CN111356691A - Nir荧光探针的固相合成 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于制备近红外(NIR)荧光探针的固相方法，其特征在于基于氮杂‑双环烷烃的环状肽被Cy5.5染料部分标记，并用于肿瘤和病理区域的导向手术。

Description

NIR荧光探针的固相合成
发明领域
本发明涉及光学成像领域。更具体地，本发明涉及固相合成近红外(NIR)荧光探针(称为“DA364”)的方法，该探针包含以Cy5.5染料部分标记的基于氮杂-双环烷烃的环肽，并用于肿瘤和病理区域的引导手术。
发明背景
近红外荧光(NIRF)是用于对生理和病理状况进行成像以及在手术过程中进行可视化和指导的强大工具。实际上，NIR荧光具有穿透组织长达数厘米，减少散射并最大化外源NIR造影剂提供的背景信号对比度的优势。例如，它可用于定量体内肿瘤组织的成分，并从背景对比度变化中分辨出肿瘤。
由于这些原因，最近几年已经开发了几种包含NIR部分的诊断剂以对体内含靶标的组织成像。在广泛使用的近红外染料中，在约695nm处发射的荧光团Cy5.5已与某些靶向部分缀合，并被评估为可通过NIRF进行实时体内成像的荧光探针(例如参见Joshi B.P.等，Bioconjugate Chem.(生物缀合物化学)，2016，27，481-494)。
与生物标志物的缀合提供了更特异性的结合以及更好的摄取和保留。在适合与NIRF探针结合的靶向部分中，可以列举对特定靶标特异性的几种抗体或肽序列。广泛使用的生化工具是，例如，三肽RGD(Arg-Gly-Asp)，其可以被跨膜受体整联蛋白选择性地识别。
在光学成像领域中，本发明涉及与靶向整联蛋白过表达的肿瘤的拟肽缀合的荧光分子。更具体地说，本发明涉及一种改进的合成被称为DA364(参见下面的式I)的近红外(NIR)荧光探针的方法，该探针包含与Cy5.5染料部分缀合的基于氮杂-双环烷烃的环状肽RGD：
Figure BDA0002495599940000021
已经对DA364在术中成像中的应用进行了有效的研究。特别是，已经表明，上述式(I)化合物可以在NIR-荧光成像引导的肿瘤和病理区域治疗手术期间提供实时的肿瘤边缘检测和分界(例如，参见Conti L.等人，Contrast Media Mol.Imaging 2013，8，350-360；Lanzardo等人，Contrast Media Mol.Imaging 2011，6，449-458和WO2016/097317 A1(同一申请人)。
这种特定的化合物首先描述在Lanzardo等人的Contrast MediaMol.Imaging2011，6，449-458中，其中公开了其制备条件。如其中所述，DA364的合成涉及琥珀酰亚胺基酯Cy5.5-NHS与催化还原相应叠氮化物化合物后获得的环状拟肽(cRGD)氨基部分的反应。
叠氮化物中间体或其立体异构体的制备先前在同一申请人的专利申请WO2006/095234 A2和UniversitàdegliStudi Milano的WO2006/092722 A1中公开。特别地，WO2006/095234A2报道了一类新型的基于6,5-氮杂-双环烷烃的环肽，该环肽起着能够选择性结合整联蛋白受体的靶向部分的作用，并显示了制备与生物活性部分或成像可检测部分缀合的6,5-反式-氮杂-双环烷烃-cRGD化合物的方案(参见图3和5以及说明书的第41-48页)。
由氨基酸的非肽寡聚物部分制备的人工多肽描述在Muriel Amblard等人的US2003/191049 A1中。
官能化的氮杂-双环烷烃氨基酸的制备公开于Manzoni等人，J.Org.Chem.2005，70(10)，4124-4132中，而论文Manzoni等，Chem.Med.Chem.2009，4，615-632描述了含RGD的官能化氮杂-双环烷烃肽的制备，其从氮杂-双环烷烃骨架开始，通过溶液中的线性肽合成，然后环化RGD链。
上面引用的方法代表了溶液中目前用于制备DA364的程序，以下流程1和2对此进行了概述。
该程序包括在溶液中线性合成肽，然后在Gly和Asp残基之间环化；通过甲磺酸酯置换形成叠氮基部分；叠氮基的氢化成相应的氨基官能团；和侧链脱保护。然后，将cRGD-氮杂双环烷-NH2与荧光团Cy5.5-NHS酯缀合。
Figure BDA0002495599940000041
流程1
Figure BDA0002495599940000051
流程2
然而，上述方法在产率、时间和成本方面具有若干缺点。实际上，DA364的整体合成代表了一个漫长的过程，需要大量的反应步骤(通常至少20个)，制备时间长(以周为单位)和较低的总收率。
例如，在荧光团缀合之前，至少需要四个星期才能完成该过程的第一部分，而与Cy5.5偶联和最终产物的后处理又需要额外的几天，而回收率非常低。。
现已发现，可以在适当的固体载体上使用固相合成方便地合成这种化合物DA364。
发明简述
本发明的目的是基于固相合成方法的新的合成方法，用于制备如上所定义的式(I)的cRGD-Cy5.5缀合物(conjugate)，已发现其令人惊讶地有利于减少时间并显著提高收率。
实际上，本文所述的新方法使得可以在短时间内(通常为几天)获得最终产物，包括纯化和冻干步骤，并且实现了高达45％的总回收率(考虑以约3克的批量进行合成))。
具体而言，在通过本发明的新方法可以实现的几个优点中，值得提及的是简化了整个合成过程(相对于目前溶液中的合成步骤更少)；反应步骤的自动化，因此有利于扩大工艺规模和工业用途；完成中间化学反应后，免除了纯化步骤；并将合成过程中的产品损失降至最低。
实际上，由于是自动完成，上述合成过程可以每周运行7天，而无需人工干预。
该方法相对于当前合成的另一优点是，氮杂-双环烷烃环肽RGD与染料的缀合直接在树脂上进行，而无需事先进行肽裂解和额外纯化。结果，这种新方法大大提高了最终收率并减少了总的生产时间。
因此，根据本发明提供的几个益处，相对于目前建立的方案，可以以显著的更短的时间制备从第一氨基酸附着直到最终产物(在纯化之前)的DA364的合成。
此外，如在合成结束时所认识到的，由于将纯化步骤显著减少到仅一个，大大减少了在该新方法中使用的资源和溶剂的量。
因此，本发明可以克服当前方法的缺点，并使DA364的制备适合于放大和工业应用。
发明详述
因此，本发明的第一个目的是在固体载体上制备式(I)的cRGD-Cy5.5缀合物的方法。
Figure BDA0002495599940000071
该方法包括以下步骤：
a)在固体载体上合成式(II)的三肽
Figure BDA0002495599940000072
其中P1和P2是合适的保护基以及S是固体载体。
b)将与固相载体连接的式(II)的三肽与式(III)的氮杂-双环烷烃偶联
Figure BDA0002495599940000073
其中P3是合适的保护基，以提供式(IV)的化合物
Figure BDA0002495599940000081
其中P1、P2、P3和S如上定义；
c)从化合物(Ⅳ)中除去保护基P2和P3，得到式(Ⅴ)化合物
Figure BDA0002495599940000082
其中P1和S如上定义；
d)进行分子内环化以提供式(VI)的化合物
Figure BDA0002495599940000091
其中P1和S如上定义；
e)使所得的式(VI)化合物进行还原反应以提供相应的式(VII)氨基衍生物
Figure BDA0002495599940000092
其中P1和S如上定义；
f)将所得的式(VII)化合物与式(VIII)化合物
Figure BDA0002495599940000101
缀合，以得到式(IX)的化合物
Figure BDA0002495599940000102
其中P1和S如上定义；
g)除去保护基P1并从固体载体S上裂解肽样化合物(IX)，得到如上定义的式(I)化合物。
因此，本发明的固相合成方法可以通过以下反应流程3和3a来概括。
Figure BDA0002495599940000111
流程3
Figure BDA0002495599940000121
流程3a
在流程3和3a中，基团S代表氨基酸与其连接的固体载体(树脂)，并且P1、P2、P3和P4是合适的保护基。
在本发明的另一个实施例中，上述过程还包括以下步骤：
h)纯化步骤g)中获得的式(I)化合物，并且任选地
i)冷冻干燥终产物。
在本发明的一个优选的实施方案中，P1是磺酰基或羰基保护基。
优选地，P1选自由以下组成的组：2,2,4,6,7-五甲基-2,3-二氢-1-苯并呋喃-5-磺酰基(Pbf)、邻-硝基苯磺酰基(oNBS)、2,4-二硝基苯磺酰基(dNBS)、苯并噻唑-2-磺酰基(Bts)、2,2,5,7,8-五甲基苯并吡喃-6-磺酰基(Pmc)2,3,6-三甲基-4-甲氧基苯磺酰基(Mtr)、对-甲苯磺酰基(Tos)和叔丁氧羰基(Boc)；特别优选的是2,2,4,6,7-五甲基-2,3-二氢-1-苯并呋喃-5-磺酰基(Pbf)。
在本发明的另一个优选实施方案中，P2是由苄基或烷基表示的保护基。
优选地，P2选自由以下组成的组：烯丙基、烷基、叔丁基、三苯甲基(Trt)、2,4-二甲氧基苄基(DMB)、苄基(Bn)、9-芴基甲基(Fm)、2-氯三苯甲基(2-Cl-Trt)、2-苯基异丙基(2-PhiPr)、5-苯基-3,4-亚乙二氧基噻吩基(thenyl)衍生物(Phenyl-EDOTn)、4-(N-[1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代亚环己基)-3-甲基丁基)-氨基)苄基(Dmab)、氨基甲酰基甲基(Cam)、对-硝基苄基(pNB)、2-三甲基甲硅烷基乙基(TMSE)、(2-苯基-2-三甲基甲硅烷基)乙基(PTMSE)、2-(三甲基甲硅烷基)异丙基(Tmsi)、2,2,2-三氯乙基(Tce)、对-羟基苯甲酰甲基(p-hydroxyphenacyl)、4,5-二甲氧基-2-硝基苄基(Dmnb)、1,1-二甲基烯丙基(Dma)、五胺钴(III)、β-薄荷基(Men)、β-3-甲基戊-3-基(Mpe)、4-(3,6,9-三氧杂癸基)氧基苄基(TEGBz或TEGBn)；特别优选烯丙基。
在本发明的另一个优选实施方案中，P3是由羰基或乙酰基表示的保护基。
优选地，P3选自由以下组成的组：烯丙氧基羰基(Alloc)、苄氧基羰基(Cbz)、2-(4-联苯基)异丙氧基羰基(Bpoc)、3,5-二甲氧基苯基异丙氧基羰基(Ddz)、2-(4-硝基苯基磺酰基)乙氧基羰基(Nsc)、1,1-二氧代苯并[b]噻吩-2-基甲氧羰基(Bsmoc)、(1,1-二氧代萘并[1,2-b]噻吩-2-基)甲氧羰基(α-Nsmoc)、1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己基-1-亚基)-3-甲基丁基(ivDde)、四氯邻苯二甲酰基(TCP)、2-苯基(甲基)锍基)乙氧基羰基四氟硼酸酯(Pms)、乙磺酰基乙氧基羰基(Esc)、2-(4-磺基苯磺酰基)乙氧基羰基(Sps)、三氯乙氧基羰基(Troc)、对-硝基苄氧基羰基(pNZ)、炔丙基氧基羰基(Poc)、邻-硝基苄氧基羰基(oNZ)、4-硝基藜芦氧基羰基(NVOC)、(2-硝基苯基)丙基氧基羰基(NPPOC)、叠氮基甲基氧基羰基(Azoc)、三氟乙酰基；特别优选烯丙氧羰基(Alloc)。
式(III)的中间体化合物，其中P3是如上定义的合适的保护基，是本发明的另一个目的。
流程4描述了式(III)中间体的制备：
Figure BDA0002495599940000141
方案4
定义
在本说明书中，并且除非另外提供，否则以下术语旨在具有以下含义。
术语“偶联剂(coupling reagent)”是指用于形成羧基部分和氨基部分之间的酰胺键的试剂。该反应可以包括两个连续步骤：羧基部分的活化，然后氨基的酰化。偶联剂在本领域中是众所周知的，描述在例如，A.El-Faham和F.Albericio Chem.Rev.2011，111，6557-6602；E.Valeur和M.Bradley Chem.Soc.Rev.2009年第38卷第606-631页。本发明的偶联剂通常包括至少一种选自磷鎓、铵，亚铵鎓和酰亚胺基团的官能团，其能够与相应的羧基反应以产生活化的中间体。偶联剂的非限制性实例选自：碳二亚胺，例如N,N′-二异丙基碳二亚胺(DIC)、N,N′-二环己基碳二亚胺(DCC)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDAC)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(WSC)；磷鎓试剂，例如(苯并三唑-1-基氧基)三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐(BOP)、(苯并三唑-1-基氧基)三吡咯烷基磷鎓六氟磷酸盐(PyBOP)、7-氮杂苯并三唑-1-基氧基-三吡咯烷基-磷鎓六氟磷酸盐(PyAOP)、[乙基氰基(羟基亚氨基)乙酸-O2]三-1-吡咯烷基磷鎓六氟磷酸盐(PyOxim)、溴三吡咯烷基磷鎓六氟磷酸盐(PyBrOP)和3-(二乙氧基磷酰氧基)-1,2,3-苯并三嗪-4(3H)-酮(DEPBT)；和铵/脲鎓-亚铵鎓试剂，例如N,N,N',N'-四甲基-O-(苯并三唑-1-基)脲鎓四氟硼酸盐(TBTU)、N,N,N',N'-四甲基-O-(1H-苯并三唑-1-基)脲鎓六氟磷酸盐(HBTU)、N,N,N',N'-四甲基-O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)脲鎓六氟磷酸盐(HATU)、O-(1H-(6-氯苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HCTU)、1-[1-(氰基-2-乙氧基-2-氧代亚乙基-氨基氧基)-二甲基氨基-吗啉代]-脲鎓六氟磷酸盐(COMU)和氟-N,N,N',N'-四甲基甲脒鎓六氟磷酸盐(TFFH)。
本发明优选的偶联剂是PyAOP、HATU和COMU。
术语“保护基”是指适于保护其结合的官能团的基团。具体而言，保护基用于保护氨基或羧基官能团。适当的保护基团例如由苄基、羰基、烷基、磺酰基和乙酰基表示，其是本领域技术人员众所周知的并描述在常规手册中，例如T.W.Green，有机合成中的保护基团(Protective Groups in Organic Synthesis)，第4版(Wiley，NY 2007)。合适的保护基的实例包括但不限于甲酰基、三氟乙酰基、乙酰基、9-氟甲氧羰基(Fmoc)、苄氧羰基(Cbz)、叔丁氧羰基(Boc)、异丙氧羰基、烯丙基、烯丙氧羰基(Alloc)、苄基和三苯甲基。在这些部分中，Fmoc是优选的保护基。
氨基酸侧链可以被保护基封闭(可通过氢化、酸或碱性处理或其他条件除去)，所述保护基选自由以下组成的组：2,2,4,6,7-五甲基-2,3-二氢-1-苯并呋喃-5-磺酰基(Pbf)、邻-硝基苯磺酰基(oNBS)、2,4-二硝基苯磺酰基(dNBS)、苯并噻唑-2-磺酰基(Bts)、2,2,5,7,8-五甲基苯并吡喃-6-磺酰基(Pmc)2,3,6-三甲基-4-甲氧基苯磺酰基(Mtr)、对-甲苯磺酰基(Tos)和叔丁氧羰基(Boc)、烯丙基、烷基、叔丁基、三苯甲基(Trt)、2,4-二甲氧基苄基(DMB)、苄基(Bn)、9-芴基甲基(Fm)、2-氯三苯甲基(2-Cl-Trt)、2-苯基异丙基(2-PhiPr)、5-苯基-3,4-亚乙二氧基噻吩基(thenyl)衍生物(苯基-EDOTn)、4-(N-[1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代亚环己基)-3-甲基丁基]-氨基)苄基(Dmab)、氨基甲酰基甲基(Cam)、对-硝基苄基(pNB)、2-三甲基甲硅烷基乙基(TMSE)、(2-苯基-2-三甲基甲硅烷基)乙基(PTMSE)、2-(三甲基甲硅烷基)异丙基(Tmsi)、2,2,2-三氯乙基(Tce)、对-羟基苯甲酰基甲基、4,5-二甲氧基-2-硝基苄基(Dmnb)、1,1-二甲基烯丙基(Dma)、五胺钴(III)、β-薄荷基(Men)、β-3-甲基戊-3-基(Mpe)、4-(3,6,9-三氧癸基)氧苄基(TEGBz或TEGBn)、烯丙氧羰基(Alloc)、苄氧羰基(Cbz)、2-(4-联苯基)异丙氧羰基(Bpoc)、3,5-二甲氧基苯基异丙氧羰基(Ddz)、2-(4-硝基苯磺酰基)乙氧羰基(Nsc)、1,1-二氧代苯并[b]噻吩-2-基甲基氧羰基(Bsmoc)、(1,1-二氧代萘并[1,2-b]噻吩-2-基)甲基氧羰基(α-Nsmoc)、1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己基-1-亚基)-3-甲基丁基(ivDde)、四氯邻苯二甲酰基(TCP)、2-苯基(甲基)锍基)乙氧基羰基四氟硼酸酯(Pms)、乙磺酰基乙氧基羰基(Esc)、2-(4-磺基苯磺酰基)乙氧基羰基(Sps)、三氯乙氧基羰基(Troc)、对-硝基苄氧基羰基(pNZ)、炔丙基氧基羰基(Poc)、邻-硝基苄氧基羰基(oNZ)、4-硝基藜芦基氧基羰基(NVOC)、(2-硝基苯基)丙基氧基羰基(NPPOC)、叠氮基甲氧羰基(Azoc)和三氟乙酰基。
表述“酸/清除剂混合物(cocktail)”在其含义内包括适于除去一些保护基团的裂解酸试剂混合物，特别是Mtr(2,3,6-三甲基-4-甲氧基苯磺酰基)、Pmc(2,2,5,7,8-五甲基-6-苯并二氢吡喃-磺酰基)、OtBu(叔丁酯)、Trt(三苯甲基)、Pbf(2,2,4,6,7-五甲基-2,3-二氢-1-苯并呋喃-5-磺酰基)和BOC(叔丁氧羰基)。优选地，酸/清除剂混合物可包含TFA、三异丙基硅烷(TIS)、1,2-乙二硫醇(EDT)、苯酚、水、苯甲醚、硫代苯甲醚、1-十二烷硫醇、甲磺酸、三乙基硅烷、吲哚、二氯甲烷、二硫苏糖醇或其混合物。
详细描述
如上所述，本文所述的方法的优点是可以在几个步骤中快速而有效地提供式(I)的最终化合物。
实际上，在溶液相中进行的唯一制备是式(III)的氮杂-双环烷烃中间体的合成，其是根据流程4中所述的方法获得的。其余的合成是在固体载体上进行的，如在此详细描述的。
在固体载体上合成
根据本发明，选择在固体载体上进行合成需要重新定义化学和反应策略，特别是在选择保护基方面。
流程3中描述的合成步骤通常可以在肽合成仪上连续进行，一旦开始合成，基本上不需要人工干预，除了用于反应监测的对照取样。
试剂和溶剂的递送优选自动进行，或者自动递送至进行氨基酸活化的试剂盒，或者自动递送至反应容器。考虑到后者，实现了递送以用于允许在固体载体上进行反应或用于洗涤固体载体。而且，化学反应可以在不同的反应容器上针对不同批次进行。
典型的反应是去除保护基或两个反应性部分的偶联。
合成优选在惰性条件下进行，其中除去空气并用惰性气体如氩气或氮气代替；然而，大多数反应步骤也可以在大气条件下进行。
本领域众所周知的相关固相合成技术，例如在Merrifield等人，J.Am.Chem.Soc.1963，85，2149；Barany等人，Int.J.Peptide Protein Res.1987，30(6)，705-739和Coin等人，Nature Protocols 2007，2，3247-3256已被考虑用于本合成，并通过引用并入本文。特别地，使用碱不稳定的9-芴甲氧基羰基(9-fluoromethyloxycarbonyl)(Fmoc)基团作为保护性α-氨基的已知Fmoc固相肽合成(SPPS)方案优选地用于本发明。
树脂
根据本发明，不同的树脂可以用作合成DA364的固体载体。本领域最常用的树脂可以包括但不限于羟甲基树脂、王氏树脂(Wang resin)、2-氯三苯甲基树脂、Rink酰胺树脂(Fmoc SPPS专用)；Merrifield树脂、4-甲基二苯甲基酰胺(MBHA)树脂、肟树脂(Boc SPPS专用)。这些树脂是可商购的，并且已广泛用于肽的固相合成中。
在本发明的一个优选实施方案中，DA364的合成是使用对-苄氧基苄醇(王氏(Wang))树脂进行的，该树脂适合于具有游离羧基的氨基酸。更优选地，使用市售的Fmoc-Asp(王氏树脂)-OAll树脂，其对于合成环肽特别有用。树脂上环化是制备头尾相连(head-to-tail)环肽的最简单方法。该策略涉及经由侧链β(此处为烯丙基)将带有正交α-羧基保护的Asp或Glu残基锚定在固相上，例如在Delforge等人，Letters in Peptide Science1996，3，89-97；S.A.Kates等，Tetrahedron Lett.1993，34，1549；A.Trzeciak和W.Bannwarth,Tetrahedron Lett.1992，33，4557；C.Flouzat等，Tetrahedron Lett.1997，38，1191。
可以适当地选择该树脂，因为它带有被保护的氨基酸残基(Asp)，该残基是与王氏树脂(Wang resin)直接连接的三肽RGD的C-端氨基酸。在Asp残基的α-氨基上组装线性肽。然后除去正交的羧基保护基团(-烯丙基)，并在N-端胺和C-端羧基之间形成内酰胺桥，之后从固相上裂解所需的环状肽。
固体载体用于自动肽合成仪，可以方便地用合适的溶剂处理，例如N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基乙酰胺(DMA)、二氯甲烷(DCM)、四氢呋喃(THF)、N-甲基吗啉、可力丁六氟异丙醇(HFIP)、三氟乙醇(TFE)，优选用DMF处理，之后使用。例如，优选用DMF调节/覆盖Fmoc-Asp(王氏树脂)-OAll树脂，并使其溶胀1分钟至4小时。
Fmoc-Asp(王氏树脂)-OAll树脂的负载量通常为0至10mmol/g。在本发明的一个优选的实施方案中，树脂的负载量为0.2至4.0mmol/g；更优选地，负载量为0.3mmol/g。
氨基酸保护基
根据本发明，可以在氨基酸偶联期间用本领域公知的合适的保护基团来保护用于肽延伸中的α-氨基。例如，上面定义了合适的保护基。但是，Fmoc是优选的保护基。
此外，在反应过程中，只要化合物与树脂连接，某些氨基酸可具有被保护基封端的侧链。这些保护基在合成的每个步骤中优选在反应条件下是稳定的。实际上，在从树脂上裂解最终化合物的同时去除它们可能是有利的。在这方面，例如可以根据它们是否可通过酸或碱性处理除去而加以区分。这些保护基的实例在上面定义。
根据本发明，氨基酸精氨酸(Arg)可以优选地被酸不稳定的保护基保护。更优选地，使用保护基Pbf。
在树脂上合成氮杂-双环烷烃-cRGD(步骤a-e)
本发明的第一步骤a)涉及通过包括以下的步骤连接至树脂并添加氨基酸以形成三肽链RGD(II)：
i-用脱保护剂使α-氨基保护基脱保护；
ii-在有机溶剂中将氨基酸与偶联剂偶联；和
iii-其余胺的封端。
在每个脱保护和偶联步骤之后，用合适的洗涤溶液进行洗涤步骤。通常，洗涤溶液以极性非质子溶剂为代表，例如四氢呋喃(THF)、二氯甲烷(DCM)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)和N,N-二甲基乙酰胺(DMA)，或水或缓冲液。
根据本发明，用于脱保护、偶联和洗涤的主要溶剂包括但不限于DCM、DMF和THF。
脱保护是去除α-氨基保护基，特别是Fmoc的作用，以允许接下来的氨基酸的偶联。根据本发明，用于Fmoc保护基的脱保护剂可以是20％的哌啶在DMF中的溶液。
在α-氨基脱保护后，依次添加随后的氨基酸(Gly和Arg)以产生所需的三肽。
偶联步骤导致在氨基酸残基之间形成酰胺键，并且在偶联剂和一些增强中间体反应性的添加剂的存在下进行。
根据本发明，偶联剂可以选自通常用于肽键形成的试剂，例如选自以上报道的组。
本发明优选的偶联剂是PyAOP、HATU和COMU。
一些添加剂也可用于偶联反应中，以使过程更快更洁净。这种添加剂的实例例如由HOBt、HOAt、EDC、BOP、OxymaPure、DIC和DCC代表。在上述化合物中，HOBt、HOAt和OxymaPure是优选的实施方案。
因此，在本发明的一个优选实施方案中，通过添加活化的氨基酸，DIC作为偶联剂和OximaPure作为添加剂来进行偶联1至6小时，优选4小时。
在偶联结束时，进行封端步骤以封闭任何残留的胺。该步骤优选通过添加乙酸酐在DMF中的溶液来进行。乙酸酐溶液与树脂的活性容量之比可以为1：1至1：300(摩尔/摩尔)；优选约1∶150。
在RGD合成的最后阶段，除去了Arg的Fmoc，但是没有进行封端，并且随后无需进一步纯化就可以使用所获得的式(II)的中间体。
根据步骤b)，将与固相载体(II)连接的RGD肽与根据流程4所述的方法制备的式(III)的氮杂-双环烷烃偶联。中间体(III)可以通过四个步骤获得，从(3R,4R,6S,9S)-3-苄基氨基-1-氮杂-2-氧代-4-羟基-甲基双环[4.3.0]壬烷-羧酸叔丁酯开始，其合成描述于Manzoni等人，J.Org.Chem2005，70(10)，4124-4132(化合物25)。该化合物(X)首先在氨基上用叔丁氧羰基(Boc)保护以获得化合物(XI)，将其用MsCl和TEA活化，然后在DMF中用NaN3取代，得到化合物(XII)。后者用TFA在羧基官能团上脱保护，然后与合适的保护基P3反应，得到式(III)的氮杂-双环烷烃。
通过氮杂-双环烷烃(III)的活化可以预期根据步骤b)的偶联反应，所述活化是在选自上述那些的偶联剂和碱的存在下进行的。
优选地，偶联剂选自铵/脲鎓-亚铵试剂，并且碱是叔胺。更优选地，偶联剂是COMU，碱是N,N-二异丙基乙胺。
中间体化合物(II)和偶联剂之间的比例可以在1∶1至1∶5(摩尔/摩尔)之间。优选地，该比例在1：1,5至1：3之间，并且更优选地，其为约1：2(摩尔/摩尔)。
氮杂-双环烷烃化合物(III)与偶联剂之间的比例可以为1：0.95至1：0.99(摩尔/摩尔)，优选为约1：0.98(摩尔/摩尔)。
氮杂-二环烷烃化合物(III)与N,N-二异丙基乙胺之间的比例可以为1：2至1：5(摩尔/摩尔)，优选为约1：2(摩尔/摩尔)。
化合物(III)的活化阶段可以持续1至10分钟，优选持续3分钟。化合物(III)与化合物(II)的后续偶合阶段以提供式(IV)的拟肽化合物可以持续1至20小时。
根据本发明的优选实施方案，在反应结束时，将介质过滤并洗涤(例如用DMF)。
然后根据步骤c)使所得的式(IV)化合物脱保护。优选用于该化合物的保护基分别是在羧基官能团上的烯丙基和在氮杂-双环烷烃的氨基部分上的烯丙氧基羰基(Alloc)基团。例如，在Grieco P.等人，J.Peptide Res.，2001，57，250-256中描述了去除烯丙基/Alloc保护基的实例。
在氩气气氛下，在约3分钟的预先活化阶段下，对式(IV)的中间体上的烯丙氧基羰基和烯丙基官能团进行自动脱保护，以提供式(V)的中间体，其中加入有机硅烷，例如苯基硅烷，然后通过添加溶解在合适的溶剂如DCM中的金属催化剂如钯催化剂，该溶剂事先用氩气吹扫。优选地，所述有机硅烷是PhSiH3，以及所述催化剂是四(三苯基膦)钯(0)(Pd(PPH3)4)。
中间体(IV)与苯基硅烷的比例可以为1:10至1:50(摩尔/摩尔)；优选为约1:25(摩尔/摩尔)。
脱保护优选在搅拌下进行30-60分钟，优选40分钟。
随后在中间体(V)上进行分子内环化以提供中间体(VI)(称为步骤d))，其在碱和偶联剂(优选叔胺和铵/脲鎓-亚胺鎓试剂，更优选N,N-二异丙基乙胺和PyAOP)存在下进行1小时至20小时，优选17小时。
中间体(V)与铵/脲鎓-亚胺鎓试剂之间的比例可以为1：1至1：5(摩尔/摩尔)；优选为约1：1.5(摩尔/摩尔)。
中间体(V)与碱的比例可以为1：1至1：5(摩尔/摩尔)；优选为约1∶3(摩尔/摩尔)。
然后将介质过滤并用合适的溶剂例如DMF洗涤约5次。
步骤e)涉及将叠氮基衍生物(VI)还原为相应的氨基衍生物(VII)。这种类型的反应的一个实例，即涉及叠氮化物与膦反应的Staudinger反应，描述于Quan Tian W.等人，J.Org.Chem.2004，69，4299-4308。
还原步骤可以在有机磷化合物如三苯基膦和水的存在下于20℃至70℃之间，优选在60℃下进行5小时至20小时，优选17小时。
中间体(VI)与三苯基膦之间的比例可以为1：1至1:20(摩尔/摩尔)；优选为约1∶10(摩尔/摩尔)。
中间体(VI)与水的比例可以为1:20至1：100(摩尔/摩尔)；优选为约1:50(摩尔/摩尔)。
在反应结束时，优选将树脂洗涤，例如，将其洗涤。用1％的Et3N/DCM洗涤3次以及用Et2O洗涤2次。
荧光团与氮杂-双环烷烃-cRGD-树脂的缀合
步骤f)涉及式(VII)的拟肽与式(VIII)的荧光团Cy5.5的缀合。
在与中间体(VII)偶联生成化合物(IX)之前，需要用碱和偶联剂活化化合物(VIII)，例如1至10分钟。优选地，用叔胺和铵/脲鎓-亚胺鎓试剂进行活化3分钟，并且偶联时间可以为1至24小时。更优选地，用N,N-二异丙基乙胺和COMU进行活化，并且偶联持续约20小时。
化合物(VIII)与偶联剂之间的比例可以为1：0.95至1：0.99(摩尔/摩尔)；优选为约1∶0.98(摩尔/摩尔)。化合物(VIII)与N,N-二异丙基乙胺之间的比例可以为1：2至1：5(摩尔/摩尔)，优选为约1：2(摩尔/摩尔)。最后，过滤树脂，并用合适的溶剂例如DMF洗涤约5次。
从树脂上裂解化合物(I)并脱保护
根据步骤g)将最终的拟肽化合物(I)作为粗产物回收。
化合物(IX)中精氨酸残基上的胍基去保护并同时从树脂上裂解最终产物，产生天冬氨酸残基的羧基，可以根据众所周知的技术进行(例如在Solé，N.A.等人，J.Org.Chem.1992，57，5399-5403；Huang，H.等人，J.Peptide Res.1999，53，548-553；King，D.等人，Int.J.Peptide Protein Res.1990，36，255-266；Bonner，A.G.等人，J.PeptideRes.2001，57，48-58；Albericio，F.等人，J.Org.Chem.1990，55，3730-3743)，用有效的酸/清除剂混合物，例如TFA/三异丙基硅烷(TIS)/H2O，得到式(I)的化合物。TFA、TIS和水之间的比例可以是80/10/10至95/2.5/2.5；优选为95/2.5/2.5。
脱保护可以在搅拌下，在室温和黑暗中进行1小时至8小时，优选3小时。然后将反应混合物过滤，并且蓝色溶液可以用乙醚洗涤。
纯化最终的式(I)的粗化合物
沉淀后最终回收最终的粗产物(I)，并根据步骤h)用制备型HPLC系统纯化。然后可以根据步骤i)任选地将分离的化合物的合并的级分冻干。
制备型HPLC可使用制备柱进行，该柱具有专用于反相HPLC的固定相，用适当的流动相洗脱感兴趣化合物(处在纯级分中)。在从固相载体上裂解拟肽残基后，将HPLC用于从粗溶液中分离和纯化高纯度目标化合物。
例如，制备型反相HPLC可以方便地在带有RP-HPLC Luna Phenomenex C18制备柱(250x10mm)的AKTA PURE 25系统上进行。可以通过用从0到95％乙腈与0.1％TFA的线性梯度洗脱来进行纯化。
如上所述，由于在最后阶段仅剩下一个纯化步骤以收集纯产物，因此大大减少了整个合成中分配的纯化时间。
在以下部分中描述的本发明及其特定实施例仅是示例性的，并且不应当被视为对本发明的限制：它们示出了本发明是如何可以被实施的并且仅是示例性的，并不限制本发明的范围。
实验部分
材料和设备
用于合成DA364的所有市售试剂无需进一步纯化即可使用。
在由SHIMADZU UFLC二元溶剂管理器、SHIMADZU UFLC控制器(CBM-20A)和配备了RP-HPLC Luna PhenomenexC18分析柱(250x4.6mm)的SHIMADZU HPLC UV-VIS检测器(SPD-20A)组成的SHIMADZU UFLC系统上进行反相HPLC分析。以1.0mL/min，使用A相(10mM AcONH4的H2O溶液)和B相(10mM AcONH4的ACN/H2O 9/1溶液)的线性梯度或A相(0.1％TFA的H2O溶液)和B相(0.1％TFA的CAN溶液)的线性梯度进行分析，在214nm处进行UV检测。进样量为20μL，柱温不受控制。
在配备有RP-HPLC Luna Phenomenex C18制备柱(250x10mm)的AKTA PURE 25系统上进行制备型反相HPLC。通过用从0到95％乙腈与0.1％TFA的线性梯度洗脱进行纯化。
在Agilent 1100LC/MSD仪器上进行质谱分析。
来自Gyros Protein Technologies的TRIBUTE肽合成仪用于固相合成。
单个氨基酸残基的缩写是常规的：Asp或D是天冬氨酸，Gly或G是甘氨酸，Arg或R是精氨酸。除非另有说明，否则本文所指的氨基酸应理解为L-异构体构型。
缩略语表
Alloc 烯丙氧羰基
API 活性药物成分
BOP (苯并三唑-1-基氧基)三(二甲氨基)磷鎓六氟磷酸盐
COMU (1-氰基-2-乙氧基-2-氧代亚乙基氨基氧基)二甲基氨基吗啉代碳
鎓六氟磷酸盐
Cy5.5 磺基花青5.5羧酸
DCC N,N'-二环己基碳二亚胺
DCM 二氯甲烷
DEPBT 3-(二乙氧基磷酰氧基)-1,2,3-苯并三嗪-4(3H)-酮
DIC N,N'-二异丙基碳二亚胺
DIPEA or DIEA N,N-二异丙基乙胺
DMA 二甲基乙酰胺
DMF 二甲基甲酰胺
EDAC 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺
EDC 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺
Eq. 当量
Et3N 三乙胺
Et2O 乙醚
Fmoc 芴基甲氧羰基
HATU (1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓
3氧化六氟磷酸盐)
HBTU N,N,N',N'-四甲基-O-(1H-苯并三唑-1-基)脲鎓六氟磷酸盐
H2O 水
HOAt 1-羟基-7-氮杂苯并三唑
HOBt 羟基苯并三唑
HPLC 高效液相色谱
NMP N-甲基-2-吡咯烷酮
OAll 烯丙酯
OxymaPure 氰基(羟基亚氨基)乙酸乙酯
Pbf 2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基
Pd(PPh3)4 四(三苯基膦)钯(0)
PhSiH3 苯基硅烷
PPh3 三苯基膦
PyAOP 7-氮杂苯并三唑-1-基氧基三吡咯烷基-磷鎓六氟磷酸盐
PyBOP 苯并三唑-1-基-氧三吡咯烷基磷鎓六氟磷酸盐
PyOxim [氰基(羟基亚氨基)乙酸乙基酯-O2]三-1-吡咯烷基磷鎓六氟磷酸盐
PyBrOP 溴三吡咯烷基磷鎓六氟磷酸盐
TBTU N,N,N',N'-四甲基-O-(苯并三唑-1-基)脲鎓四氟硼酸铀
TFA 三氟乙酸
TFFH 氟-N,N,N',N'-四甲基甲脒鎓六氟磷酸盐
THF 四氢呋喃
TIS 三异丙基硅烷
实施例1：式(I)化合物的合成
根据流程3中报道的步骤进行式(I)化合物的合成。使用比色试验(TNBS)和在301nm下的二苯并富勒烯-哌啶加合物的UV监测来追踪反应进程，在每次Fmoc-脱保护步骤后将其除去。
步骤a)三肽RGD合成
通过标准的Fmoc-固相策略使用Fmoc-Asp(王氏树脂)-OAll作为固体载体(1000mg，负载量：0.469mmol/g，活性容量：0.469mmol)进行肽合成。使用40mL的反应器。用10mL DMF覆盖树脂并使其溶胀10分钟。将该操作再重复3次。用10mL的20％(v/v)哌啶/DMF对已装载的氨基酸(Fmoc-Asp-OAll)进行Fmoc脱保护30秒钟。接下来，将Fmoc-Gly-OH用8mLDIC/OxymaPure溶液活化10分钟，然后再添加到先前附着在固相载体上的Fmoc脱保护氨基酸上。每次偶联后，为了封闭未反应的游离氨基，用8mL乙酸酐(150eq.)进行封端5分钟。
然后，用10mL的20％(v/v)哌啶/DMF对新近添加到生长结构上的Fmoc-Gly-OH进行Fmoc脱保护30秒。之后，将Fmoc-Arg(Pbf)-OH用8mL DIC/OxymaPure溶液活化10分钟，然后添加到先前的Gly上。然后，进行用8mL乙酸酐(150eq.)的封端5分钟。最后的残留物用10mL的20％(v/v)哌啶/DMF进行Fmoc脱保护30秒钟。最后，将树脂上的偶联产物用8mL MeOH洗涤3次，持续30秒钟。然后将所获得的中间体(II)无需进一步纯化即可使用。
步骤b)氮杂-双环烷烃与RGD的偶联
根据以上流程4和实施例2中所述的方法合成中间体化合物(III)。
中间体(II)在DCM中溶胀。然后，在另一个烧瓶中，将中间体(III)(38.5μmol)用HATU(37.7μmol)和DIPEA(77.0μmol)活化3分钟，然后加入到包含中间体(II)的混合物中并搅拌。偶联反应持续20小时，然后过滤介质。加入DMF(3mL)，并将介质搅拌30秒。然后，将DMF过滤，并将洗涤步骤再重复4次。由此获得的中间体(IV)无需进一步纯化即可使用。
步骤c)烯丙基-Alloc脱保护
在进行反应之前，将装置系统用氮气惰化。然后通过添加PhSiH3(0.963mmol)活化中间体(IV)，使其反应3分钟。之后，添加Pd(PPh3)4(15.4μmol)，脱保护持续40分钟。反应完成后，将树脂用4mL DCM洗涤四次，每次30秒，用4mL二恶烷：H2O(9：1)溶液洗涤1次，持续1分钟，用4mL DMF洗涤1次，持续2分钟，用4mL DCM洗涤2次，每次2分钟。用新鲜的Pd(PPh3)4溶液将整个脱保护过程重复两次。然后无需进一步纯化即可使用所获得的中间体(V)。
步骤d)氮杂-双环烷-RGD的环化
用PyAOP(57.8μmol)和DIPEA(116μmol)活化中间体(V)，并将反应介质搅拌17小时。偶联完成后，将溶液过滤并加入3mL DMF，将介质搅拌30秒。然后过滤DMF，并且将该洗涤步骤再重复四次。
然后无需进一步纯化即可使用所获得的中间体(VI)。
步骤e)叠氮化物的还原
中间体(VI)在THF中溶胀。然后，在60℃下在THF中通过添加PPh3(385μmol)和H2O(1.925mmol)进行还原并搅拌所述介质17小时。反应完成后，将树脂用5mL的1％Et3N/DCM溶液洗涤3次，每次2分钟，和用5mL的Et2O洗涤两次，每次2分钟。
然后无需进一步纯化即可使用所获得的中间体(VII)。
步骤f)用荧光团Cy5.5标记
用COMU(6.30mg)和DIPEA(1.5eq)活化中间体(VIII)3分钟，然后将其加入溶解在DMF中的中间体(VII)中。偶联反应持续20小时。最后，过滤树脂并加入3mL DMF，搅拌介质30秒。然后，将DMF过滤，并将洗涤步骤再重复4次。
步骤g)裂解和脱保护
将新鲜制备的TFA/清除剂混合物(2mL的三氟乙酸：三异丙基硅烷：水的95：2.5：2.5溶液)添加到前一步骤f)中获得的粗产物中，并将混合物在室温下搅拌3h。然后将反应混合物过滤并将蓝色溶液用8mL的乙醚洗涤3次。最终获得粗制的最终化合物(I)。
步骤h)纯化
将化合物(I)的最终粗产物在RP-HPLC Luna Phenomenex C18制备柱(250×10mm)上通过用0至95％乙腈与0.1％TFA的线性梯度洗脱进行纯化。通过分析型HPLC-UV和质谱分析收集的级分。合并目标级分，并蒸发乙腈。
步骤i)冻干
将所得溶液在-40℃的异丙醇浴中冷冻。然后将产物冻干12小时，并回收为蓝色粉末。
实施例2：合成式(III)的化合物，其中P3是Alloc
式(III)的化合物的合成根据流程4中报道的步骤进行。
化合物(XI)的合成
将BOC2O(2.34g，10mmol)添加至化合物(X)(1.9g，6.68mmol)(Manzoni等，J.Org.Chem.2005，70(10)，4124-4132)的THF(20毫升)溶液中。将混合物搅拌2h，然后蒸发溶剂，并将粗产物(2.6g)直接用于下一步骤。收率定量。
化合物(XII)的合成
在0℃下，将甲磺酰氯(1.1mL，14.2mmol)缓慢加入化合物(XI)(2.57g，6.68mmol)的无水CH2Cl2(20mL)溶液中。然后加入Et3N(4mL，28.4mmol)。将反应混合物在0℃下再搅拌1小时，温热至室温并用NH4Cl(2×5mL)洗涤。分离有机相，并减压除去溶剂，得到粗甲磺酸酯，将其在室温下溶于DMF(20mL)。加入NaN3(5.4g，83.1mmol)，并将反应混合物在60℃加热并搅拌3h。在真空下蒸发DMF，并将粗产物用H2O(15mL)洗涤，并用EtOAc(15mL)萃取。分离有机相，残余物通过柱色谱法纯化(CH2Cl2/iPrOH＝130/0.8)，得到1.6g化合物(XII)。收率58％。
化合物(III)的合成
将化合物(XII)(1.6g，3.9mmol)的三氟乙酸(20mL)溶液在室温搅拌18h。蒸发三氟乙酸，并将粗产物在氮气氛下溶于无水THF(25mL)中。加入二碳酸二烯丙酯(0.87g，4.7mmol)，并将混合物在55℃搅拌24h。除去溶剂，并将粗产物通过柱色谱法纯化(CH2Cl2/MeOH/NH3 8/2/0.2→7/3/0.3)，得到1.03g化合物(III)。收率78％。

Claims (14)

1.一种在固体载体上制备式(I)的cRGD-Cy5.5缀合物的方法
Figure FDA0002495599930000011
该方法包括以下步骤：
a)在固体载体上合成式(II)的三肽
Figure FDA0002495599930000012
其中P1和P2是合适的保护基以及S是固体载体；
b)将与固相载体连接的式(II)的三肽与式(III)的氮杂-双环烷偶联
Figure FDA0002495599930000021
其中P3是合适的保护基，以提供式(IV)的化合物
Figure FDA0002495599930000022
其中P1，P2，P3和S如上定义；
c)从化合物(Ⅳ)中除去保护基P2和P3，得到式(Ⅴ)化合物
Figure FDA0002495599930000023
其中P1和S如上定义；
d)进行分子内环化以提供式(VI)的化合物
Figure FDA0002495599930000031
其中P1和S如上定义；
e)使所得的式(VI)化合物进行还原反应以提供相应的式(VII)氨基衍生物
Figure FDA0002495599930000032
其中P1和S如上定义；
f)将所得的式(VII)化合物与式(VIII)化合物缀合
Figure FDA0002495599930000041
以得到式(IX)的化合物
Figure FDA0002495599930000042
其中P1和S如上定义；
g)除去保护基P1并从固体载体S上裂解肽样化合物(IX)，得到如上定义的式(I)化合物。
2.根据权利要求1的方法，进一步包括以下步骤：
h)纯化步骤g)中获得的式(I)化合物，并且任选地
i)冷冻干燥终产物。
3.根据权利要求1或2的方法，其中P1是选自以下的保护基：2,2,4,6,7-五甲基-2,3-二氢-1-苯并呋喃-5-磺酰基(Pbf)、2 3,6-三甲基-4-甲氧基苯-磺酰基(Mtr)、对甲苯磺酰基(Tos)、三氟乙酰基邻-硝基苯磺酰基(oNBS)、2,4-二硝基苯磺酰基(dNBS)、苯并噻唑-2-磺酰基(Bts)、2,2,5,7,8-五甲基二氢苯并吡喃-6-磺酰基(Pmc)2,3,6-三甲基-4-甲氧基苯-磺酰基(Mtr)、对-甲苯磺酰基(Tos)、三氟乙酰基和叔丁氧羰基(Boc)；P2是选自以下的保护基：烯丙基、烷基、叔丁基、三苯甲基(Trt)、2,4-二甲氧基苄基(DMB)、苄基(Bn)、9-芴基甲基(Fm)、2-氯三苯甲基(2-Cl-Trt)、2-苯基异丙基(2-PhiPr)、5-苯基-3,4-亚乙二氧基噻吩衍生物(Phenyl-EDOTn)、4-(N-[1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代亚环己基)-3-甲基丁基]-氨基)苄基(Dmab)、氨基甲酰基甲基(Cam)、对-硝基苄基(pNB)、2-三甲基甲硅烷基乙基(TMSE)、(2-苯基-2-三甲基甲硅烷基)乙基(PTMSE)、2-(三甲基甲硅烷基)异丙基(Tmsi)、2,2,2-三氯乙基(Tce)、对-羟基苯甲酰基甲基、4,5-二甲氧基-2-硝基苄基(Dmnb)、1,1-二甲基烯丙基(Dma)、五胺钴(III)、β-薄荷基(Men)、β-3-甲基戊-3-基(Mpe)和4-(3,6,9-三氧杂癸基)氧基苄基(TEGBz或TEGBn)；以及P3是选自以下的保护基：烯丙氧基羰基(alloc)、苄氧基羰基(Cbz)、2-(4-联苯基)异丙氧基羰基(Bpoc)、3,5-二甲氧基苯基异丙氧基羰基(Ddz)、2-(4-硝基苯磺酰基)乙氧基羰基(Nsc)、1,1-二氧代苯并[b]噻吩-2-基甲基氧羰基(Bsmoc)、(1,1-二氧代萘并[1,2-b]噻吩-2-基)甲基氧羰基(α-Nsmoc)、1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己-1-亚基)-3-甲基丁基(ivDde)、四氯邻苯二甲酰基(TCP)、2-苯基(甲基)锍基)乙氧基羰基四氟硼酸酯(Pms)、乙磺酰基乙氧基羰基(Esc)、2-(4-磺基苯基磺酰基)乙氧羰基(Sps)、三氯乙氧羰基(Troc)、对-硝基苄氧羰基(pNZ)、炔丙基氧羰基(Poc)、邻-硝基苄氧羰基(oNZ)、4-硝基藜芦氧羰基(NVOC)、(2-硝基苯基)丙基氧羰基(NPPOC)、叠氮基甲基氧羰基(Azoc)和三氟乙酰基。
4.根据权利要求3的方法，其中P1为2,2,4,6,7-五甲基-2,3-二氢-1-苯并呋喃-5-磺酰基(Pbf)，P2为烯丙基且P3为烯丙氧基羰基(Alloc)。
5.根据权利要求1的方法，其中步骤b)、d)和f)在偶联剂和碱的存在下进行。
6.根据权利要求5的方法，其中所述偶联剂选自由以下组成的组：N,N,N′,N′-四甲基-O-(苯并三唑-1-基)脲鎓四氟硼酸盐(TBTU)、N,N,N′,N′-四甲基-O-(1H-苯并三唑-1-基)脲鎓六氟磷酸盐(ΗBTU)、N,N,N′,N′-四甲基-O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)脲鎓六氟磷酸盐(HATU)、O-(1H-6-氯苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HCTU)、1-[1-(氰基-2-乙氧基-2-氧代亚乙基-氨基氧基))-二甲基氨基-吗啉代]-脲鎓六氟磷酸盐(COMU)和氟-N,N,N′,N′-四甲基甲脒鎓六氟磷酸盐(TFFH)，并且所述碱是叔胺。
7.根据权利要求6的方法，其中在步骤b)中，偶联剂是1-[1-(氰基-2-乙氧基-2-氧代亚乙基-氨基氧基)-二甲基氨基-吗啉代]-脲鎓六氟磷酸盐(COMU)以及碱是N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)。
8.根据权利要求6的方法，其中在步骤d)中，偶联剂是7-氮杂苯并三唑-1-基氧基-三吡咯烷基-磷鎓六氟磷酸盐(PyAOP)以及碱是N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)以及式(V)的中间体、偶联剂和碱之间的比例为约1∶1,5∶3(摩尔/摩尔)。
9.根据权利要求5的方法，其中式(II)的中间体与偶联剂之间的比例为约1∶2(摩尔/摩尔)；式(III)的中间体与偶联剂之间的比例为约1∶0.98(摩尔/摩尔)；以及式(III)的中间体与N,N-二异丙基乙胺之间的比例为约1∶2(摩尔/摩尔)。
10.根据权利要求1的方法，其中步骤c)在氩气气氛下在有机硅烷化合物和催化剂的存在下用3分钟的预先活化阶段来进行。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述有机硅烷是苯基硅烷(PhSiH3)，所述催化剂是四(三苯基膦)钯(0)(Pd(PPH3)4)，并且所述中间体(IV)与所述苯基硅烷之间的比例为约1:25(摩尔/摩尔)。
12.根据权利要求1的方法，其中步骤e)在有机磷化合物和水的存在下于20℃至70℃进行5至20小时。
13.根据权利要求1的方法，其中步骤f)通过优选用N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)和1-[1-(氰基-2-乙氧基-2-氧代亚乙基-氨基氧基)-二甲基氨基-吗啉代]脲鎓-六氟磷酸盐(COMU))预先活化式(VIII)中间体来进行。
14.式(III)的中间体化合物
Figure FDA0002495599930000071
其中P3是合适的保护基。
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