CN111351889A - 一种分离筛查三明尤溪烟叶中清甜香成分的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明一种分离筛查三明尤溪烟叶中清甜香特成分的方法，具体包括以下步骤：(1)用水、有机溶剂或二者的混合溶剂对所述烟叶进行提取，得到烟叶提取液，浓缩所述烟叶提取液得到烟叶浸膏；(2)用凝胶渗透色谱法对步骤(1)所述烟叶浸膏进行分离，得到多个流分；(3)对步骤(2)中得到的流分进行香气评价，合并其中清甜香香韵特征突出的流分并浓缩，得清甜香浓缩物；(4)以氘代萘和氘代蒽作为内标，采用GC×GC‑TOF MS对步骤(3)所得清甜香浓缩物进行分析，得到所述清甜香浓缩物中的化学成分及浓度；(5)以OAV(香气活性值，Odor activity value)作为评价标准，从步骤(4)所分析得出的化学成分中选择得到所述清甜香成分。所述方法可快速、简单、全面地对烟叶中清甜香成分进行筛查。

Description

一种分离筛查三明尤溪烟叶中清甜香成分的方法
技术领域
本发明属于分离鉴定技术领域，具体涉及一种从三明尤溪烟叶中提取、分离和筛查清甜香成分的方法。
背景技术
在全国烤烟烟叶香型风格区划中，三明尤溪烟叶风格特征是以干草香、清甜香、蜜甜香为主体，辅以青香、醇甜香、木香、烘焙香、焦香、花香、辛香等，其特征为清甜香突出，蜜甜香明显，花香微显，香韵种类丰富。清甜香作为三明尤溪烟叶最主要的香韵特征，是烟叶中所具有的清新自然甜的特征芳香气息，所发出的香气清甜浓香，亦清亦甜，柔清温甜，清雅而飘逸[1]。分离筛查清甜香成分对提高烟叶化学成分与香韵之间关系的认知具有重要作用。烟叶中清甜香成分种类较多，但含量极微，现有技术中缺乏有效的分离分析方法。
事实上，复杂体系中致香成分的感官贡献机制十分复杂，香气化合物浓度和香气强度并非简单的正比关系，仅通过化学成分的含量比较并不能完整揭示出香味成分对香韵的贡献大小。不同香气成分的混合，可能会存在协同或抑制效应。将成分间的协同作用留给经验性实验，尽可能明确体系中各种香气成分对香型风格的感官贡献度和贡献类型，有助于对复杂体系的香气特征进行相对精准的把握。而香气活性值(Odor activity value，OAV)从浓度和阈值两个维度上揭示了香气成分对香气体系的贡献度，是表征关键香气成分的一种有效技术手段。
发明内容
本发明提供了一种分离筛查烟叶中清甜香成分的方法，该方法通过凝胶色谱法对烟叶浸膏进行分离，并通过感官评价筛查富集清甜香香韵突出的流分，采用GC×GC-TOF MS对其进行定性和半定量分析，进一步以香气活性值(OAV)为标准，从中筛选出对烟叶清甜香香韵具有贡献的化学成分。所述方法可对烟叶中清甜香成分进行比较全面的分离和分析，对认知烟叶中关键清甜香成分具有重要作用。
本发明的一个方面提供一种分析烟叶中清甜香成分的方法，其包括以下步骤：
(1)用水、有机溶剂或二者的混合溶剂对所述烟叶进行提取，得到烟叶提取液，浓缩所述烟叶提取液得到烟叶浸膏；
(2)用凝胶渗透色谱法对步骤(1)所述烟叶浸膏进行分离，得到多个流分；
(3)对步骤(2)中得到的流分进行香气评价，合并其中清甜香香韵特征突出的的流分并浓缩，得清甜香浓缩物；
(4)以氘代萘和氘代蒽作为内标，采用GC×GC-TOF MS对步骤(3)所得清甜香浓缩物进行分析，得到所述清甜香浓缩物中的化学成分及浓度；
(5)以OAV(香气活性值，Odor activity value)作为评价标准，从步骤(4)所分析得出的化学成分中选择得到所述清甜香成分。
在一些实施方案中，所述烟叶为三明尤溪烟叶。在一些优选的实施方案中，所述烟叶为复烤三明尤溪烟叶。
在一些实施方案中，步骤(2)中所述凝胶渗透色谱法的填料选自Sephadex G-10、Sephadex G-15、Sepharose 6B、Sepharose ConA、Sephadex G-25和Sephadex LH-20，优选Sephadex G-10、Sephadex G-15或Sephadex LH-20，更优选Sephadex LH-20。在一些实施方案中，所述凝胶渗透色谱法采用玻璃层析柱(2.6cm×100cm)(例如瑞士Buchi公司)进行分离。在一些实施方案中，以下述溶剂作为流动相进行洗脱：乙醇、丙醇、异丙醇、丙二醇、水、或其混合体系，优选乙醇。在一些实施方案中，所述流动相的流速为1-8mL/min(例如1mL/min，2mL/min，3mL/min，4mL/min，5mL/min，6mL/min，7mL/min或8mL/min)。
在一些实施方案中，步骤(1)中所述提取操作如下所述：用50％-95％乙醇(例如50％乙醇、70％乙醇或95％乙醇)、二氯甲烷或水作为溶剂，在50℃-80℃或者回流条件下对所述烟叶提取10min-2h(例如10min、30min、1h或2h)。在一些实施方案中，步骤(1)中所述浓缩为减压浓缩。在一些实施方案中，控制浓缩液密度为1.36-1.42g/cm3。
在一些实施方案中，在步骤(4)中，所述GC×GC-TOF MS色谱分析条件选自下述的一项或多项：
(1)色谱柱一：HP-5MS(60m×0.25mm×0.25μm)；
(2)色谱柱二：DB-l7(2.3m×0.1mm×0.1μm)；
(3)柱温程序：50℃(1min)→3℃/min→220℃→2℃/min→260℃(10min)；
(4)载气：He；
(5)载气控制方式：恒流，1-1.5mL/min；
(6)进样口温度：250-300℃；
(7)调制周期：3-6秒；
(8)进样量：1μL；
(9)分流模式：分流进样，分流比10-30:1。
在一些实施方案中，在步骤(4)中，所述GC×GC-TOF MS质谱分析条件选自下述的一项或多项：
(1)离子化方式：EI；
(2)离子源温度：220-280℃；
(3)GC/MS传输线温度：250-260℃；
(4)EI电离能量：70eV；
(5)溶剂延迟时间：7-16min；
(6)采集方式：全扫描Scan；
(7)质量范围：45～450amu。
在一些实施方案中，所述步骤(4)具体包括以下步骤：
(4-1)以氘代萘和氘代蒽作为内标，采用GC×GC-TOF MS对步骤(3)所得清甜香浓缩物进行检测，得色谱和质谱；
(4-2)在NIST标准图谱库中对步骤(4-1)所得质谱与化合物标准质谱进行匹配，选择正向和反向匹配度均大于700(例如大于800，大于900或者大于999)的化合物，即确定相应色谱峰所对应的化学成分，并利用内标法计算该化学成分的浓度。
在一些实施方案中，所述步骤(5)具体包括以下步骤：
(5-1)确定步骤(4)中所述各化学成分的香气阈值(单位：μg/mL)(例如通过查阅文献，或者按照GB/T 22366-2008中“最优估计阈值的估计”的方法确定所述阈值)，通过公式OAV＝C/T计算OAV，其中C为根据步骤(4)所测得的各化学成分的浓度(单位：μg/mL)；
(5-2)OAV越大，表示相应化学成分对清甜香韵的贡献越大，反之表示相应化学成分对清甜香韵的贡献越小。
在另一个方面，本发明提供一种组合物或者由上述方法制备得到的组合物。
在一些实施方案中，所述组合物中含有顺式-3-己烯醛、反式-2-顺式-6-壬二烯醛、β-大马烯酮、β-大马酮、β-紫罗兰酮、香叶基丙酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮、壬醛、二氢猕猴桃内酯、巨豆三烯酮A、巨豆三烯酮B、巨豆三烯酮D、反式-2,4-癸二烯醛、4-甲基苯乙酮、反式-2-壬烯醛、正己醛、乙醛和反式,反式-2,4-庚二烯醛中的任一种或多种。
在一些实施方案中，所述组合物中含有顺式-3-己烯醛、反式-2-顺式-6-壬二烯醛、β-大马烯酮、β-大马酮、β-紫罗兰酮、香叶基丙酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮、壬醛、二氢猕猴桃内酯、巨豆三烯酮A、巨豆三烯酮B、巨豆三烯酮D、反式-2,4-癸二烯醛、4-甲基苯乙酮、反式-2-壬烯醛、正己醛、乙醛、反式,反式-2,4-庚二烯醛、正戊醛、山梨醛、2-甲基-2-丁烯醛、青叶醛、2-甲基-2-戊烯醛、6-甲基-2-庚酮、反式-2-庚烯醛、苯乙酮、6-甲基-5-辛烯-2-酮、茶香酮、苯丙酮、橙花醛和茄酮中的任一种或多种。
在另一个方面，本发明提供一种香精，其含有上述的组合物。在一些实施方案中，所述香精为烟用香精。
在另一个方面，本发明提供上述的方法、组合物或香精在制备卷烟中的用途。
发明的有益效果
本发明提供一种分析烟叶中清甜香成分的方法，其通过凝胶色谱柱对烟叶浸膏进行分离，并通过感观评价筛查并富集清甜香香韵突出的流分，采用GC×GC-TOF MS对其进行定性和半定量分析，以OAV为标准，从中筛选出对烟叶清甜香香韵具有贡献的化学成分。所述方法可实现下述至少一种技术效果：
1、所述方法可用于分离筛查烟叶中具有清甜香特征的化学成分，并对清甜香成分进行半定量分析。
2、所述方法可通过测定各清甜香成分的香气活性值(OAV)，确定各清甜香成分对清甜香香韵的贡献大小。
3、所述方法可对烟叶中清甜香成分进行比较全面的分离和分析，对认知烟叶中关键清甜香成分具有重要作用。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
三明尤溪烟叶提取
取100g三明尤溪YLC01-2016烟叶使用800g 95％乙醇溶剂提取，水浴温度控制在80℃，提取时间1h。所得烟叶醇提液采用减压浓缩，控制浓缩液密度在1.38g/cm3，得到32.4g烟叶浸膏。
凝胶色谱柱分级分离
将上述2g烟叶醇提物浸膏溶解于4mL无水乙醇中，充分震荡后过滤，过滤后的样品进行凝胶渗透色谱分离，填料为Sephadex LH-20，以无水乙醇为流动相，流速为4mL/min。通过流分收集器每3min收集一个流分，共收集30个流分，分别标记为F1、F2、F3、F4、F5、F6……F30。由6位评香人员逐一流分进行嗅觉特征评价(参照GB/T 14454.2-2008)，经评香人员讨论确认，把上述流分评价结果中嗅觉特征表现接近的进行合并，目的是使得具有相似香韵的化学成分尽可能富集，从而有利于痕量成分的分析，合并后的组分再进行嗅觉特征评价得出最后评价结果，，其中清甜香为主要香韵特征的流分评价结果为：
表1流分分组情况
组分 流分 嗅觉特征评价
1 F1～F10 主要香韵为清甜香，花香，干草香
2 F11～F14 主要香韵为青滋香，花香，酮甜，底带有干草香
说明在此分离条件下能实现分离和富集具有清甜香香韵的化学成分的目的。当把组分1-2收集合并后，整体嗅香评价结果为：浓郁的清甜香，带有花香，干草香，其清甜香香韵特征与原烟叶浸膏的清甜香香韵特征很相似，因此把组分1-2作为关键清甜香香韵特征组分。
定性分析
将组分1和2收集合并后减压浓缩至1.5mL，利用全二维气相色谱-飞行时间质谱联用仪(GC×GC-TOF)进行分析。
所述色谱分析条件：
美国LECO公司的全二维气相色谱-飞行时间质谱联用仪(GC×GC-TOF)；色谱柱一：HP-5MS(60m×0.25mm×0.25μm)；色谱柱二：DB-l7(2.4m×0.1mm×0.1μm)；柱温程序：50℃(1min)→3℃/min→220℃→2℃/min→260℃(10min)；载气：He；载气控制方式：恒流，1mL/min；进样口温度：280℃；调制周期：5sec；进样量：1μL；分流模式：分流进样，分流比10:1。
所述质谱条件
离子化方式：EI；离子源温度：230℃；GC/MS传输线温度：260℃；EI电离能量：70eV。溶剂延迟时间：7min；采集方式：全扫描Scan；质量范围：45～450amu。
所述内标物：氘代萘、氘代蒽。
通过检索结果进行人工核对，挑选正向检索匹配度大于800，并结合对烟叶致香成分的认识，通过文献查阅致香成分的香韵表现，最后共定性出33种对三明尤溪烟叶清甜香特征产生直接贡献的成分，其名称和嗅觉特征如表2所示。
表2定性出的33种对清甜香香韵有直接贡献的化学成分
Figure BDA0002416182710000071
Figure BDA0002416182710000081
Figure BDA0002416182710000091
Figure BDA0002416182710000101
OAV值分析
对于食品领域而言，在计算气味活性值时，使用香气物质在水作为介质的觉察阈值数据更符合实际，而香气物质在烟叶化学成分如此复杂、相互影响的体系下，测定其觉察阈值到目前为止仍是极大的挑战，在未找到更好的测定方法前，只能借鉴食品领域中香气物质在水中的觉察阈值来代表其实际的觉察阈值。鉴于Leffingwell具有烟草香料研究背景，优先使用Leffingwell&Associates网站提供的阈值；若该网站没有其阈值数据，则通过检索Odour thresholds获得，并优先使用最新日期的阈值数据。如果通过两者都没有得到阈值数据，则参考行业内已报道的相关单体香料阈值数据。
结合鉴定出的化学成分的半定量数据和文献或书籍中查到的觉察阈值，进而通过以下公式得到每种成分的香气活性值(OAV)
OAV＝C/T
其中C为香气成分在香气体系中的质量浓度(μg/mL)T为香气阈值(μg/mL)。
表3清甜香特征赋予组群的OAV值
Figure BDA0002416182710000111
Figure BDA0002416182710000121
[a]未找到相关阈值数据；[b]在空气介质中的阈值数据，作为参考；[c]在水和丙二醇体积比1:1的混合溶剂体系中的阈值数据，作为参考。
由于有一个成分缺乏阈值数据，若干个成分提供的是在其他体系下测定的阈值数据，与其他成分在水中测定的阈值数据没有可比性，列入表中仅作为参考，因此也未对这些化合物进行OAV值的分析，但不排除其对清甜香特征有重大贡献。通过OAV值计算，可看出这些香气成分对清甜香香韵的贡献程度，从而筛查出三明尤溪烟叶中清甜香特征赋予组群，其中除了文献中常见的β-大马酮、β-紫罗兰酮、β-大马烯酮、香叶基丙酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮、壬醛、二氢猕猴桃内酯、巨豆三烯酮这些清香型代表化合物，还包括顺式-3-己烯醛、反式-2-顺式-6-壬二烯醛、反式-2,4-癸二烯醛、反式-2-壬烯醛、4-甲基苯乙酮、乙醛、正己醛、反式,反式-2,4-庚二烯醛等化合物。另外，常见的烟叶成分中橙花叔醇、苯甲醇等贡献程度不大，并非特征赋予组群。
实施例2
将实施例1组分1和2收集合并后减压浓缩的样品，利用气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)进行分析。
所述气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)色谱条件：美国Agilent公司7890-5975C气质联用仪，色谱柱：DB-17MS(60m×0.25mm×0.25μm)；柱温程序：60℃(2min)→2℃/min→240℃(2min)→10℃/min→300℃(50min)；载气：He；载气控制方式：恒流，1mL/min；进样口温度：250℃；进样量：1μL；分流模式：分流进样，分流比3:1。
所述质谱条件
离子化方式：EI；离子源温度：230℃；GC/MS传输线温度：280℃；EI电离能量：70eV。溶剂延迟时间：6.2min；采集方式：全扫描Scan；质量范围：35～650amu。
所述内标物：氘代萘、氘代蒽。
通过检索结果进行人工核对，挑选正向检索匹配度大于800，并结合对烟叶致香成分的认识，通过文献查阅致香成分的香韵表现，最后共定性出16种对三明尤溪烟叶清甜香特征产生直接贡献的成分，其名称和嗅觉特征如表4所示。
表4定性出的16种对清甜香有直接贡献的化学成分
Figure BDA0002416182710000131
Figure BDA0002416182710000141
OAV值分析
结合鉴定出的化学成分半定量数据及其觉察阈值(同实施例1)，再通过以下公式得到每种成分的香气活性值(OAV)
OAV＝C/T
其中C为香气成分在香气体系中的质量浓度(μg/mL)
T为香气阈值(μg/mL)。
表5清甜香特征赋予组群的OAV值
Figure BDA0002416182710000151
[a]未找到相关阈值数据；[b]在空气介质中的阈值数据，作为参考；[c]在水和丙二醇体积比1:1的混合溶剂体系中的阈值数据，作为参考。
如表5所示，通过OAV值计算，可看出这些香气成分对清甜香香韵的贡献程度，其中除了文献中常见的β-大马酮、β-紫罗兰酮、香叶基丙酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮、二氢猕猴桃内酯、巨豆三烯酮这些清香型代表化合物，还包括顺式-3-己烯醛、反式-2-,顺式-6-壬二烯醛、反式-2,4-癸二烯醛、反式-2-壬烯醛、4-甲基苯乙酮、乙醛、正己醛、反式,反式-2,4-庚二烯醛等化合物。对比实施例1的分析方法，这些清甜香成分与实施例1中分析结果相符，且特定检出成分对清甜香香韵贡献程度差别不大，但GC-MS所检出具有清甜香香韵的化学成分较少，对清甜香香韵贡献成分检测不够全面。
实施例3
取实施例1中制备得到的2g烟叶醇提物浸膏溶解于4mL无水乙醇中，充分震荡后过滤，过滤后的样品进行凝胶渗透色谱分离，填料为Sepharose 6B，以无水乙醇为流动相，流速为4mL/min。通过流分收集器每3min收集一个流分，共收集28个流分，分别标记为F1、F2、F3、F4、F5、F6……F28。按照香气评定法(GB/T 14454.2-2008)，由6位评香员对上述28个流分进行嗅觉特征评价，经评香人员讨论确认，把上述流分评价结果中嗅觉特征表现接近的进行合并，流分评价结果为：
表6流分分组情况
组分 流分 嗅觉特征评价
1 F1～F8 主要香韵为清甜香，焦甜香，花香
2 F9～F16 主要香韵为青滋香，焦甜香，酮甜，底带有干草香
将组分1和2收集合并后减压浓缩至1.5mL，整体嗅香评价结果为：清甜香，焦甜香，带有花香，干草香，但总体香气强度比实施例1分离后特征组分1和2要弱。
定性分析
将上述浓缩物制备成分析样，利用全二维气相色谱-飞行时间质谱联用仪(GC×GC–TOF MS)进行分析，具体仪器条件同实施例1。
通过检索结果进行人工核对，挑选正向检索匹配度大于800，并结合对烟叶致香成分的认识，通过文献查阅致香成分的香韵表现，最后共定性出12种对三明尤溪烟叶清甜香特征产生直接贡献的成分。
表7定性出的12种对清甜香香韵有直接贡献的化学成分
Figure BDA0002416182710000171
Figure BDA0002416182710000181
使用Sepharose 6B作为凝胶色谱柱填料分离存在以下问题：1、不同组分间的香气差异不明显，并且清甜香香势减弱，无法有效筛选出具有明显清甜香香韵的组分用于后续分析。2、所鉴定出的清甜香特征赋予成分个数远远少于使用Sephadex LH-20作为凝胶色谱柱填料分离所鉴定出的，这直接影响了清甜香成分的OAV值分析结果。综上，由于使用Sepharose 6B作为凝胶色谱柱填料分离富集效果差，未达到预期分离富集目标，因此未进行后续OAV值分析。
结论：
本发明将感官评价引入烟叶清甜香成分的分离研究中，指导烟叶提取物清甜香特征组分的凝胶色谱柱分级分离。随后，引入食品领域分子感官科学的香气活性值(OAV)概念，结合鉴定出的对清甜香特征有直接贡献的致香成分的定性和半定量数据及其觉察阈值计算得到每种致香成分OAV值，通过比较OAV值从而快速直观的筛查出三明尤溪烟叶中清甜香特征赋予成分。
[1]烟草香料技术原理与应用技术手册谢剑平主编；
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解，根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (10)

1.一种分析烟叶中清甜香成分的方法，其包括以下步骤：
(1)用水、有机溶剂或二者的混合溶剂对所述烟叶进行提取，得到烟叶提取液，浓缩所述烟叶提取液得到烟叶浸膏；
(2)用凝胶渗透色谱法对步骤(1)所述烟叶浸膏进行分离，得到多个流分；
(3)对步骤(2)中得到的流分进行香气评价，合并其中清甜香香韵特征突出的流分并浓缩，得清甜香浓缩物；
(4)以氘代萘和氘代蒽作为内标，采用GC×GC-TOF MS对步骤(3)所得清甜香浓缩物进行分析，得到所述清甜香浓缩物中的化学成分及浓度；
(5)以OAV(香气活性值)作为评价标准，从步骤(4)所分析得出的化学成分中选择得到所述清甜香成分；
优选地，所述烟叶为三明尤溪烟叶；优选为复烤三明尤溪烟叶。
2.权利要求1的方法，步骤(2)中所述凝胶渗透色谱法的填料选自Sephadex G-10、Sephadex G-15、Sepharose 6B、Sepharose ConA、Sephadex G-25和Sephadex LH-20，优选Sephadex G-10、Sephadex G-15或Sephadex LH-20，更优选Sephadex LH-20；
优选地，所述凝胶渗透色谱法采用玻璃层析柱(2.6cm×100cm)进行分离；
优选地，以下述溶剂作为流动相进行洗脱：乙醇、丙醇、异丙醇、丙二醇、水、或其混合体系，优选乙醇；
优选地，所述流动相的流速为1-8mL/min(例如1mL/min，2mL/min，3mL/min，4mL/min，5mL/min，6mL/min，7mL/min或8mL/min)。
3.权利要求1或2的方法，步骤(1)中所述提取操作如下所述：用50％-95％乙醇(例如50％乙醇、70％乙醇或95％乙醇)、二氯甲烷或水作为溶剂，在50℃-80℃或者回流条件下对所述烟叶提取10min-2h(例如10min、30min、1h或2h)；
优选地，步骤(1)中所述浓缩为减压浓缩；优选地，控制浓缩液密度为1.36-1.42g/cm3。
4.权利要求1-3任一项的方法，在步骤(4)中，所述GC×GC-TOF MS色谱分析条件选自下述的一项或多项：
(1)色谱柱一：HP-5MS(60m×0.25mm×0.25μm)；
(2)色谱柱二：DB-l7(2.3m×0.1mm×0.1μm)；
(3)柱温程序：50℃(1min)→3℃/min→220℃→2℃/min→260℃(10min)；
(4)载气：He；
(5)载气控制方式：恒流，1-1.5mL/min；
(6)进样口温度：250-300℃；
(7)调制周期：3-6秒；
(8)进样量：1μL；
(9)分流模式：分流进样，分流比10-30:1。
5.权利要求1-4任一项的方法，在步骤(4)中，所述GC×GC-TOF MS质谱分析条件选自下述的一项或多项：
(1)离子化方式：EI；
(2)离子源温度：220-280℃；
(3)GC/MS传输线温度：250-260℃；
(4)EI电离能量：70eV；
(5)溶剂延迟时间：7-16min；
(6)采集方式：全扫描Scan；
(7)质量范围：45～450amu。
6.权利要求1-5任一项的方法，所述步骤(4)具体包括以下步骤：
(4-1)以氘代萘和氘代蒽作为内标，采用GC×GC-TOF MS对步骤(3)所得清甜香浓缩物进行检测，得色谱和质谱；
(4-2)在NIST标准图谱库中对步骤(4-1)所得质谱与化合物标准质谱进行匹配，选择正向和反向匹配度均大于700(例如大于800，大于900或者大于999)的化合物，即确定相应色谱峰所对应的化学成分，并利用内标法计算该化学成分的浓度。
7.权利要求1-6任一项的方法，所述步骤(5)具体包括以下步骤：
(5-1)确定步骤(4)中所述各化学成分的香气阈值(单位：μg/mL)(例如通过查阅文献，或者按照GB/T 22366-2008中“最优估计阈值的估计”的方法确定所述阈值)，通过公式OAV＝C/T计算OAV，其中C为根据步骤(4)所测得的各化学成分的浓度(单位：μg/mL)；
(5-2)OAV越大，表示相应化学成分对清甜香韵的贡献越大，反之表示相应化学成分对清甜香韵的贡献越小。
8.一种组合物或者由权利要求1-7任一项的方法制备得到的组合物；
优选地，所述组合物中含有顺式-3-己烯醛、反式-2-顺式-6-壬二烯醛、β-大马烯酮、β-大马酮、β-紫罗兰酮、香叶基丙酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮、壬醛、二氢猕猴桃内酯、巨豆三烯酮A、巨豆三烯酮B、巨豆三烯酮D、反式-2,4-癸二烯醛、4-甲基苯乙酮、反式-2-壬烯醛、正己醛、乙醛和反式,反式-2,4-庚二烯醛中的任一种或多种；
优选地，所述组合物中含有顺式-3-己烯醛、反式-2-顺式-6-壬二烯醛、β-大马烯酮、β-大马酮、β-紫罗兰酮、香叶基丙酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮、壬醛、二氢猕猴桃内酯、巨豆三烯酮A、巨豆三烯酮B、巨豆三烯酮D、反式-2,4-癸二烯醛、4-甲基苯乙酮、反式-2-壬烯醛、正己醛、乙醛、反式,反式-2,4-庚二烯醛、正戊醛、山梨醛、2-甲基-2-丁烯醛、青叶醛、2-甲基-2-戊烯醛、6-甲基-2-庚酮、反式-2-庚烯醛、苯乙酮、6-甲基-5-辛烯-2-酮、茶香酮、苯丙酮、橙花醛和茄酮中的任一种或多种。
9.一种香精，其含有权利要求8所述的组合物；优选地，所述香精为烟用香精。
10.权利要求1-7任一项的方法、权利要求8的组合物或权利要求9的香精在制备卷烟中的用途。
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