CN111337713B - 一种生物传感器的制备方法及外泌体检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种生物传感器的制备方法及外泌体检测方法。该生物传感器的制备方法包括如下步骤：提供一硅基底，并所述硅基底上形成金膜；在所述金膜上构建三维DNA纳米结构层，所述金膜和所述三维DNA纳米结构层一起作为第一接触层；提供一氟化乙烯丙烯共聚物薄膜，并在所述氟化乙烯丙烯共聚物薄膜上形成导电膜，所述氟化乙烯丙烯共聚物薄膜作为第二接触层；其中，所述第一接触层和所述第二接触层能够周期性地接触和分离，且在周期性地接触和分离过程在所述第一接触层和所述第二接触层之间形成电势差。该生物传感器无需任何信号放大即可实现直接定量出外泌体的浓度，且具有超高灵敏度，实现最低检测限为3个外泌体/μL。
Description
技术领域
本发明涉及生物传感器领域，尤其涉及一种生物传感器的制备方法及外泌体检测方法。
背景技术
外泌体是直径为30到150nm的膜封闭的细胞外囊泡，是细胞间通讯的重要调控因子。在生理和病理条件下，几乎所有的细胞都分泌外泌体。核酸、蛋白质和脂质等丰富的内含物取决于亲代细胞。外泌体是亲代细胞与受体细胞之间交流的重要信息和物质载体。它们参与许多基本的生理过程，例如神经元通讯、免疫反应、器官发育、肿瘤发生和转移。此外，由于外泌体在指示疾病相关的生理状态方面的重要作用，具有高稳定性和代表亲代细胞能力的外泌体被认为是诊断癌症等疾病的有希望的侵袭性生物标志物。因此，对外泌体的敏感识别和定量识别是生物学研究和临床诊断的迫切需要。
然而，由于外泌体的尺寸很小，如何方便地定量外泌体仍是一个难题。在光学显微镜下难以计数外泌体，同样，由于弱光散射，流式细胞术的性能也不佳。外泌体的标准表征方法是阴性染色和电子显微镜可视化。然而，复杂的工艺和昂贵的仪器限制了这种方法的广泛应用。另一个常见的技术是纳米颗粒跟踪分析(NTA)，这需要复杂的分离/纯化过程。更糟糕的是，NTA技术仅报告颗粒大小，无法将外泌体与其他干扰颗粒如蛋白质聚集体区分开来。而且，疾病早期分泌的外泌体的浓度总是很低，这需要更敏感的方法。
发明内容
本发明的发明人认识到摩擦纳米发电机具有摩擦起电以及静电感应的耦合效应的特性，在此基础上，发明人进一步想到当有外泌体接触到摩擦纳米发电机之后可能会引起摩擦纳米发电机电量的变化，从而研发出一种前所未有的检测外泌体的新方法。基于此，发明人进行了一系列的尝试与试验，最终获得了本申请的技术方案。
本发明的一个目的是要克服利用现有技术对外泌体进行检测时工艺复杂、设备昂贵且无法精确检测出外泌体的缺陷，而提供一种检测工艺简单，且能够精确检测出外泌体的器件和方法。
本发明的一个进一步的目的是要能够检测出超低浓度的外泌体。
本发明的另一个进一步的目的是要提供一种检测范围大的外泌体检测器件。
特别地，本发明提供了一种生物传感器的制备方法，用于对外泌体进行检测，所述制备方法包括如下步骤：
提供一硅基底，并所述硅基底上形成金膜；
在所述金膜上构建三维DNA纳米结构层，所述金膜和所述三维DNA纳米结构层一起作为第一接触层；
提供一氟化乙烯丙烯共聚物薄膜，并在所述氟化乙烯丙烯共聚物薄膜上形成导电膜，所述氟化乙烯丙烯共聚物薄膜作为第二接触层；
其中，所述第一接触层和所述第二接触层能够周期性地接触和分离，且在周期性地接触和分离过程在所述第一接触层和所述第二接触层之间形成电势差。
可选地，所述在所述金膜上构建三维DNA纳米结构层，包括如下步骤：
提供多种单链DNA探针；
将所述多种单链DNA探针中的每条单链DNA分别溶解在含有氯化钠的磷酸盐缓冲液中，从而获得含单链DNA的混合液；
将多种所述含单链DNA的混合液混合在一起，并进行加热，从而获得三维DNA纳米结构层的前驱体溶液；
将所述前驱体溶液施加在所述金膜上，从而在所述金膜上构建形成三维DNA纳米结构层。
可选地，所述氯化钠的浓度为范围在0.1-0.3mol/l中任一值；
所述磷酸盐缓冲液的浓度为范围在5-15mmol/l中任一值。
可选地，所述将多种所述含单链DNA的混合液混合在一起，并进行加热的步骤中，加热温度为范围在80-110℃中任一值，加热时间为范围在1-10min中任一值。
可选地，所述制备方法还包括如下步骤：在所述金膜和所述导电膜上分别引出导线以与外电路电连接，从而实现向所述外电路上的灯源进行供电。
特别地，本发明还提供了一种外泌体检测方法，所述外泌体检测方法利用如前述的制备方法获得的生物传感器进行检测，所述外泌体检测方法包括如下步骤：
在所述生物传感器上滴入第一待测溶液，并孵育第一预设时间后将其作为第一待测样品；
对所述第一待测样品的电输出进行测试，若所述第一待测样品的电输出大于预设值，则确定所述待测溶液中含有外泌体。
可选地，所述电输出包括开路电压Voc、短路电流Isc和传输电荷Qsc；
可选地，所述若所述第一待测样品的电输出大于预设值，则确定所述待测溶液中含有外泌体的步骤中，若开路电压Voc、短路电流Isc和传输电荷Qsc中任一个或多个大于对应的预设值，则确定所述待测溶液中含有外泌体，其中，所述对应的预设值包括开路电压预设值Vy、短路电流预设值Iy和传输电荷预设值Qy。
特别地，本发明还提供了一种外泌体检测方法，所述外泌体检测方法利用如前述的制备方法获得的生物传感器进行检测，所述外泌体检测方法包括如下步骤：
在所述生物传感器上滴入含外泌体的第二待测溶液，并孵育第二预设时间后将其作为第二待测样品；
利用探针显微镜检测所述第二待测样品和所述探针显微镜的探针之间的接触电势差VCPD；
按照以下线性方程获得所述外泌体的浓度Cex，Cex＝(VCPD-326.974)/0.101，其中，Cex为范围在20-1000/μL中任一值。
可选地，所述探针显微镜选择为扫描开尔文探针显微；
扫描开尔文探针显微使用带有Ti/Pt涂层硅尖端的Cypher S原子力显微镜；
在测量所述第二待测样品和所述探针之间的接触电势差VCPD时，是在室温和大气压下，在距所述第二待测样品50nm处，以0.3Hz的速度进行扫描的。
可选地，所述外泌体的最低检测限为3/μL。
根据本发明实施例的方案，该生物传感器创造性地引入了三维DNA纳米结构，该结构在生物传感器的顶部和底部之间充当稳定的间隙，在目标外泌体结合到三维DNA纳米结构上之后，第一接触层和第二接触层的接触面积极大增加，这有利于生物传感器性能的提高。该生物传感器无需任何信号放大即可实现直接定量出外泌体的浓度，并且具有超高灵敏度，实现最低检测限为3个外泌体/μL。
此外，通过将适体序列整合到DNA纳米结构中，由于外泌体与DNA序列具有很强的结合亲和力，因此具有很高的选择性。并且，可以通过改变DNA序列使得该生物传感器可以分析大多数类型的靶标。
并且，生物传感器的外接电路上设置有LED灯，当有外泌体存在时可以产生较大的电量，从而电量LED灯，因此，也可以将LED灯作为指示灯，以指示存在外泌体。
根据下文结合附图对本发明具体实施例的详细描述，本领域技术人员将会更加明了本发明的上述以及其他目的、优点和特征。
附图说明
后文将参照附图以示例性而非限制性的方式详细描述本发明的一些具体实施例。附图中相同的附图标记标示了相同或类似的部件或部分。本领域技术人员应该理解，这些附图未必是按比例绘制的。附图中：
图1示出了根据本发明一个实施例的生物传感器的制备方法的示意性流程图；
图2示出了根据本发明一个实施例的构建三维DNA纳米结构层的示意性流程图；
图3示出了根据本发明一个实施例的生物传感器在第一接触层和第二接触层接触和分离的过程中电荷转移的模型图；
图4示出了根据本发明一个实施例的外泌体检测方法的示意性流程图；
图5示出了根据本发明一个实施例的样品1、样品2和样品3的开路电压对比曲线；
图6示出了根据本发明一个实施例的样品1、样品2和样品3的短路电荷转移的对比曲线；
图7示出了根据本发明另一个实施例的外泌体检测方法示意性流程图；
图8示出了根据本发明另一个实施例的外泌体被TDNA层捕获的示意性模型图；
图9示出了根据本发明另一个实施例的引入了不同浓度的外泌体时短路转移电荷量的曲线图；
图10示出了根据本发明一个实施例的不同浓度外泌体存在时生物传感器的表面电势图；
图11示出了根据本发明一个实施例的生物传感器的校正曲线，表示表面电势的平均值与外泌体浓度之间的关系，插图显示线性范围；
图12示出了生物传感器的表面状态模型，用于解释第一接触层和第二接触层在接触前、接触中和接触后接触带电过程中的电荷转移；
图13示出了根据本发明一个实施例的样品1、样品2和样品3的表面电势图像对比图(比例尺:500nm)，其中示出了样品1的表面电势差为-175mV，样品2的表面电势差为75mV，样品3的表面电势差为436.3mV。
具体实施方式
图1示出了根据本发明一个实施例的生物传感器的制备方法的示意性流程图。如图1所示，该生物传感器的制备方法包括：
步骤S100，提供一硅基底，并硅基底上形成金膜；
步骤S200，在金膜上构建三维DNA纳米结构层，金膜和三维DNA纳米结构层一起作为第一接触层；
步骤S300，提供一氟化乙烯丙烯共聚物薄膜，并在氟化乙烯丙烯共聚物薄膜上形成导电膜，氟化乙烯丙烯共聚物薄膜作为第二接触层；
其中，第一接触层和第二接触层能够周期性地接触和分离，且在周期性地接触和分离过程在第一接触层和第二接触层之间形成电势差。
在步骤S100中，该硅基底例如可以为1×1cm2的(100)硅晶片，该硅晶片为高导硅，以作为第一电极层。在硅晶片上形成金膜的方式，可以为利用物理沉积的方式在硅晶片上沉积金膜，金膜的厚度例如可以为50nm、100nm或150nm，也可以为50-150nm中任一其他值。
图2示出了根据本发明一个实施例的构建三维DNA纳米结构层的示意性流程图。如图2所示，在步骤S200中，在金膜上构建三维DNA纳米结构层包括：
步骤S210，提供多种单链DNA探针；
步骤S220，将多种单链DNA探针中的每条单链DNA分别溶解在含有氯化钠的磷酸盐缓冲液中，从而获得含单链DNA的混合液；
步骤S230，将多种含单链DNA的混合液混合在一起，并进行加热，从而获得三维DNA纳米结构层的前驱体溶液；
步骤S240，将前驱体溶液施加在金膜上，从而在金膜上构建形成三维DNA纳米结构层。
在步骤S220中，氯化钠的浓度为0.1mol/l、0.2mol/l或0.3mol/l，也可以为范围在0.1-0.3mol/l中任一其他值。其中，氯化钠的pH值为7.4。磷酸盐缓冲液的浓度为5mmol/l、10mmol/l或15mmol/l，也可以为范围在5-15mmol/l中任一其他值。
在步骤S230中，是将多种含单链DNA的混合液等浓度混合在一起，加热的温度例如可以为80℃、90℃、95℃、100℃、105℃或110℃，也可以为80-110℃中任一其他值。加热时间例如可以为1min、5min或10min，也可以为范围在1-10min中任一其他值。
在步骤S240中，在前驱体溶液冷却至室温后，将前驱体溶液滴加到金膜上，在室温下干燥一段时间，例如可以为12h、18h或24h，只要能使前驱体溶液完全干燥即可。其中，前驱体溶液的浓度例如可以为2μmol/l、5μmol/l、8μmol/l、10μmol/l或15μmol/l，也可以为2-15μmol/l中任一其他值。
在金膜表面上构建了一组三维DNA纳米结构层(TDNA),该TDNA的一个单链序列位于其顶部，TDNA被设计为捕获目标外泌体的适配体。所构建的TDNA层可以提高捕获靶标的特异性和效率。通过将适体序列整合到DNA纳米结构中，由于外泌体与DNA序列具有很强的结合亲和力，因此具有很高的选择性。并且，可以通过改变DNA序列使得该生物传感器可以分析大多数类型的靶标。
在步骤S300中，该氟化乙烯丙烯共聚物(FEP)薄膜具有较高的电子亲和能，容易得到电子。该导电膜例如可以为铜膜或金膜，但并不限于此，只要可以导电即可，该导电膜作为第二电极层。
其中，可以在金膜和导电膜上分别引出导线以与外电路电连接，从而实现向外电路上的灯源进行供电。该外电路上的灯源例如可以为LED，该生物传感器输出的电量可以为LED供电，从而在对外泌体进行检测时点亮LED灯，以方便直观地监测外泌体。
图3示出了根据本发明一个实施例的生物传感器在第一接触层和第二接触层接触和分离的过程中电荷转移的模型图。如图3所示，该生物传感器输出电量以及检测外泌体的原理为：第一接触层中的TDNA层和第二接触层中的FEP薄膜可以接触且可以分离，可以通过两者周期性接触和分离的过程产生电荷的移动。第一接触层中的TDNA层具有捕获外泌体的功能。众所周知，DNA是由含有磷酸、核糖和碱基的核苷酸组成，同时，由不同氨基酸组成的各种蛋白质分布在外泌体表面。碱基和氨基酸中的氨基往往会失去电子。相反，第二接触层中的FEP薄膜具有最高的电子亲和能，这是生物传感器最合适的负接触层。当第一接触层和第二接触层接触时，电子转移到FEP薄膜上，并且在其导电膜上产生正电荷，利用电势差，可以通过第一接触层和第二接触层周期性地接触-分离过程在外部电路中产生交流信号。
根据本发明实施例的方案，该生物传感器创造性地引入了三维DNA纳米结构，该结构在生物传感器的顶部和底部之间充当稳定的间隙，在目标外泌体结合到三维DNA纳米结构上之后，第一接触层和第二接触层的接触面积极大增加，这有利于生物传感器性能的提高。该生物传感器无需任何信号放大即可实现直接定量出外泌体的浓度，并且具有超高灵敏度，实现最低检测限为3个外泌体/μL。
此外，通过将适体序列整合到DNA纳米结构中，由于外泌体与DNA序列具有很强的结合亲和力，因此具有很高的选择性。并且，可以通过改变DNA序列使得该生物传感器可以分析大多数类型的靶标。
图4示出了根据本发明一个实施例的外泌体检测方法的示意性流程图。如图4所示，该外泌体检测方法包括：
步骤S110，在生物传感器上滴入第一待测溶液，并孵育第一预设时间后将其作为第一待测样品；
步骤S120，对第一待测样品的电输出进行测试，若第一待测样品的电输出大于预设值，则确定待测溶液中含有外泌体。
在步骤S110中，第一预设时间例如可以为2h、2.5h、3h、3.5h或4h。第一待测样品为孵育有第一待测溶液的生物传感器。
在步骤S120中，电输出可以包括开路电压Voc、短路电流Isc和传输电荷Qsc。若开路电压Voc、短路电流Isc和传输电荷Qsc中任一个或多个大于对应的预设值，则确定待测溶液中含有外泌体，其中，对应的预设值包括开路电压预设值Vy、短路电流预设值Iy和传输电荷预设值Qy。其中，预设值为没有外泌体存在时测试的电输出值。
由于电荷转移与失去电子的氨基数量密切相关，因此可以估算初始外泌体的浓度。与具有丰富蛋白质的外泌体相比，TDNA只能导致有限数量的电子转移。因此，在没有外泌体的情况下，生物传感器的输出信号被认为可以忽略不计。
为了说明该生物传感器构建TDNA层之后的效果，以及可以定性分析出是否存在外泌体，做了如下对比实验，将没有构建TDNA层的传感器作为样品1，已经构建了TDNA层的生物传感器作为样品2，捕获有外泌体的生物传感器作为样品3。可以理解的是，样品1的制备方法与样品2的制备方法的唯一区别在于，样品1在金膜上没有构建TDNA层，样品2则是利用前述方法制备获得的生物传感器，样品3与样品2的唯一区别在于，样品2的TDNA层没有捕获外泌体，而样品3的TDNA层则捕获有外泌体。
图5示出了根据本发明一个实施例的样品1、样品2和样品3的开路电压对比曲线。图6示出了根据本发明一个实施例的样品1、样品2和样品3的短路电荷转移的对比曲线。在图5和图6所示的实验中，生物传感器是由线性电机在1.5Hz下机械触发下实现第一接触层和第二接触层周期性地接触和分离。其中，第一接触层和第二接触层的接触面积为1cm2。在线性电机的仿真过程中，第一接触层和第二接触层之间的最大距离为5cm，仿真频率保持在1.5Hz。
如图5所示，该样品1和样品2的开路电压Voc基本相同。但是，捕获有外泌体的样品3的开路电压Voc明显增加。如图6所示，该样品1和样品2的短路电荷转移Qtr基本相同，但是，捕获有外泌体的样品3的短路电荷转移Qtr明显增加。这均可以说明在没有外泌体的情况下，生物传感器的输出信号可以忽略不计，外泌体的存在可以极大增加生物传感器的电势差，从而使得生物传感器可以检测出外泌体的存在。
在该实施例中，生物传感器的外接电路上设置有LED灯，当有外泌体存在时可以产生较大的电量，从而电量LED灯，因此，也可以将LED灯作为指示灯，以指示存在外泌体。
其中，通过以下方式提取外泌体：将HeLa细胞在补充有10％胎牛血清(FBS)的DMEM(dulbecco's modified eagle medium)中于37℃在5％CO2气氛中培养。达到80％融合后，将细胞用磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS缓冲液)洗涤三次，然后在无FBS的DMEM细胞培养基中再孵育48小时。然后，收集上清液以提取外来体。通常，将其以2000g离心20min，然后以10000g离心30min以分别去除死细胞和细胞碎片。随后，将上清液进一步以110000g离心2h，以获得沉淀的外泌体，将其重悬于1mL PBS缓冲液中，并在-80℃下保存直至使用。捕获有外泌体的样品3的制备过程中，可以将上述提取的外泌体滴加在生物传感器中，以获得样品3。
根据本发明实施例，通过对待测样品的电输出进行测试，从而可以定性分析出待测溶液中是否含有外泌体。
图7示出了根据本发明另一个实施例的外泌体检测方法示意性流程图。图8示出了根据本发明另一个实施例的外泌体被TDNA层捕获的示意性模型图。该外泌体检测方法利用前述的生物传感器进行检测，其包括：
步骤S101，在生物传感器上滴入含外泌体的第二待测溶液，并孵育第二预设时间后将其作为第二待测样品；
步骤S102，利用探针显微镜检测第二待测样品和探针显微镜的探针之间的接触电势差VCPD；
步骤S103，按照以下线性方程获得外泌体的浓度Cex，Cex＝(VCPD-326.974)/0.101，其中，Cex为范围在20-1000/μL中任一值。
在步骤S101中，该第二待测溶液为前述的提取的一定浓度的外泌体溶液，第二预设时间例如可以为2h、2.5h、3h、3.5h或4h。第二待测样品为孵育有第二待测溶液的生物传感器。
在步骤S102中，通过扫描开尔文探针显微(SKPM)测试表面电势，定量检测外泌体数量。SKPM使用带有Ti/Pt涂层硅尖端的Cypher S原子力显微镜。其中，尖端半径为28±10nm，力常数为2N·m-1，共振频率为70kHz。在室温和大气压下，在距样品50纳米处的以0.3Hz速度扫描2×2μm2尺寸的表面电势图像。
在实验中，研究了Qtr在引入不同浓度外泌体时的变化。如图9所示，在外泌体的浓度从0增加到2000/μL时，Qtr相应增长。接触电位差有明显的变化趋势，表面电位差较大的两个接触层导致产生更多电荷。为了研究TDNA修饰和目标外泌体的定向存在对金膜表面的潜在影响，使用了扫描开尔文探针显微镜，它可以提供金膜表面局部结构的电子状态信息。将针尖与样品之间的接触电势差(VCPD)定义为：
其中，
和
为样品与针尖的功函数，e为电荷(1.60×10-19C)。由于探头的功函数为常数，通过测量表面电位差可以比较功函数的高低。VCPD值越大，样品的功函数越小，即在接触起电过程中越容易带正电。
图10示出了根据本发明一个实施例的不同浓度外泌体存在时生物传感器的表面电势图。通过实验建立了VCPD与外泌体浓度的关系，如图11所示。从20-1000/μL，可得到一个线性方程如下:
y＝326.974+0.101 x(n＝3,R2＝0.994) (2)
其中y是VCPD(mV)，x是目标外泌体的浓度(/μL)。计算出的最低检测限(LOD)为3/μL。这明显优于已开发的电化学生物传感器的LOD，证明了摩擦起电方式作为监视目标的出色分析工具的优势。通过与一些有代表性的外泌体检测方法的比较，该生物传感器具有较好的LOD和较宽的线性范围，且没有任何信号放大元件。外泌体含有大量的氨基基团，即使在极低的浓度下也能产生显著的摩擦电信号响应，从而提高了敏感性。
其中，最低检测限LOD是按照如下方式计算获得：在x为最小值时，计算获得电势差误差值Verr，按照Verr*3/b的公式计算获得LOD值。其中，b为图11所示的斜率。其中，电势差误差值Verr的计算方法为：多次测量在x＝20时的接触电势差值，获得多组接触电势差值，并进行比较，从而获得平均误差值，该平均误差值则为电势差误差值Verr。
为了进一步阐述该生物传感器的接触起电机理，研究了两种不同接触层表面之间的电荷转移行为及其相应的能带变化。设计了接触起电表面状态模型图，如图12所示，为接触和分离过程中的表面状态变化模型示意图。
在该接触起电表面状态模型中，金属中的电子符合费米-狄拉克分布函数。在理想条件下，电子将填充费米能级(Ef)以下的所有可用能态，而电介质的最高填充表面能态通常比金属的Ef低。用TDNA修饰后，如图13所示，VCPD从-175mV增加到75mV。与外泌体进一步相互作用后，达到了惊人的增加至436.3mV，这证明SKPM是一种出色技术，可以监视逐步的修饰并指示目标外泌体的存在。根据这些结果和公式(1)，可以估算出在有外泌体和没有外泌体的TDNA中，功函数分别约为4.85eV和4.49eV。
如图12中的A-C所示，金的费米能级似乎非常接近FEP，从而导致少量电子从金和FEP转移，导致形成弱的表面电荷电位。在金表面上修饰TDNA之后，金/TDNA的Ef略有上升，导致更多的电荷从金/TDNA表面转移到FEP表面，如图12中D-F所示。通过TDNA顶部的适体序列捕获外泌体后，更多的电子倾向于在FEP表面状态上，这使得表面通过接触带电产生正的摩擦电荷的倾向更高，如图12中G-I所示)。因此，与裸露的TDNA相比，在碱基和氨基酸中具有大量氨基的外泌体极大提高了接触起电产生的摩擦电荷密度。输出的变化可以相互证实这一点。
至此，本领域技术人员应认识到，虽然本文已详尽示出和描述了本发明的多个示例性实施例，但是，在不脱离本发明精神和范围的情况下，仍可根据本发明公开的内容直接确定或推导出符合本发明原理的许多其他变型或修改。因此，本发明的范围应被理解和认定为覆盖了所有这些其他变型或修改。
Claims (7)
1.一种外泌体检测方法，其特征在于，所述外泌体检测方法利用生物传感器进行检测，所述外泌体检测方法包括如下步骤：
在所述生物传感器上滴入含外泌体的第二待测溶液，并孵育第二预设时间后将其作为第二待测样品；
利用探针显微镜检测所述第二待测样品和所述探针显微镜的探针之间的接触电势差VCPD；
按照以下线性方程获得所述外泌体的浓度Cex，Cex＝(VCPD-326.974)/0.101，其中，Cex为范围在20-1000/μL中任一值；
所述生物传感器的制备方法包括如下步骤：
提供一硅基底，并所述硅基底上形成金膜；
在所述金膜上构建三维DNA纳米结构层，所述金膜和所述三维DNA纳米结构层一起作为第一接触层；
提供一氟化乙烯丙烯共聚物薄膜，并在所述氟化乙烯丙烯共聚物薄膜上形成导电膜，所述氟化乙烯丙烯共聚物薄膜作为第二接触层；
其中，所述第一接触层和所述第二接触层能够周期性地接触和分离，且在周期性地接触和分离过程在所述第一接触层和所述第二接触层之间形成电势差。
2.根据权利要求1所述的外泌体检测方法，其特征在于，所述在所述金膜上构建三维DNA纳米结构层，包括如下步骤：
提供多种单链DNA探针；
将所述多种单链DNA探针中的每条单链DNA分别溶解在含有氯化钠的磷酸盐缓冲液中，从而获得含单链DNA的混合液；
将多种所述含单链DNA的混合液混合在一起，并进行加热，从而获得三维DNA纳米结构层的前驱体溶液；
将所述前驱体溶液施加在所述金膜上，从而在所述金膜上构建形成三维DNA纳米结构层。
3.根据权利要求2所述的外泌体检测方法，其特征在于，所述氯化钠的浓度为范围在0.1-0.3mol/l中任一值；
所述磷酸盐缓冲液的浓度为范围在5-15mmol/l中任一值。
4.根据权利要求3所述的外泌体检测方法，其特征在于，所述将多种所述含单链DNA的混合液混合在一起，并进行加热的步骤中，加热温度为范围在80-110℃中任一值，加热时间为范围在1-10min中任一值。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的外泌体检测方法，其特征在于，所述制备方法还包括如下步骤：在所述金膜和所述导电膜上分别引出导线以与外电路电连接，从而实现向所述外电路上的灯源进行供电。
6.根据权利要求1-4中任一项所述的外泌体检测方法，其特征在于，所述探针显微镜选择为扫描开尔文探针显微；
扫描开尔文探针显微使用带有Ti/Pt涂层硅尖端的Cypher S原子力显微镜；
在测量所述第二待测样品和所述探针之间的接触电势差VCPD时，是在室温和大气压下，在距所述第二待测样品50nm处，以0.3Hz的速度进行扫描的。
7.根据权利要求6所述的外泌体检测方法，其特征在于，所述外泌体的最低检测限为3/μL。
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