，尽可能将细胞洗脱，充分混匀后，取上部混悬液直接可用于LAMP反应，即为样品混悬液。
玻璃体腔液：将玻璃体腔液2μL与500μL灭菌生理盐水，充分混匀后，取上部混悬液直接可用于LAMP反应，即为样品混悬液。
滴眼液：将滴眼液与10μL与500μL灭菌生理盐水，充分混匀后，取上部混悬液直接可用于LAMP反应，即为样品混悬液。
镊子：将镊子尖端投入500μL灭菌生理盐水后充分震荡，尽可能将细胞洗脱，充分混匀后，取上部混悬液直接可用于LAMP反应，即为样品混悬液。
2、工作液的配制：
引物组工作液中包括：
如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的引物的浓度为40μmol/L；
如SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的引物的浓度为40μmol/L；
如SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的引物的浓度为20μmol/L；
如SEQ ID NO:4所示核苷酸序列的引物的浓度为20μmol/L；
如SEQ ID NO:5所示核苷酸序列的引物的浓度为5μmol/L；
如SEQ ID NO:6所示核苷酸序列的引物的浓度为5μmol/L。
选择购自广州迪奥的LAMP反应液、LAMP密封液、LAMP显色液，分别配制待测样品和阴性对照的配制LAMP扩增体系：
在小PCR管内分别加入下列组分：
Figure BDA0001921826430000081
将1μL显色剂滴在PCR管盖中间，盖紧管盖。
3、将装有待测样品和阴性对照LAMP扩增体系的PCR管放入60℃的水浴锅内，反应30分钟
4、颠倒PCR管数次，使反应液与显色液充分混匀，观察反应液颜色，若呈现绿色则为阳性，呈现橙色或其他颜色则为阴性。
实验结果表明，待测样品1～4的PCR管中皆呈现绿色，而阴性对照1～4的PCR管中皆呈现橙色。说明本发明提供的引物能够准确的分辨组织中是否含有Ad8，具有良好的准确性。
实施例2：本发明提供的LAMP引物组的敏感性
取Ad8型基因组质粒，10倍梯度稀释样品使其浓度分别为1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL，利用上述稀释后的样品检测本发明提供的LAMP引物组的敏感性。
LAMP的实验操作参照本发明实施例1。
LAMP扩增体系为：
在小PCR管内分别加入下列组分：
Figure BDA0001921826430000082
Figure BDA0001921826430000091
实验结果如图1、表3所示：
表3敏感性检测结果
样品浓度 重复1 重复2 重复3
1ng/μl 绿 绿 绿
100pg/μl 绿 绿 绿
10pg/μl 绿 绿 绿
1pg/μl 绿 绿 绿
100fg/μl 黄色 黄色 黄色
10fg/μl 橙色 橙色 橙色
结果表明，本发明提供的LAMP引物组在对Ab8基因组质粒的检测中，可准确检出的最小浓度为100fg/μL，灵敏度较高。
实施例3：本发明提供的LAMP引物组的特异性
利用眼科常见的其他病毒，如单纯疱疹病毒I型、单纯疱疹病毒II型、水痘带状疱疹病毒，对腺病毒8型的引物进行了特异性检测。具体操作同上，结果显示，特异性的腺病毒8型的引物只能特异扩增腺病毒8型，对其他病原微生物未产生扩增。
检测结果如表4、图2所示：
表4LAMP引物组的特异性检测结果
Figure BDA0001921826430000092
Figure BDA0001921826430000101
为了进一步验证本实施例的实验结果，在各PCR管中分别取5μL扩增产物，2％琼脂糖凝胶电泳，90V电压下电泳45min。电泳结果如图3，呈现绿色的扩增产物电泳后可见梯状扩增条带，符合预期，而呈橙色的扩增产物电泳后无条带。充分证明本发明提供的引物在对Ab8检测的过程中，特异性良好。
对比例1
针对Ad8型设计LAMP引物作为对照引物，对对照LAMP引物的灵敏度进行检测，引物序列为：
F3:TTCGACTCCTCGGTTAGCT
B3:AGGAGTACATGCGGTCCT
FIP:TTGGGCCACGTTATAGCCCTC-CTTACGCCGAACGAGTTTGA
BIP:TTCCTGGTCCAGATGCTTTCCC-TGTAGCCCTCAGGCACAT
LPF:CTTGGTCATGTTGCATTGGGC
LPB:CTCCTTCTTTCGCAACTTCCAGCC
实验取Ad8型基因组质粒，10倍梯度稀释样品使其浓度分别为1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL，利用上述稀释后的样品检测本发明提供的LAMP引物组的敏感性。
LAMP的实验操作参照本发明实施例1。
LAMP扩增体系为：
在小PCR管内分别加入下列组分：
Figure BDA0001921826430000102
实验结果如表5所示：
表5敏感性检测结果
样品浓度 重复1 重复2 重复3
1ng/μl 绿色 绿色 绿色
100pg/μl 绿色 绿色 绿色
10pg/μl 绿色 绿色 绿色
1pg/μl 绿色 绿色 绿色
500fg/μl 绿色 绿色 绿色
250fg/μl 绿色 绿色 绿色
125fg/μl 橙色 橙色 橙色
100fg/μl 橙色 橙色 橙色
10fg/μl 橙色 橙色 橙色
结果表明，对照LAMP引物组在对Ab8基因组质粒的检测中，可准确检出的最小浓度为250fg/μL，灵敏度不及本发明提供的引物组。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 何伟
<120> 一种用于检测人眼表腺病毒的引物组及其应用
<130> MP1829366
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cttacgccga acgagtttga 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcaacggcct tgtaatcctt 20
<210> 3
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gcatctggac caggaaccag tcgacgggga gggctataac g 41
<210> 4
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atgtgcctga gggctacaag gcaaccacct gcctactcat g 41
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cttggtcatg ttgcattggg c 21
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ctccttcttt cgcaacttcc agcc 24

Claims (10)

1.一种LAMP引物组，其特征在于，包括如SEQ ID NO:1~6所示核苷酸序列的6条引物。
2.如权利要求1所述的引物组在制备检测腺病毒8型试剂中的应用。
3.如权利要求2所述应用，其特征在于，所述检测的样品来自眼部、体表、口腔、鼻腔、医疗器械、药品、食品或化妆品。
4.如权利要求2所述应用，其特征在于，所述检测的样品为角膜组织。
5.检测腺病毒8型的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的LAMP引物组。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，还包括：LAMP反应液、LAMP密封液和LAMP显色液。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述LAMP反应液中，包括：Bst聚合酶，LAMP反应缓冲液，超纯水。
8.非诊断目的检测腺病毒8型的方法，包括：以权利要求1所述的引物组对样品进行LAMP扩增，经显色后，根据显色结果判断样品是否含有腺病毒8型。
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述LAMP扩增的温度为60℃时间为30min。
10.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述LAMP扩增的反应液体系包括：引物组工作液、LAMP反应液、样品混悬液、超纯水和LAMP密封液，
所述引物组工作液、LAMP反应液、样品混悬液、超纯水和LAMP密封液的体积比为1:12.5:2:9.5:20。
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