CN111334574A - 预测神经外科手术中硝普钠不良反应的多态性位点 - Google Patents

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Abstract

预测神经外科手术中硝普钠不良反应的多态性位点。本发明提供了检测MPO基因463 G>A和638 C>A多态性的试剂在制备预测硝普钠麻醉时反跳高压和心动过速的试剂盒中的应用，其中检测463 G>A位点基因型为GA和AA，或者638 C>A位点基因型为CA和AA的受试者为硝普钠不良反应高风险受试者。

Description

预测神经外科手术中硝普钠不良反应的多态性位点
发明领域
本发明属于麻醉领域和神经外科领域，具体地，本发明提供了检测MPO基因-463G>A和-638C>A多态性的试剂在制备预测硝普钠麻醉时反跳高压和心动过速的试剂盒中的应用。
背景技术
神经外科手术，如开颅手术中一般需要控制性降血压，目前临床上最常用的降压药物之一为硝普钠。硝普钠为短效血管舒张药，同时舒张小动脉和小静脉，降低外周血管阻力及回心血量，降压作用迅速且效果显著。但其存在反射性心动过速、停药后反跳性高压、长时间使用效果不佳以及氰化物中毒等不良反应，严重影响其安全性和手术效果。
髓过氧化物酶(MPO)为一种含铁蛋白，广泛分布于髓样组织的中性粒细胞和单核细胞中，在细胞增殖、机体免疫反应、脂质沉积等方面都有作用。MPO基因大小约11kb，位于17q23-q24，包含12个外显子和11个内含子，其上已经发现了二十余个多态性位点，如-463G>A、1940A>G、-638C>A、129G>A、V53F、M251T、A332V、I642L等。目前的研究表明MPO基因的多态性与多种心脑血管疾病如冠心病、脑卒中、动脉粥样硬化相关。
目前尚无硝普钠不良反应与MPO多态性关联的报道。
发明内容
发明人在阅读MPO基因突变与心脑血管疾病相关性的文献和作者提供的手术统计报告时，根据记载发现MPO基因-463G>A和-638C>A位点与硝普钠麻醉中出现的不良反应有关的迹象。发明人基于此收集了大量病例资料，最终证实了-463G>A和-638C>A位点和硝普钠麻醉中的反跳高压和心动过速不良反应显著相关。
一方面，本发明提供了一种预测硝普钠不良反应的试剂盒，其特征在于包括检测MPO基因-463G>A和-638C>A多态性的试剂。
进一步地，所述试剂为PCR检测试剂。
进一步地，所述试剂包括SEQ ID NO.1-6的引物。
进一步地，所述硝普钠不良反应为反跳高压和心动过速。
另一方面，本发明提供了预测受试者中硝普钠不良反应的方法，包括检测MPO基因-463G>A和-638C>A多态性。
进一步地，将-463G>A位点基因型为GA和AA，或者-638C>A位点基因型为CA和AA的受试者确定为硝普钠不良反应高风险受试者。
进一步地，所述硝普钠不良反应为反跳高压和心动过速。
另一方面，本发明提供了检测MPO基因-463G>A和-638C>A多态性的试剂在制备预测硝普钠不良反应的试剂盒中的应用。
进一步地，所述硝普钠不良反应为反跳高压和心动过速。
进一步地，所述试剂包括SEQ ID NO.1-6的引物。
检测MPO基因-463G>A和-638C>A多态性的试剂不限于实施例中的ASP-PCR试剂，其他可用于多态性位点基因型检测的试剂也均可使用，包括但不限于扩增后直接测序用试剂，RFLP、SSCP等。
硝普钠不良反应是指使用硝普钠麻醉时的不良反应，不局限于实施例中的开颅手术。
反跳高压和心动过速的诊断标准可以随手术和患者需求、身体情况而变化，不局限于具体的值。
基于本发明，在开颅手术等神经外科手术前常规检查中既可以以较低的费用快速判断硝普钠麻醉中可能出现的不良反应，对于不良反应可能性较高的患者可以选用其他麻醉方案如右美托咪定加硝普钠或瑞芬太尼。可以明显降低手术风险，并避免反跳高压引起视野不清带来的手术困难。
具体实施方式
主要试剂和仪器引物和合成由南京金斯特公司完成硝普钠(干粉)，双鹤药业股份有限公司；
微量泵(KL605T)：北京科力建元；
多功能监护仪(MP40)：飞利浦；
其他试剂和仪器均为常规型号和种类。
实施例1引物设计和ASP--PCR检测方法
根据Genbank中的人MPO基因序列X153377以及现有技术文献设计/选择ASP-PCR引物和扩增和检测方法：
-463G>A的上游引物：TCCCTTTCATCCTCCTATCT(SEQ ID NO.1)；下游引物-1：CTGACCTCAAGTAATCCACC(SEQ ID NO.2)；下游引物-2：CTGACCTCAACTAATCCACT(SEQ IDNO.3)；
扩增检测过程为：94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，35个循环后72℃延伸5分钟，随后进行琼脂糖凝胶电泳；
-463G>A检测中只有上游引物和下游引物1扩增出296bp片段为GG型、只有上游引物和下游引物2扩增出296bp片段为AA型、上游引物与下游引物1和2均扩增出296bp片段为GA型。
-638C>A的上游引物：TGAGGAGGGATAGAGGAGGT(SEQ ID NO.4)；下游引物-1：TGAATGTCTGGTTACACTGG(SEQ ID NO.5)；下游引物-2：TGAGATTCTGGTTACACGGT(SEQ IDNO.6)；
扩增检测过程为：94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，35个循环后72℃延伸5分钟，随后进行琼脂糖凝胶电泳；
-638C>A检测中只有上游引物和下游引物1扩增出332bp片段为CC型、只有上游引物和下游引物2扩增出332bp片段为AA型、上游引物与下游引物1和2均扩增出332bp片段为CA型。
PCR反应体系均为25微升体系，其中Taq PCR Master Mix 12.5微升、10pmol/L引物各1微升、100ng/微升gDNA 1微升、余量为双蒸水。
经过10余例多种基因型的实际测序验证，上述方法准确率为100％。
实施例2病例选择和基因型测定
在4个月时间跨度内从本院及合作医院选取开颅手术病人共65例(胶质瘤、垂体瘤、脑血管畸形，无高血压病史和相关禁忌症)，使用实施例1的ASP-PCR检测方法测定其MPO基因463和638位点的基因型，结果如表1所示：
表1 65例病人基因型分布
Figure BDA0002476873200000031
检测的结果中各基因型占比与现有研究中中国人各基因型占比基本一致。
实施例3麻醉和检测方案
麻醉方案
快速输注0.5g/kg的20％甘露醇后，按照2.0微克/kg/min的速度以微量泵泵入硝普钠，降压40分钟后停止泵入硝普钠，吸入异氟醚维持麻醉进行手术。
检测指标
开放静脉，常规检测病人的SBP(收缩压)、HR(心率)。记录开始降压(即泵入硝普钠)0分钟(T1)、10分钟(T2)、20分钟(T3)、40分钟(T4)、停止降压后5分钟(T5)、10分钟(T6)的数值。将心率超过100的情况记录为心动过速。
实施例4检测结果汇总
表2：-463G>A各基因型病人SBP(mmHg)检测结果
Figure BDA0002476873200000041
表3：-638C>A各基因型病人SBP(mmHg)检测结果
Figure BDA0002476873200000042
从表2和表3的结果可见，在降压期间各基因型的SBP水平基本一致，均在69mmHg上下。但停用硝普钠后：-463位点GA、AA型，特别是AA型的血压反跳幅度明显大于GG型(记录到的两例SBP高于100的明显反跳高压也均为AA型)，均达到了统计学显著水平；-638位点CA和AA型的血压反跳幅度也明显大于CC型(记录到的两例SBP高于100的明显反跳高压分别为CA和AA型)，显著性略低于-463位点。可见-463G>A和-638C>A与硝普钠导致的反跳性高压显著相关。
心率上-463位点和-638位点各基因型的病人在整个麻醉期间基本保持一致状态，即降压开始后从65左右的平均基础水平很快增加到90左右的水平，各组之间无明显差异。共出现9例心动过速情况，其-463位点基因型分布未GG 2例、GA 3例、AA 4例，-638位点基因型分布为CC 2例、CA 1例、AA 6例。初步可见-463G>A和-638C>A，特别是-638C>A突变与硝普钠导致的心动过速相关，由于心动过速病例尚有不足，此结论有待进一步确定。
序列表
<110> 苏春海
李慧
<120> 预测神经外科手术中硝普钠不良反应的多态性位点
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
tccctttcat cctcctatct 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
ctgacctcaa gtaatccacc 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
ctgacctcaa ctaatccact 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
tgaggaggga tagaggaggt 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 5
tgaatgtctg gttacactgg 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 6
tgagattctg gttacacggt 20

Claims (10)

1.预测硝普钠不良反应的试剂盒，其特征在于包括检测MPO基因-463G>A和-638C>A多态性的试剂。
2.根据权利要求1的试剂盒，其中所述试剂为PCR检测试剂。
3.根据权利要求2的试剂盒，其中所述试剂包括SEQ ID NO.1-6的引物。
4.根据权利要求1-3任一项的试剂盒，其中所述硝普钠不良反应为反跳高压和心动过速。
5.预测受试者中硝普钠不良反应的方法，包括检测MPO基因-463G>A和-638C>A多态性。
6.根据权利要求5的方法，其中将-463G>A位点基因型为GA和AA，-638C>A位点基因型为CA和AA的受试者确定为硝普钠不良反应高风险受试者。
7.根据权利要求5或6的方法，其中所述硝普钠不良反应为反跳高压和心动过速。
8.检测MPO基因-463G>A和-638C>A多态性的试剂在制备预测硝普钠不良反应的试剂盒中的应用。
9.根据权利要求8的应用，其中所述硝普钠不良反应为反跳高压和心动过速。
10.根据权利要求8或9的应用，其中所述试剂包括SEQ ID NO.1-6的引物。
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