CN111317813A

CN111317813A - Cck类似物在制备防治pd药物中的应用及防治pd的药物

Info

Publication number: CN111317813A
Application number: CN202010100218.XA
Authority: CN
Inventors: 张紫娟; 苏运芳; 郝莉; 马金莲; 孙丽敏; 张振强; 克里斯汀·霍尔舍; 曾华辉; 宋军营; 谢治深
Original assignee: Henan University of Traditional Chinese Medicine HUTCM
Current assignee: Henan University of Traditional Chinese Medicine HUTCM
Priority date: 2020-02-18
Filing date: 2020-02-18
Publication date: 2020-06-23

Abstract

本发明实施例公开了CCK类似物在制备防治PD药物中的应用及防治PD的药物，CCK类似物能够保护由MPTP引起PD动物模型的运动平衡及多巴胺神经元损伤的作用机制，来制备防治PD的药物。涉及PD防治药物技术领域，其有益效果为：CCK类似物能够保护由MPTP引起PD动物模型的运动平衡及多巴胺神经元损伤，因而具有开发成抗PD药物的潜力。

Description

CCK类似物在制备防治PD药物中的应用及防治PD的药物

技术领域

本发明实施例涉及PD防治药物技术领域，尤其涉及一种CCK类似物在制备防治PD药物中的应用及防治PD的药物。

背景技术

PD又称震颤麻痹，是一种多发于中老年人的中枢神经系统变性疾病，65岁以上人群患病率为1.7％，85岁以上人群患病率高达4-5％，严重危害人类健康。 PD的典型病理表现有中脑黑质致密部多巴胺能神经元变性死亡、纹状体多巴胺(dopamine,DA)含量显著性减少和α-突触核蛋白(α-synuclein)异常沉积形成路易小体。临床主要表现有运动迟缓，肌强直和静止性震颤等三个主要运动异常特征。PD的病因与遗传、环境及老化等因素有关。其机制涉及到线粒体氧化应激、免疫反应、兴奋性氨基酸毒性、内质网应激、细胞凋亡与自噬等多方面。

目前，治疗PD的策略有立体定向手术和药物治疗两种方法，手术主要阻断丘脑底核苍白球通路或纹状体苍白球通路，药物主要集中在抗胆碱能药物和影响多巴胺能神经元活性的药物，但均不能阻止或逆转PD病理进展，且其疗效有限，副作用较大。因此，围绕PD发病的分子机制，开发新一代治疗PD的药物一直是业界研究和关注的热点。

因此，需要一种CCK类似物在制备防治PD药物中的应用及防治PD的药物，以解决上述问题。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，即为了克服不能阻止或逆转PD 病理进展，且其疗效有限，副作用较大的问题，本发明实施例公开了一种CCK 类似物在制备防治PD药物中的应用及防治PD的药物。

本发明实施例第一方面公开了CCK类似物在制备防治PD药物中的应用。

进一步的，所述CCK类似物的氨基酸序列为(GIp)-QDYTGWMDF-NH2。

进一步的，所述CCK类似物的浓度为50nM。

进一步的，所述CCK类似物为CCK类似物药学上可以接受的衍生物。

本发明实施例第二方面公开了一种防治PD的药物，其为以CCK类似物为活性物质制成的制剂。

进一步的，所述CCK类似物的氨基酸序列为(GIp)-QDYTGWMDF-NH2。

进一步的，所述CCK类似物的浓度为50nM。

进一步的，所述制剂的剂型为片剂、胶囊、注射剂或口服液。

本发明实施例的有益效果在于：

PD是一种中老年人常见的神经系统变性疾病，临床上主要表现为静止性震颤、运动迟缓、肌强直和姿势步态障碍，同时可伴有抑郁、便秘和睡眠障碍等非运动症状，其主要病理特征为黑质纹状体系统多巴胺能神经元进行性死亡、缺失。本发明发现，CCK类似物能够保护由MPTP引起PD动物模型的运动平衡及多巴胺能神经元损伤，因而具有开发成抗PD药物的潜力。

附图说明

图1A为在旷场实验中，小鼠5分钟内在中心区域停留的时间百分比[Time in Zone(％)]；

图1B为在旷场实验中，小鼠5分钟内的运动总距离(Total Distance)；

图1C为在旷场实验中，小鼠5分钟内后脚站立的次数(Rearing Number Total)；

图2A为在爬杆实验中，小鼠爬到杆底的时间(T-LA)；

图2B为在爬杆实验中，小鼠头朝上转为头向下的时间(T-turn)；

图2C为在转棒实验中，小鼠在滚轴上停留的时间(Run Time)；

图3A为利用多巴胺能神经元特异性标志物TH免疫组织荧光化学方法检测正常对照组小鼠黑质区TH表达；

图3B为利用多巴胺能神经元特异性标志物TH免疫组织荧光化学方法检测模型组小鼠黑质区TH表达

图3C为利用多巴胺能神经元特异性标志物TH免疫组织荧光化学方法检测 CCK组小鼠黑质区TH表达；

图3D为利用多巴胺能神经元特异性标志物TH免疫组织荧光化学方法检测利拉鲁肽组小鼠黑质区TH表达；

图4为各组小鼠黑质区TH阳性表达统计结果。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

随着分子生物学、免疫学与现代生化技术和生物工程学的迅猛发展，生物药物已成为我国新药研究开发中最有前景的一个重要领域。此类药物具有疾病治疗的针对性强、药理活性高、毒副作用小和营养价值高等优点。其中围绕神经退行性疾病开发出的具有神经保护作用的脑肠肽类生物药物(如胰高血糖素样多肽-1类似物利拉鲁肽，肠抑胃肽等)成为近年来研究的热点。因此本专利选取利拉鲁肽作为对照药物。

胆囊收缩素(cholecystokinin，CCK)是一种可以引起胆囊收缩的脑肠肽，广泛分布于神经系统和消化系统。CCK主要通过胆囊收缩素受体 (cholecystokinin receptor，CCKR)发挥作用，CCK受体存在多种结构类型，并介导不同的生物学效应。CCKR基于对多种CCK片段相对亲和力不同分为两种亚型：胆囊收缩素一型受体(也称为CCKAR)和胆囊收缩素二型受体(也称为 CCKBR)。CCKAR主要分布在外周组织，如胃肠、胰腺、胆囊、幽门括约肌，亦存在于中枢神经系统的某些部位；CCKBR主要存在于中枢神经系统，特别是在皮层和边缘结构，如:海马、嗅结节、杏仁核、伏隔核和黑质纹状体等，但特定的胃肠系统中也含有这种受体。

本发明首先合成九肽CCK类似物(-QDYTGWMDF-)，该药物包含CCK全部生物活性的最小单位，分子量较小，能够特异性的与CCKBR相结合，之后本发明在多肽的N端加入GIp及C端加入NH2【(GIp)-QDYTGWMDF-NH2】，进一步增加了肽段的稳定性，而且既保留了原来的生物学活性，又能够较快的透过血脑屏障，并且生物半衰期较长。

本发明合成的CCK类似物用于1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶 (1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine，MPTP)诱导的PD动物模型的治疗，发现其行为学有明显改善。MPTP是一种神经毒素，当其进入体内后可跨血脑屏障进入脑内。MPTP本身并没有毒性，进入脑内的MPTP可被神经胶质细胞产生的单胺氧化酶B(Monoamine oxidase B，MAO-B)转化生成有毒的1- 甲基-4-苯基吡啶离子(1-Methyl-4-phenylpy ridinium ion，MPP+)。MPP+经多巴胺转运蛋白(Dopamine transporter，DAT)选择性转运至中脑黑质致密部的多巴胺能神经元，干扰线粒体代谢呼吸链中的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (Reducedform of nicotinamide adenine dinucleotide，NADH)脱氢酶，进一步生成大量自由基，造成氧化应激损害，破坏细胞结构，导致多巴胺能神经元大量死亡，从而导致类似于帕金森病的临床症状。MPTP引发的帕金森病的症状以及大脑结构改变均与PD患者十分类似，因而由MPTP诱导的PD动物模型广泛用于PD的研究。

因此，本发明拟运用MPTP诱导的急性PD动物模型小鼠，观察药物对动物行为学、多巴胺能神经元的影响，观察其是否能够逆转PD病理表现，改善PD 症状及其相关的分子生物学机制。该项目的完成不仅为PD相关治疗的研究领域提供新视野，还有助于阐明PD患者疾病异常进展的作用机制，进而为PD的诊疗提供新策略。

上述的CCK类似物的氨基酸序列为(GIp)-QDYTGWMDF-NH2。

CCK类似物的(给药)浓度为50nM。

需要说明的是，CCK类似物为CCK类似物药学上可以接受的衍生物。

本发明实施例第二方面公开了防治PD的药物，其为以CCK类似物为活性物质制成的制剂。

上述的CCK类似物的氨基酸序列为(GIp)-QDYTGWMDF-NH2。

另外，CCK类似物的(给药)浓度为50nM。

最后，上述制剂的剂型可为片剂、胶囊、注射剂或口服液。

CCK类似物在制备防治PD药物中的应用的发现及验证过程如下：

1.实验材料

MPTP购自Sigma公司；anti-TH购自Abcam公司，CCK类似物由上海强耀生物科技有限公司合成，氨基酸序列为：(GIp)-QDYTGWMDF-NH2；利拉鲁肽由上海强耀生物科技有限公司合成。

MPTP溶液的制备：将100mg MPTP粉末溶解于无菌PBS中，0.22μm无菌滤器过滤，分装后保存于-20℃冰箱，储存液(使用Sigma公司的PMA)为100nM (nM为nmol/L的简称)。

CCK类似物和利拉鲁肽溶液的制备：将CCK类似物或利拉鲁肽粉末溶解于无菌双蒸水中，分装后保存于-20℃冰箱，储存液(使用Sigma公司的PMA)为1mM (mM为mmol/L的简称)。

2.动物分组和模型建立

2.1MPTP急性PD小鼠模型：使用C57BL/6小鼠进行急性MPTP PD小鼠模型进行实验研究。小鼠称重(选取重量范围在18g至22g内的小鼠)后随机分为4 组，每组12只：

正常对照组：生理盐水(NS)

模型组：MPTP

CCK组：MPTP+CCK(50nM)

利拉鲁肽组：MPTP+利拉鲁肽(50nM)

MPTP(20mg/kg，i.p.)连续7d；在注射MPTP 1h后给予同体积的NS或CCK 类似物(50nM/kg/d,i.p.)或利拉鲁肽(50nM/kg/d,i.p.)，连续给药2周。

3行为学实验

3.1旷场实验

旷场实验可以评价PD实验动物在新异环境中的自主活动能力和探索能力。首先将实验动物放入实验箱中间适应活动10分钟后，使用旷场分析系统记录5 分钟内小鼠运动轨迹(crossing line)及后脚站立的次数(rearings)。每测试完1只动物后，清理底面动物粪便并用75％酒精消毒晾干后，再行测试下一只动物。每只动物重复测试2次，取平均值用于统计分析。

3.2转棒实验

转棒实验用来评价小鼠的四肢平衡协调能力，是运动协调方面药物筛选的重要方法。测试前3天，将小鼠放在滚轴上，设定转速为20rmp，每天训练3min，测试时记录小鼠在滚轴上停留的时间(即图2C所示出的Run Time)，即掉落潜伏期。

3.3爬杆实验

爬杆实验常用来检测PD实验动物的运动迟缓程度及肢体协调平衡能力。自制简易爬杆高55cm，顶端圆球直径1cm。将实验动物放置在圆球上，测试小鼠头朝上转为头向下的时间记为T-turn(turn time)，爬到杆底时间记为T-LA (locomotor activity time)。如果小鼠在球上不动时间超过30秒，即引导其头朝下爬杆，T-turn记录为30秒。每只动物重复测试3次，取平均值用于统计分析。

3.4动物取材

行为学测试结束后，每组分别取出3只小鼠用异氟烷麻醉后打开胸腔暴露心脏，剪开左心室，用预冷的生理盐水快速冲洗后，再用4％多聚甲醛灌注、固定。取出脑置于4％多聚甲醛中用于免疫组织荧光化学检测多巴胺能神经元特异性标志物酪氨酸羟化酶TH表达，观察黑质和纹状体多巴胺能神经元存活情况。

3.5免疫组织化学检测TH表达

取出置于4％多聚甲醛中固定的脑组织，转移到30％蔗糖溶液中过夜。使用冰冻切片机制备20微米厚的冠状切片。PBS清洗切片一次后用0.5％Triton X-100浸没30min，用含5％山羊血清的PBS溶液室温下封闭2h。于4℃孵育一抗(anti-TH)过夜。用PBS清洗一抗三次，每次10min。于室温孵育二抗1h 后再用PBS清洗两次，每次10min。在荧光显微镜或激光共聚焦显微镜下观察细胞形态及蛋白表达并拍照。

需要说明的是，CCK类似物氨基酸序列(GIp)-QDYTGWMDF-NH2的确定及合成是本研究最主要的技术关键；PD动物模型的成功制备是关系到实验能否顺利开展的核心技术关键。

技术经济指标

明确CCK类似物(GIp)-QDYTGWMDF-NH2对急性PD动物模型运动平衡能力和TH表达等的神经保护作用从而为PD的临床防治提供实验室依据。

为PD的临床治疗提供重要的分子靶点，从而筛选出具有高效生物活性的新型候选药物分子，提高临床治疗效果，减轻患者家庭的经济负担。

上述实验结果的统计学分析

所有数据均使用均数±标准差表示。实验结果用Graphpad Prism 5软件进行数据统计分析及图像绘制，多组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，两组间比较用T检验。

实验结果

1行为学结果

1)CCK类似物减轻了MPTP诱导的急性PD小鼠运动能力和探索能力损害

在旷场实验中，小鼠5分钟内在中心区域停留的时间百分比[Time in Zone(％)]和运动总距离(Total Distance)用来反映小鼠的运动能力，而小鼠后脚站立的次数(Rearing Number Total)被用来反映小鼠的探索能力。单因素方差分析的结果显示各组均数总体比较有差异，具有统计学意义。与正常对照组相比，模型组小鼠在中心区域停留的时间百分比和运动总距离以及后脚站立的次数均减少，差异具有统计学意义(P＜0.01，P＜0.001)；与模型组相比， CCK组各项指标均改善，差异具有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001)。但利拉鲁肽组小鼠在中心区域停留的时间百分比和后脚站立的次数均有所改善，但小鼠运动总距离没有变化。见图1A、图1B和图1C。

由图1A、图1B和图1C可知，CCK类似物减轻了MPTP诱导的急性PD小鼠的运动能力和探索能力的损害。**P＜0.01，***P＜0.001：与正常对照组相比； #P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001及ns与模型组相比。

2)CCK类似物减轻了MPTP诱导的急性PD小鼠运动迟缓和运动平衡能力的损害

在爬杆实验中，小鼠头朝上转为头向下的时间(T-turn)用来反映PD小鼠的运动迟缓，小鼠爬到杆底的时间(T-LA)用来反映PD小鼠的运动平衡能力。单因素方差分析的结果显示各组均数总体比较有差异，具有统计学意义。与正常对照组相比，模型组小鼠T-turn和T-LA均增加，差异具有统计学意义(P ＜0.001)；与模型组相比，CCK组和利拉鲁肽组T-turn和T-LA均减少，差异具有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001)。见图2A和2B。在转棒实验中，单因素方差分析的结果显示各组均数总体比较有差异，具有统计学意义。与正常对照组相比，模型组小鼠掉落潜伏期所用时间均减少，差异具有统计学意义(P＜0.01)；与模型组相比，CCK组和利拉鲁肽组小鼠掉落潜伏期所用时间均增加，差异具有统计学意义(P＜0.001)。见图2C。

由图2A、图2B和图2C可知，CCK类似物减轻了MPTP诱导的急性PD小鼠的运动迟缓和运动平衡能力的损害。*P＜0.05，***P＜0.001：与正常对照组相比；#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001与模型组相比。

3)CCK类似物减轻了MPTP诱导的急性PD小鼠多巴胺神经元损伤

利用多巴胺神经元特异性标志物TH免疫组织荧光化学方法分别检测各组小鼠黑质区TH表达，图3A、图3B、图3C和图3D分别为正常对照组、模型组、 CCK组和利拉鲁肽组小鼠黑质区TH阳性表达结果。图4为各组小鼠黑质区TH阳性表达统计结果。**P＜0.01：与正常对照组相比，#P＜0.05：与模型组相比(比例尺：50μm)。

因此，根据以上结果可知，CCK类似物具有MPTP引起的PD动物模型的神经保护作用，具有开发成抗PD药物的潜力。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.CCK类似物在制备防治PD药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的CCK类似物在制备防治PD药物中的应用，其特征在于，所述CCK类似物的氨基酸序列为（GIp）-QDYTGWMDF-NH2。

3.根据权利要求1所述的CCK类似物在制备防治PD药物中的应用，其特征在于，所述CCK类似物的浓度为50nM。

4.根据权利要求1所述的CCK类似物在制备防治PD药物中的应用，其特征在于，所述CCK类似物为CCK类似物药学上可以接受的衍生物。

5.一种防治PD的药物，其特征在于，为以CCK类似物为活性物质制成的制剂。

6.根据权利要求5所述的防治PD的药物，其特征在于，所述CCK类似物的氨基酸序列为（GIp）-QDYTGWMDF-NH2。

7.根据权利要求5所述的防治PD的药物，其特征在于，所述CCK类似物的浓度为50nM。

8.根据权利要求5所述的防治PD的药物，其特征在于，所述CCK类似物为CCK类似物药学上可以接受的衍生物。

9.根据权利要求5至8中任一项所述的防治PD的药物，其特征在于，所述制剂的剂型为片剂、胶囊、注射剂或口服液。