CN111334504B

CN111334504B - 一种核内病毒模拟物的递送系统、制备方法及应用

Info

Publication number: CN111334504B
Application number: CN202010142917.0A
Authority: CN
Inventors: 马烽; 李大培; 谢李芬
Original assignee: Suzhou Institute Of Systems Medicine
Current assignee: Suzhou Institute Of Systems Medicine
Priority date: 2020-03-04
Filing date: 2020-03-04
Publication date: 2022-03-25
Anticipated expiration: 2040-03-04
Also published as: CN111334504A

Abstract

本公开涉及一种核内病毒模拟物的递送系统、制备方法及应用。具体来说，本公开涉及一种分离的寡核苷酸以及含有前述寡核苷酸的病毒模拟物递送系统、前述病毒模拟物递送系统的制备方法及应用。本公开的技术方案表明6个寡核苷酸RNLS或DNLS在不影响原有DNA病毒模拟物或RNA病毒模拟物的功能的前提下，将这些模拟物从胞浆带入细胞核，并应用于核内DNA受体或RNA受体的功能研究。

Description

一种核内病毒模拟物的递送系统、制备方法及应用

技术领域

本公开属于生物技术领域，涉及一种核内病毒模拟物的递送系统、制备方法及应用。具体来说，本公开涉及一段6个寡聚核糖核苷酸或6个寡聚脱氧核糖核苷酸融合病毒模拟物的核内递送系统及应用。

背景技术

感染性疾病一直严重危胁着人类的健康与生命安全。近年来全球范围内频繁爆发大规模的病毒、细菌感染，比如人们所熟知的流感、埃博拉、寨卡病毒、2019新型冠状病毒以及多重耐药性超级细菌等。DNA病毒是引起机体感染性疾病的一大类病原体，广泛存在于人类和其它脊椎动物体内。轻微DNA病毒感染表现为发热、头痛、组织炎症或全身不适等，严重者可以诱发肿瘤。有多种DNA病毒易诱发肿瘤，如EBV感染能够导致人类的Burkitt淋巴瘤和鼻咽癌；长期持续感染HBV，会引起人的原发性肝癌(PHC)；而HPV16和18亚型，已证实与宫颈癌高度相关。因此，DNA病毒性感染疾病迫切需要更加高效、安全的预防与诊治方法。深入探讨宿主抗感染免疫的分子调控机制，可以为DNA病毒性感染疾病的防治提供理论依据，也一直是该领域的研究热点，具有十分重要的临床意义。

宿主细胞拥有复杂的先天性免疫机制来识别和对抗病毒，病毒入侵机体释放出来的核酸物质，即病原相关分子模式(pathogen-associated molecule pattern,PAMP)被宿主细胞受体识别，一系列的信号分子被逐步传递、激活和放大，最终产生I型干扰素(type Iinterferon,IFN)和促炎细胞因子，并激活下游抗病毒基因，从而限制病毒复制并最终将其清除。

机体免疫系统对病毒的识别是抗感染性免疫反应最为关键的步骤之一。目前已有多种DNA病毒识别受体(DNA sensor)被逐渐发现，其中又分为细胞质内识别受体和细胞核内识别受体。目前发现的能够识别病毒DNA的天然免疫受体大都存在于细胞质中如DDX41(Zhang et.al.,2011)，cGAS(Sun et.al.,2013)，其中以2013年华人科学家陈志坚团队发现的cGAS蛋白为代表。cGAS能够有效识别细胞质里的病毒DNA，启动宿主的抗病毒免疫反应，已广泛为人们所接受(Sun et.al.,2013)。

不过，多数DNA病毒感染宿主细胞后会进入细胞核内释放病毒基因组DNA并在核内进行复制。IFN-γ诱导蛋白IFI16是一种重要的DNA识别受体，可识别核内病毒如HSV-1(herpes simplex virus1)，对于胞浆病毒如VACV(vaccinia virus)，IFI16亦可转运至细胞浆进行有效识别(Li et al.,2012；Unterholzner et.al.,2010)。2019年7月曹雪涛课题组发现了一种新型核内天然免疫识别受体hnRNP-A2B1，能够在细胞核内特异性地识别病毒DNA，随后启动天然免疫应答反应以清除DNA病毒的威胁(Wang et.al.,2019)。

在探讨宿主细胞抗病毒免疫反应调节机制，尤其是一些病毒识别受体的抗病毒免疫反应调节机制过程中，常常需要借助一些病毒模拟物来模拟病毒诱发的免疫反应，如干扰素信号的活化。双链DNA(dsDNA)是I型干扰素(IFN)的有效诱导物，可作为DNA病毒(PAMP)的模拟物，用于激活抗感染免疫信号和信号转导分子，在DNA受体的抗病毒免疫调节的研究中具有广泛应用。G3-YSD是一段来源于HIV-1基因组的26bp DNA。这种短DNA由其不成对的鸟苷三聚体(G3)侧翼的回文序列产生Y形结构，这种Y型DNA中的鸟苷结构被鉴定为细胞质DNA受体如cGAS(环状GMP-AMP合酶，cGAMP合成酶)的一种最小识别基序，有效诱发干扰素信号反应(Herzner et.al.,2015)。HSV60 mer是含有病毒DNA基序的60bp寡核苷酸(Unterholzner et.al.,2010)。HSV60 mer来源于单纯疱疹病毒(HSV-1)基因组，转染的HSV60mer可被DNA受体IFI16识别，有效诱导STING-TBK-IRF3依赖的IFN-β信号。VACV70 mer是含有病毒DNA基序的70bp寡核苷酸(Unterholzner et.al.,2010)。VACV70 mer来自痘苗病毒DNA。转染的VACV70 mer亦可被IFI16 DNA受体识别，有效诱导STING-TBK1-IRF3依赖的IFN-β信号。另外还有ISD45 mer、GHV50 mer(Ni et.al.,2016)等DNA病毒模拟物也用于抗病毒免疫信号的刺激中。这些DNA病毒模拟物可以采用常规化学合成方法合成，再退火成双链DNA寡核苷酸；也可以购自商业公司，如InvivoGen公司，已有商品化的G3-YSD、HSV60 mer以及VACV70 mer在售。

目前将DNA病毒模拟物导入细胞的主要手段为脂质体转染。转染后的模拟物寡聚核苷酸大多定位于细胞质，能有效模拟细胞质内的病毒感染模式，在研究胞浆DNA识别受体的功能机制方面具有十分重要的作用。然而，多数DNA病毒感染宿主细胞后会进入细胞核并在核内进行复制，如疱疹病毒HSV-1。目前市场上尚未有商品化的核内DNA病毒模拟物，对于宿主细胞核内DNA病毒的免疫调节研究非常不利。随着越来越多核内DNA病毒识别受体的发现，我们迫切需要研制出有效的核内DNA病毒模拟物，为核内DNA病毒识别受体的生物学功能研究提供新的必要技术手段，进一步为机体抗核内DNA病毒免疫调节研究和DNA病毒性感染疾病的预防、诊断以及治疗提供理论基础。

现有技术文献

Herzner,A.M.,Hagmann,C.A.,Goldeck,M.,Wolter,S.,Kubler,K.,Wittmann,S.,Gramberg,T.,Andreeva,L.,Hopfner,K.P.,Mertens,C.,et al.(2015).Sequence-specific activation of the DNA sensor cGAS by Y-form DNA structures as foundin primary HIV-1cDNA.Nature immunology 16,1025-1033.

Li,T.,Diner,B.A.,Chen,J.,and Cristea,I.M.(2012).Acetylation modulatescellular distribution and DNA sensing ability of interferon-inducible proteinIFI16.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica 109,10558-10563.

Ni,X.,Ru,H.,Ma,F.,Zhao,L.,Shaw,N.,Feng,Y.,Ding,W.,Gong,W.,Wang,Q.,Ouyang,S.,et al.(2016).New insights into the structural basis ofDNArecognition by HINa and HINb domains of IFI16.Journal of molecular cellbiology 8,51-61.

Sun,L.,Wu,J.,Du,F.,Chen,X.,and Chen,Z.J.(2013).Cyclic GMP-AMPsynthaseis a cytosolic DNAsensor that activates the type I interferon pathway.Science339,786-791.

Unterholzner,L.,Keating,S.E.,Baran,M.,Horan,K.A.,Jensen,S.B.,Sharma,S.,Sirois,C.M.,Jin,T.,Latz,E.,Xiao,T.S.,et al.(2010).IFI16 is an innateimmune sensor for intracellular DNA.Nature immunology 11,997-1004.

Wang,L.,Wen,M.,and Cao,X.(2019).Nuclear hnRNPA2B1 initiates andamplifies the innate immune response to DNAviruses.Science 365.

Zhang,Z.,Yuan,B.,Bao,M.,Lu,N.,Kim,T.,and Liu,Y.J.(2011).The helicaseDDX41 senses intracellular DNAmediated by the adaptor STING in dendriticcells.Nature immunology 12,959-965.

发明内容

发明要解决的问题

为了克服技术的缺点与不足，本公开的首要目的在于提供一种DNA病毒模拟物或RNA病毒模拟物的核内递送系统。该系统以6个核糖核苷酸序列组成，该6个寡核苷酸融合在不同长度DNA病毒模拟物或RNA病毒模拟物末端，将DNA病毒模拟物或RNA病毒模拟物递送进入细胞核中，来模拟核内DNA病毒或RNA病毒的感染，或作为病毒识别分子的激动剂，用于研究核内DNA病毒识别受体或RNA识别受体的作用机制，是一套全新、高效的核内递送方式。

本公开的另一目的在于提供上述DNA病毒模拟物或RNA病毒模拟物的应用。示例性的，本公开所涉及的DNA病毒模拟物或RNA病毒模拟物递送可以通过在细胞学水平上的应用，提供入核效果和诱导干扰素信号方面的一些数据。

用于解决问题的方案

本公开提供了如下技术方案。

(1)一种分离的寡核苷酸，所述分离的寡核苷酸的序列如(i)-(ii)中任一项所示：

(i)如SEQ ID NO：1-2任一项所示的序列；

(ii)如(i)所示的序列的反向互补序列。

(2)一种病毒模拟物递送系统，其中，所述病毒模拟物递送系统含有根据(1)所述的寡核苷酸。

(3)根据(2)所述的病毒模拟物递送系统，其中，所述病毒模拟物递送系统还含有病毒模拟物，所述病毒模拟物和所述寡核苷酸融合。

(4)根据(2)-(3)任一项所述的病毒模拟物递送系统，其中，所述病毒模拟物的长度为20-80bp；可选的，所述病毒模拟物的长度为25-70bp。

(5)根据(2)-(4)任一项所述的病毒模拟物递送系统，其中，所述病毒模拟物选自双链DNA或双链RNA；可选的，所述病毒为DNA病毒。

(6)根据(2)-(5)任一项所述的病毒模拟物递送系统，其中，所述病毒模拟物递送系统的序列为SEQ ID NO：5-8，11-14任一项所示的序列或其组合。

(7)根据(2)-(6)任一项所述的病毒模拟物递送系统，所述病毒模拟物递送系统还含有标记，所述标记和所述寡核苷酸融合；可选的，所述标记为荧光标记。

(8)一种病毒模拟物递送系统的制备方法，其中，所述方法包括将(1)所述的寡核苷酸和病毒模拟物融合。

(9)根据(8)所述的病毒模拟物递送系统的制备方法，其中，所述病毒模拟物的长度为20-80bp；优选的，所述病毒模拟物的长度为25-70bp。

(10)根据(8)-(9)任一项所述的病毒模拟物递送系统的制备方法，其中，所述病毒为DNA病毒。

(11)根据(2)-(7)任一项所述的病毒模拟物递送系统或根据(8)-(10)任一项所述的方法制备得到的病毒模拟物递送系统在宿主细胞抗病毒免疫反应调节机制的研究中的应用。

发明的效果

本公开相对于现有的商品化的DNA病毒模拟物或RNA病毒模拟物，具有以下应用优势：

在一个技术方案中，本公开中所应用的RNLS或DNLS可将DNA病毒模拟物或RNA病毒模拟物携带进入细胞核，本公开提供了双链DNA结构或双链DNA-RNA杂链结构的DNA病毒模拟物的入核效果数据，结果表明不带有这种RNLS或DNLS结构的DNA病毒模拟物或RNA病毒模拟物，经常规的转染之后，主要分布于细胞质中；而融合有RNLS或DNLS结构的DNA病毒模拟物经同样的转染后，有约50％的比例进入细胞核内，表明这种RNLS或DNLS结构可有效将DNA病毒模拟物或RNA病毒模拟物携带进入细胞核内。

在另一个技术方案中，本公开还提供了融合有RNLS或DNLS结构的DNA病毒模拟物的干扰素信号刺激结果。结果显示融合有这种6个寡核苷酸的DNA病毒模拟物，其干扰素信号刺激能力并未发生显著改变。

本公开的技术方案表明6个寡核苷酸RNLS或DNLS不会影响原有DNA病毒模拟物或RNA病毒模拟物的功能，可用于核内DNA病毒识别受体或RNA病毒识别受体的功能研究。

附图说明

图1示出了携带有RNLS或DNLS的DNA病毒模拟物序列。

图2示出了改造后的DNA病毒模拟物YG3-RNLS或YG3-DNLS入核效果检测结果。其中，Cy5为模拟物的荧光标记，DAPI染料可以标记细胞核。

图3示出了改造后的DNA病毒模拟物YG3-RNLS或YG3-DNLS入核效果统计结果。

图4示出了改造后的DNA病毒模拟物HSV60 mer-RNLS或HSV60mer-DNLS入核效果检测结果。其中Cy5为模拟物的荧光标记，DAPI染料可以标记细胞核。

图5示出了改造后的DNA病毒模拟物HSV60 mer-RNLS或HSV60mer-DNLS入核效果统计结果。

图6示出了改造后的DNA病毒模拟物YG3-RNLS干扰素信号刺激效果验证结果。

图7示出了改造后的DNA病毒模拟物HSV60 mer-RNLS干扰素信号刺激效果验证结果。

具体实施方式

定义

在本公开的权利要求和/或说明书中，词语“一(a)”或“一(an)”或“一(the)”可以指“一个”，但也可以指“一个或多个”、“至少一个”以及“一个或多于一个”。

如在权利要求和说明书中所使用的，词语“包含”、“具有”、“包括”或“含有”是指包括在内的或开放式的，并不排除额外的、未引述的元件或方法步骤。与此同时，“包含”、“具有”、“包括”或“含有”也可以表示封闭式的，排除额外的、未引述的元件或方法步骤。

在本公开中，术语“约”表示：一个值包括测定该值所使用的装置或方法的误差的标准偏差。

虽然所公开的内容支持术语“或”的定义仅为替代物以及“和/或”，但除非明确表示仅为替代物或替代物之间相互排斥外，权利要求中的术语“或”是指“和/或”。

在本公开中，术语“反向互补序列”是指，呈反向次序的参考序列的互补序列。示例性的，对于5’-ATCG-3’，其互补序列是3’-TAGC-5’，而其反向互补序列是5’-CGAT-3’。

在本公开中，术语“5’端”指的是DNA或RNA单链带有游离5’-羟基或其磷酸酯的一个末端。

在本公开中，术语“3’端”指的是DNA或RNA单链带有游离3’-羟基或其磷酸酯的一个末端。

在本公开中，术语“标记”指的是能够被仪器识别的基团。示例性的，所述标记可以为荧光标记。

在本公开中，术语“荧光标记”也可以被称为“荧光染料”，是指吸收某一波长的光波后能发射出另一波长大于吸收光的光波的物质。在本公开的一些具体实施方式中，所述荧光标记可以选自荧光素、俄勒冈绿、氟硼荧染料、罗丹明或花菁标记。甚至更具体而言，所述荧光标记可以是花菁标记，例如Cy5。在本公开的另一些具体实施方案中，所述荧光标记可以是诸如苯并吡喃或花菁标记之类的近红外荧光标记，例如DyLight标记。

在本公开中，“病毒模拟物”和“病毒核酸模拟物”可以替换使用。

本公开的目的通过下述技术方案实现：

一种DNA病毒模拟物递送系统，由6个核糖核苷酸序列组成。

作为本公开中运送DNA病毒模拟物的6个核糖核苷酸，是融合在DNA病毒模拟物核苷酸序列3’-末端的6个寡核糖核苷酸。

在一个实施方式中，由于DNA病毒模拟物多为双链DNA片段，故本公开中的6个寡核糖核苷酸为双链寡核苷酸，是双链RNA(RNLS)，也可以为双链DNA(DNLS)序列。

本公开所提供的6个核糖核苷酸序列可以是基因合成技术合成的寡核苷酸序列，通过退火形成双链DNA-RNA杂链结构、双链DNA或双链RNA结构。

本公开所应用的双链DNA-RNA杂链序列或双链DNA序列，由于需利用激光共聚焦成像技术显示其入核情况，故其3’-末端携带有cy5荧光标记。干扰素信号诱导的功能部分所用的双链DNA-RNA杂链序列未带有cy5荧光标记。实际应用时，可不必作荧光标记。

本公开所涉及的DNA病毒模拟物YG3，其序列来源于商品化的模拟物G3-YSD(Invitrogen)。原片段设计为两个末端带有三个非互补的G，即为Y型。本研究为排除末端6个寡核苷酸序列对Y型结构的影响，全部采用完全互补的结构，即互补链的三个G，替换为三个C。

本公开所涉及的6个寡核苷酸的RNLS或DNLS序列，其所携带的DNA病毒核酸模拟物为YG3(序列同G3-YSD)，HSV60 mer或者其它已知的DNA病毒基因组DNA模拟物或来源于RNA病毒的cDNA模拟物。

示例性的，在本公开的一个具体的实施方式中，其携带DNA病毒核酸模拟物。所述DNA病毒核酸模拟物包括但不限于ISD45 mer，GHV50 mer和VACV70 mer等已知的DNA病毒核酸模拟物。

在公开的另一个具体的实施方式中，其携带RNA病毒核酸模拟物。所述RNA病毒核酸模拟物包括但不限于，如5’ppp-dsrna，3p-hpRNA等已知的RNA病毒核酸模拟物。

本公开所涉及的6个寡核苷酸的RNLS或DNLS序列，其所携带的DNA病毒核酸模拟物或RNA病毒核酸模拟物的序列长度没有特别的限定。在一个实施方式中，所携带的DNA病毒核酸模拟物或RNA病毒核酸模拟物的序列长度为20-80bp。在一个实施方式中，所携带的DNA病毒核酸模拟物或RNA病毒核酸模拟物的序列长度为25-70bp。在一个具体的实施方式中，所携带的DNA病毒核酸模拟物序列长度为70bp。在一个具体的实施方式中，所携带的DNA病毒核酸模拟物序列长度为60bp。在一个具体的实施方式中，所携带的DNA病毒核酸模拟物序列长度为50bp。在一个具体的实施方式中，所携带的DNA病毒核酸模拟物序列长度为45bp。在另一个具体的实施方式中，所携带的DNA病毒核酸模拟物序列长度为26bp。

本公开所涉及的DNA病毒核酸模拟物序列为双链DNA结构或双链DNA-RNA杂链结构，不排除单链RNLS或单链DNLS也可将双链DNA模拟物序列携带进入细胞核内。

所述的DNA病毒模拟物核内递送技术，在研究核内DNA病毒受体的功能机制和宿主抗感染免疫研究方面具有广泛应用前景。

在本公开中，所示的核苷酸序列的含义如下。

SEQ ID NO：1所示的序列为DNA病毒或RNA病毒模拟物递送系统的DNA序列(AGUGUU)。

SEQ ID NO：2所示的序列为DNA病毒或RNA病毒模拟物递送系统的RNA序列(AGTGTT)。

SEQ ID NO：3-4，9-10示出了仅含有DNA模拟物(YG3，HSV60)的序列。

SEQ ID NO：5-8，11-14示出了如SEQ ID NO：1-2任一项所示的序列和DNA模拟物(YG3，HSV60)融合后的序列。

实施例

本公开的其他目的、特征和优点将从以下详细描述中变得明显。但是，应当理解的是，详细描述和具体实施例(虽然表示本公开的具体实施方式)仅为解释性目的而给出，因为在阅读该详细说明后，在本公开的精神和范围内所作出的各种改变和修饰，对于本领域技术人员来说将变得显而易见。

实施例中采用的所有试剂，除非另有强调，否则均可以通过商业途径购买获得。

实施例1：模拟物的获取

将图1中序列发送至核酸合成公司，采用常规化学合成技术合成杂链双链DNA-RNA或双链DNA产物。本实施例合成的序列最短为26bp+6bp(YG3-RNLS(如SEQ ID NO：5-6所示的序列)/YG3-DNLS(如SEQ ID NO：7-8所示的序列)，改造前YG3序列同G3-YSD(如SEQ ID NO：3-4所示的序列)，来源于HIV基因组逆转录中间产物)，最长为60bp+6bp(HSV60mer-RNLS(如SEQ ID NO：11-12所示的序列)/DNLS(如SEQ ID NO：13-14所示的序列)，HSV60 mer来源于疱疹病毒HSV-1基因组序列(如SEQ ID NO：9-10所示的序列))。整个过程应注意避免核酸酶和内毒素污染以及严格注意避光。

实施例2：较短的模拟物入核效果验证

目前已有多种商品化的DNA病毒模拟物，如G3-YSD，HSV60 mer，VACV70 mer，ISD45mer，GHV50 mer等，这些DNA病毒模拟物多用于模拟DNA病毒基因组DNA，以研究细胞内识别病毒DNA的DNA sensor在抗病毒免疫调节中的功能。

现阶段将DNA病毒模拟物导入细胞内的常用方法是转染，然而常规转染方法只能将DNA病毒模拟物大多导入到细胞质中，对于研究细胞核内DNA病毒的病毒识别与抗病病毒免疫调节非常不利。因此本实施例将改造后的DNA病毒模拟物转染进细胞，并验证其入核效果。

将HaCaT细胞铺于底部带有盖玻片小室的confocal小皿(直径29mm，小室直径10mm)中，24h后利用lipofectamine 2000将实施例1中获取的DNA病毒模拟物(YG3及YG3-RNLS/YG3-DNLS，改造前序列同G3-YSD，来源于HIV基因组逆转录中间产物)(1μg/mL)转染进入细胞中。转染后6h换新鲜培养基，18h后将细胞取出，4％多聚甲醛室温固定20min，PBS洗三遍，每遍5min。0.2％TritonX-100透膜15min，PBS洗三遍，每遍5min。DAPI(1μg/mL)染核10min，PBS洗三遍，每遍10min。用含50％甘油的PBS封片，激光共聚焦显微镜(LEICA TCASP8 confocal microscope)下观察荧光分布并拍摄图片。整个过程应严格注意避光操作。荧光信号采用LCS software package软件和Image J软件分析。

结果如图2所示，相对于改造前YG3片段，带有入核序列的YG3-RNLS和YG3-DNLS有较多一部分能够进入到细胞核内(Cy5信号，图中红色荧光，蓝色为细胞核)，说明这6个核苷酸碱基对，无论是RNA形式，还是DNA形式，均能有效将YG3携带进入到细胞核内。

以上结果表明末端6个核苷酸碱基能有效将较短片段(26bp)的DNA病毒模拟物携带进入到细胞核内。

实施例3：较短的模拟物入核效果统计

对改造后的DNA病毒模拟物YG3-RNLS或YG3-DNLS入核效果进行统计，采用Image J软件统计分析进入到核内的平均荧光强度(mean fluorescence intensity,MFI)和细胞内整体平均荧光强度，计算核内的平均荧光强度占细胞内整体平均荧光强度的比例。

结果如图3显示，末端6个核苷酸碱基对可将细胞内50％左右的YG3携带进入细胞核内,YG3-RNLS与YG3-DNLS入核效果相差不大(**P<0.01，n.s.＝no significance)。

以上结果表明，末端6个核苷酸碱基可以将约50％的较短片段(26bp)DNA病毒模拟物携带进入到细胞核内，入核效率较高。

实施例4：较长的模拟物入核效果验证

将HaCaT细胞铺于底部带有盖玻片小室的confocal小皿(直径29mm，小室直径10mm)中，24h后利用lipofectamine 2000将实施例1中获取的DNA病毒模拟物(1μg/mL)转染进入细胞中。转染后6h换新鲜培养基，18h后将细胞取出，4％多聚甲醛室温固定20min，PBS洗三遍，每遍5min。0.2％TritonX-100透膜15min，PBS洗三遍，每遍5min。DAPI(1μg/mL)染核10min，PBS洗三遍，每遍10min。用含50％甘油的PBS封片，激光共聚焦显微镜(LEICA TCASP8 confocal microscope)下观察荧光分布并拍摄图片。整个过程应严格注意避光操作。荧光信号采用LCS software package软件和Image J软件分析。

结果如图4所示，相对于改造前HSV60 mer片段，带有入核序列的HSV60 mer-RNLS和HSV60 mer-DNLS有较多一部分能够进入到细胞核内(Cy5信号，图中红色荧光，蓝色为细胞核)，说明这6个核苷酸碱基对，无论是RNA形式，还是DNA形式，均能有效将HSV60 mer携带进入细胞核内。

以上结果表明末端6个核苷酸碱基可以有效将较长片段(60bp)的DNA病毒模拟物携带进入细胞核内。

实施例5：较长的模拟物入核效果统计

对改造后的DNA病毒模拟物HSV60 mer-RNLS或HSV60 mer-DNLS入核效果进行统计，采用Image J软件统计分析进入到核内的平均荧光强度(mean fluorescenceintensity，MFI)和细胞内整体平均荧光强度，计算核内的平均荧光强度占细胞内整体平均荧光强度的比例。

结果如图5显示，RNLS形式的末端6个核苷酸碱基对可将细胞内70％左右的HSV60mer携带进入细胞核内，而DNLS形式的末端6个核苷酸碱基对可将细胞内50％左右的HSV60mer携带进入细胞核内(**P<0.01，***P<0.001)。

以上结果表明，末端6个核苷酸碱基可以有效将较长片段(60bp)DNA病毒模拟物携带进入到细胞核内。

实施例6：较短的模拟物干扰素信号刺激能力验证

改造后的DNA病毒模拟物相较于初始商品化的模拟物，其末端额外带上6bp的核苷酸序列。为验证这额外的6bp核苷酸是否会影响模拟物的刺激效果，我们检测了在HaCaT细胞中改造前后模拟物对干扰素信号的刺激能力。

将HaCaT细胞铺于12孔板，24h后利用lipofectamine 2000将实施例1中获取的DNA病毒模拟物(1μg/mL)转染进入细胞中。转染后6h更换新鲜培养基，18h后收集细胞，提取RNA，采用RT-qPCR技术分析在HaCaT细胞中YG3-RNLS诱导IFN-β的能力，并且采用RT-qPCR技术分析在HaCaT细胞中YG3-RNLS诱导IFN-β的能力是否会因为携带尾端6个碱基而减弱，YG3为改造前DNA病毒模拟物。

结果如图6所示，YG3可以有效刺激起干扰素信号，而YG3-RNLS的干扰素诱导能力并未比YG3降低(*P<0.05，***P<0.001)，反而有所升高。

以上结果表明较短片段尾端携带的6个碱基不会干扰其作为DNA病毒模拟物的功能，仍可有效刺激宿主细胞内干扰素信号。

实施例7：较长的模拟物干扰素信号刺激效果验证。

将HaCaT细胞铺于12孔板，24h后利用lipofectamine 2000将实施例1中获取的DNA病毒模拟物(1μg/mL)转染进入细胞中。转染后6h更换新鲜培养基，18h后收集细胞，提取RNA，采用RT-qPCR技术分析在HaCaT细胞中HSV60 mer-RNLS诱导IFN-β的能力，并且采用RT-qPCR技术分析在HaCaT细胞中HSV60 mer-RNLS诱导IFN-β的能力是否会因为携带尾端6个碱基而减弱，HSV60 mer为改造前DNA病毒模拟物。

结果如图7所示，HSV60 mer可以有效刺激起干扰素信号，而HSV60mer-RNLS的干扰素刺激能力并未比HSV60 mer降低(*P<0.05，n.s.＝no significance)。

以上结果表明，说明较长片段的HSV60 mer尾端携带的6个碱基不会干扰其原有作为DNA病毒模拟物的功能，仍可有效诱导宿主细胞内干扰素的信号。

上述实施例为本公开较佳的实施方式，但本公开的实施方式并不受上述实施例的限制，其他任何未背离本公开的实质和原理下所作的技术改动、修饰、替代、组合以及简化等，均应为等效的置换方式，都包含在本公开的保护范围之内。

序列表

<110> 苏州系统医学研究所

<120> 一种核内病毒模拟物的递送系统、制备方法及应用

<130> 6514-2013378I

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 6

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aguguu 6

<210> 2

<211> 6

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agtgtt 6

<210> 3

<211> 26

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggggaactcc agcaggacca ttgggg 26

<210> 4

<211> 26

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccccaatggt cctgctggag ttcccc 26

<210> 5

<211> 32

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggggaactcc agcaggacca ttggggagug uu 32

<210> 6

<211> 32

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aacacucccc aatggtcctg ctggagttcc cc 32

<210> 7

<211> 32

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ggggaactcc agcaggacca ttggggagtg tt 32

<210> 8

<211> 32

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

aacactcccc aatggtcctg ctggagttcc cc 32

<210> 9

<211> 60

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ccatcagaaa gaggtttaat atttttgtga gaccatcgaa gagagaaaga gataaaactt 60

<210> 10

<211> 60

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

aagttttatc tctttctctc ttcgatggtc tcacaaaaat attaaacctc tttctgatgg 60

<210> 11

<211> 66

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ccatcagaaa gaggtttaat atttttgtga gaccatcgaa gagagaaaga gataaaactt 60

aguguu 66

<210> 12

<211> 66

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

aacacuaagt tttatctctt tctctcttcg atggtctcac aaaaatatta aacctctttc 60

tgatgg 66

<210> 13

<211> 66

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ccatcagaaa gaggtttaat atttttgtga gaccatcgaa gagagaaaga gataaaactt 60

agtgtt 66

<210> 14

<211> 66

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

aacactaagt tttatctctt tctctcttcg atggtctcac aaaaatatta aacctctttc 60

tgatgg 66

Claims

1.一种病毒模拟物递送系统，其中，所述病毒模拟物递送系统含有双链寡核苷酸和病毒模拟物，所述病毒模拟物和所述双链寡核苷酸融合；所述病毒模拟物为双链DNA，所述双链寡核苷酸如(i)-(ii)中任一项所示：

(i)由如SEQ ID NO：1所示的序列，与SEQ ID NO：1所示的序列的反向互补序列形成的双链寡核苷酸；

(ii)由如SEQ ID NO：2所示的序列，与SEQ ID NO：2所示的序列的反向互补序列形成的双链寡核苷酸。

2.根据权利要求1所述的病毒模拟物递送系统，其中，所述病毒模拟物的长度为20-80bp。

3.根据权利要求2所述的病毒模拟物递送系统，其中，所述病毒模拟物的长度为25-70bp。

4.根据权利要求1所述的病毒模拟物递送系统，其中，所述病毒为DNA病毒。

5.根据权利要求1-4任一项所述的病毒模拟物递送系统，其中，所述病毒模拟物递送系统的序列为SEQ ID NO：5-8，11-14任一项所示的序列或其组合。

6.根据权利要求1-4任一项所述的病毒模拟物递送系统，其中，所述病毒模拟物递送系统还含有标记，所述标记和所述双链寡核苷酸融合。

7.根据权利要求6所述的病毒模拟物递送系统，其中，所述标记为荧光标记。

8.一种病毒模拟物递送系统的制备方法，其中，所述方法包括将双链寡核苷酸和病毒模拟物融合，所述病毒模拟物为双链DNA，所述双链寡核苷酸如(i)-(ii)中任一项所示：

9.根据权利要求8所述的病毒模拟物递送系统的制备方法，其中，所述病毒模拟物的长度为20-80bp。

10.根据权利要求8所述的病毒模拟物递送系统的制备方法，其中，所述病毒模拟物的长度为25-70bp。

11.根据权利要求8所述的病毒模拟物递送系统的制备方法，其中，所述病毒为DNA病毒。

12.根据权利要求1-4任一项所述的病毒模拟物递送系统或根据权利要求8-11任一项所述的方法制备得到的病毒模拟物递送系统在宿主细胞抗病毒免疫反应调节机制研究的非疾病诊断或治疗中的应用。