CN111297857A - 氯喹二磷酸盐的新用途 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了氯喹二磷酸盐的新用途，将氯喹二磷酸盐用于制备预防和治疗乙型脑炎药物的应用。本申请发现氯喹二磷酸盐在乙型脑炎病毒的感染中发挥重要的作用，氯喹二磷酸盐作用后具有抑制乙型脑炎病毒感染的特性，进一步发现氯喹二磷酸盐可通过抑制乙型脑炎病毒侵入靶细胞并可抑制病毒在靶细胞内的复制从而影响病毒的感染。本发明提供了氯喹二磷酸盐在治疗乙型脑炎病毒感染中的应用，为乙型脑炎病毒的预防和治疗提供了新的药物，具有良好的市场价值和临床应用前景。解决了现有技术中一直未有预防和治疗乙型脑炎特效药物的问题。

Description

氯喹二磷酸盐的新用途
技术领域
本申请涉及医药技术领域，具体而言，涉及氯喹二磷酸盐的新用途。
背景技术
目前，乙型脑炎病毒又称日本脑炎病毒(Japanese encephalitisvirus，JEV)，为有包膜的单正链RNA病毒。JEV为流行性乙型脑炎的病原体，主要以蚊虫为媒介进行传播，感染后能够引发脑炎或脑膜炎等严重的急性神经系统症状，严重感染者可导致死亡。JEV与西尼罗病毒(West Nile Virus，WNV)、黄热病毒(Yellow Fever Virus，YFV)、登革病毒(Dengue Virus，DENV)在分类学上同属于黄病毒科(Flaviviridae)黄病毒属(Flavivirus)成员。JEV病毒颗粒直径约50nm，基因组全长约11kb，主要编码3种结构蛋白(核心蛋白C，膜蛋白M，包膜蛋白E)和7种非结构蛋白(NS1，NS2A，NS2B，NS3，NS4A，NS4B，NS5)[GaoX,LiX,LiM,etal.Vaccine Strategies for the Control and Prevention of JapaneseEncephalitis in Mainland China,1951-2011.PLoS Negl Trop Dis.2014；8(8):e3015.]。非结构蛋白主要参与病毒在宿主细胞内的复制与组装过程，病毒核衣壳(capsid)由核心蛋白C参与组装，膜蛋白M与包膜蛋白E分布于病毒颗粒表面，参与病毒侵入宿主细胞，也是宿主抗病毒免疫的主要攻击靶点[Denizot M,Neal JW,Gasque P.Encephalitisdue to emerging viruses:CNS innate immunity and potential therapeutictargets.J Infect.2012.65(1):1-16.]。
迄今为止，还没有特异的药物或特效的方法来治疗乙型脑，主要是广谱抗病毒治疗和对症治疗。在抗病毒药物上以广谱的抗病毒核酸类似物(如利巴韦林)和细胞因子类(如干扰素)为主，也有核酸靶向治疗剂和黄酮类化合物等用于治疗的报道。目前，虽有一些针对乙型脑炎病毒复制的抗病毒药物、疫苗、RNA等方面的报道，但大都还处于研发阶段。为了找到有效治疗方法，国内外研究人员一直在研发靶向乙型脑炎病毒感染得药物，主要集中在几个研究方向：一是从现有药物中寻找具有较好抗病毒效果的来治疗乙型脑炎；二是依据JEV的分子生物学特点设计并合成现有抗病毒药物的衍生物；三是设计与筛选新的抗JEV的药物。但是现今取得的抗JEV效果评估主要停留在动物模型、细胞和分子水平阶段，能否被应用于临床治疗，还有待深入的研究。
氯喹二磷酸盐(Chloroquine diphosphate)是奎宁的一种衍生物，作为抗疟药物被广泛应用。目前主要用于风湿免疫性疾病的治疗，并且还具有抗肿瘤活性，其作用机制包括：影响溶酶体功能，抑制细胞自噬，调节免疫，影响相关蛋白及通路，抑制炎症反应，影响内涵体功能，通过线粒体途径诱导细胞凋亡以及化疗增敏等[韩丽珠,石慧,肖洪涛,陈晓玲.羟氯喹在肿瘤治疗中的研究现状[J].中国临床药理学杂志,2018,34(16):2022-2025.]。此外，多项研究已表明氯喹具有治疗多种病毒感染的潜力，可抑制包括寨卡病毒，人类免疫缺陷病毒，冠状病毒等的pH依赖阶段性复制[SavarinoA,Di TraniL,DonatelliI,Cauda R,Cassone A.New insights into the antiviral effects ofchloroquine.Lancet Infect Dis.2006；6(2):67–69.doi:10.1016/S1473-3099(06)70361-9]。近期，也被证实对新型冠状病毒具有抑制作用，正应用于临床治疗[Gao J,TianZ,Yang X.Breakthrough:Chloroquine phosphate has shown apparent efficacy intreatment of COVID-19 associated pneumonia in clinical studies[publishedonline ahead of print,2020 Feb 19].Biosci Trends.2020；10.5582/bst.2020.01047.doi:10.5582/bst.2020.01047]。
针对目前尚未有文献报道氯喹二磷酸盐在抗乙型脑炎病毒感染中的作用及应用于乙型脑炎的治疗。
发明内容
本申请的主要目的在于提供氯喹二磷酸盐的新用途，以解决相关技术中的问题。
为了实现上述目的，第一方面，本申请提供了氯喹二磷酸盐的新用途。
根据本申请的氯喹二磷酸盐的新用途：将氯喹二磷酸盐用于制备预防和治疗乙型脑炎药物的应用。
进一步的，将氯喹二磷酸盐用于制备预防和治疗乙型脑炎药物的应用时，本申请发现氯喹二磷酸盐具有对乙型脑炎病毒具有抑制作用。
具体地，氯喹二磷酸盐作用于乙型脑炎病毒的入侵环节，对乙型脑炎病毒侵入靶细胞具有抑制作用。同时，氯喹二磷酸盐具有抑制乙型脑炎病毒在侵入的靶细胞中进行复制的作用，进而抑制所述病毒的感染。
另一方面，本申请发现，将氯喹二磷酸盐用于制备预防和治疗乙型脑炎药物的应用时，氯喹二磷酸盐的预防和治疗效果、抑制乙型脑炎病毒作用均与氯喹二磷酸盐浓度成正相关。
例如，所述氯喹二磷酸盐浓度为25％-100％。
综合上述技术方案，进而解决现有技术中一直未找到预防和治疗乙型脑炎特效药的技术问题，为乙型脑炎病毒的预防和治疗提供了新的药物，具有良好的市场价值和临床应用前景。
附图说明
构成本申请的一部分的附图用来提供对本申请的进一步理解，使得本申请的其它特征、目的和优点变得更明显。本申请的示意性实施例附图及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：
图1为氯喹二磷酸盐作用后对病毒感染的影响图，横坐标为药物浓度，纵坐标为JEV病毒基因量；
图2为不同浓度的氯喹二磷酸盐作用后对细胞毒性的影响图，横坐标为药物浓度，纵坐标为细胞活力；
图3为氯喹二磷酸盐作用后对病毒感染性影响的免疫荧光检测图；
图4为氯喹二磷酸盐作用后对病毒感染性影响的免疫荧光统计分析图；
图5为氯喹二磷酸盐作用后对病毒入侵量的影响，横坐标为药物浓度，纵坐标为病毒基因量；
图6为氯喹二磷酸盐作用后对病毒复制量的影像图，横坐标为药物浓度，纵坐标为病毒基因拷贝量；
图7为氯喹二磷酸盐作用后对JEV感染小鼠脑组织中病毒量的影响图，横坐标为分组，纵坐标为脑组织中病毒基因拷贝量。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本申请方案，下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本申请保护的范围。
需要说明的是，本申请的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本申请的实施例。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
在本申请中，术语“上”、“下”、“左”、“右”、“前”、“后”、“顶”、“底”、“内”、“外”、“中”、“竖直”、“水平”、“横向”、“纵向”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系。这些术语主要是为了更好地描述本申请及其实施例，并非用于限定所指示的装置、组件或组成部分必须具有特定方位，或以特定方位进行构造和操作。
并且，上述部分术语除了可以用于表示方位或位置关系以外，还可能用于表示其他含义，例如术语“上”在某些情况下也可能用于表示某种依附关系或连接关系。对于本领域普通技术人员而言，可以根据具体情况理解这些术语在本申请中的具体含义。
另外，术语“多个”的含义应为两个以及两个以上。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本申请。
本申请发现的氯喹二磷酸盐的新用途，将氯喹二磷酸盐用于制备预防和治疗乙型脑炎药物的应用。具体地将氯喹二磷酸盐用于制备预防和治疗乙型脑炎药物的应用时，氯喹二磷酸盐具有对乙型脑炎病毒具有抑制作用。
这种抑制作用例如，氯喹二磷酸盐作用于乙型脑炎病毒的入侵环节，对乙型脑炎病毒侵入靶细胞具有抑制作用。例如，氯喹二磷酸盐具有抑制乙型脑炎病毒在侵入的靶细胞中进行复制的作用，进而抑制所述病毒的感染。
同时，本申请还发现将氯喹二磷酸盐用于制备预防和治疗乙型脑炎药物的应用时，氯喹二磷酸盐的预防和治疗效果、抑制乙型脑炎病毒作用均与氯喹二磷酸盐浓度成正相关。例如，所述氯喹二磷酸盐浓度为25％-100％。
以下为本申请为了证实氯喹二磷酸盐对乙型脑性具有预防和治疗效果的试验：本申请用到的人神经母细胞瘤系SK-N-SH，购自ATCC，保藏号：ATCC HTB-11。
1JEV感染SK-N-SH细胞
(1)将SK-N-SH细胞(购自ATCC，保藏号：ATCC HTB-11)铺在24孔细胞培养板上培养12-16h，使得开展实验时细胞密度约为孔面积的70％-80％。
(2)病毒感染实验时先将培养液去除，用37℃预温PBS清洗3次后接种JEV病毒株SA14，病毒采用全培液进行稀释，接种剂量为MOI＝0.5，病毒接种后于37℃培养箱中孵育1h，弃去病毒液并用预温PBS润洗3次，加入新鲜培养基继续培养后用于病毒检测。
2实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测JEV病毒量
(1)采用TRIzol裂解法提取各组的组织或细胞的总RNA，步骤如下：
细胞处理后去培养上清，PBS清洗3次后在细胞中加入1ml TRIzol，充分混合室温裂解细胞3-5min。动物脑组织处理后每个样本称取100mg，液氮充分研磨后，加入2mlTRIzol，充分混合室温裂解细胞5-10分钟。每个样本加入1/5体积的氯仿，手动剧烈混匀后于4℃、12,000转条件下离心15min。离心结束后，小心吸取上层水相转移到新的EP管中，加入等体积异丙醇后充分混合，置于室温下沉淀10min。于4℃、12,000转条件下离心10min，弃上清液，每管加入1ml 4℃预冷的75％乙醇。充分清洗沉淀后于4℃、12,000离心5min，弃上清，打开EP管盖后于室温晾干RNA沉淀，加入等体积的DEPC水溶解沉淀，获得总RNA。
(2)利用反转录试剂盒(Takara)提取各组样本中的cDNA，步骤如下：
在PCR管中配置如下的反应体系，
Figure BDA0002404936550000061
用移液器轻柔混合均匀，置于37℃水浴锅中反应15min，然后置于85℃水域中加热5s来灭活体系中的逆转录酶。
(3)实时荧光定量PCR(RT-PCR)进行基因表达检测
利用SYBR Premix Ex Taq试剂盒(Takara)配置反应体系，具体如下，
Figure BDA0002404936550000062
利用Rotor Gene 3000A仪器进行两步法扩增，95℃预变性2min，PCR进行40个循环，每个循环95℃5s，60℃30s。
3免疫荧光法检测JEV抗原
SK-N-SH细胞经各项处理后于培养箱中继续培养48h，采用免疫荧光法检测病毒抗原的表达，步骤如下：
(1)固定细胞：将96孔板中的培养液移去后加入PBS清洗细胞3次，每孔加入100μl预冷甲醇后置于-20℃条件下低温固定30min，结束后去除甲醇，用预冷的PBS清洗细胞3次。
(2)透膜：固定后的细胞还原至室温后，每孔加入100μl 0.1％TritonX-100，放置于水平摇床于室温下孵育15min，用PBS洗涤3次。
(3)封闭：每孔加入100μl 3％BSA，放置于水平摇床于室温下孵育1h。
(4)孵育一抗：每孔加入针对JEV包膜蛋白E特异性鼠源单克隆抗体(1:2000稀释)100μl，室温孵育1h，孵育结束后去除一抗，用PBS洗涤3次。
(5)孵育二抗：每孔加入绿色荧光标记的抗鼠IgG(1:1000稀释)100μl，室温避光孵育1h，孵育结束后去除二抗，用PBS避光洗涤3次。
(6)标记细胞核：每孔加入核荧光染料DAPI(1:10000稀释)，室温避光孵育15min，用预冷的PBS避光洗涤3次。
(7)将荧光显微镜调至488nm波长荧光通道，检测并统计绿色荧光阳性细胞克隆数。
4氯喹二磷酸盐药物作用
(1)分组：实验分为一般感染组和氯喹二磷酸盐药物处理组，每一组每个药物浓度均设置3个复孔，实验独立重复三次。
(2)将SK-N-SH细胞铺在24孔细胞培养板上培养12-16h，使得开展实验时细胞密度约为孔面积的70％-80％。吸出培养上清，用37℃预温的PBS润洗3次，每孔分别加入不同浓度的药物500μl后置于37℃孵育1h，一般感染组加入等量全培液进行孵育。
(3)弃去化学药物溶液，每孔加入等量的病毒稀释液(MOI＝0.5)，37℃孵育1h进行病毒感染，结束后弃去病毒液，预温PBS润洗3次。每孔分别加入含不同浓度梯度的药物的细胞全培液500μl，继续培养48h后用于病毒检测。JEV病毒量检测方法同步骤2，JEV抗原免疫荧光检测通步骤3。
5细胞毒性实验
采用CCK-8方法检测使用氯喹二磷酸盐后对细胞活性的影响，步骤如下：
收集对数生长期细胞接种于96孔板，每孔3000个细胞。待细胞贴壁培养12h后，将培养液改为含不同浓度氯喹二磷酸盐药物的培养液，继续培养48h后检测细胞增殖情况。弃去原有培养基，每孔加入含10μL CCK-8的新鲜培养基110μL，孵育3h后终止，用酶标仪在450nm波长下检测各孔吸光度值，实验独立重复3次，计算平均值。
6病毒入侵实验
(1)在96孔板或24孔板中接种SK-N-SH细胞，在孵箱中培养12-16h。实验设置药物处理组以及一般感染组，每一组每一药物浓度各设置3个复孔，实验独立重复3次。
(2)每孔中加入不同浓度梯度的氯喹二磷酸盐后先于37℃孵育1h，一般感染组加入等量全培液。将含有药物的JEV病毒液加入到细胞中去，先置于4℃孵育1h，紧接着转移至37℃感染1h。
(3)用预冷PBS清洗以去除未结合的病毒，每孔加入400μl蛋白酶K溶液(1mg/ml)去除与细胞结合但未进入胞内的病毒。4℃孵育30min后弃去上清，用预冷PBS润洗3次。JEV病毒量检测方法同步骤2。
7病毒复制实验
(1)分组：实验分为一般感染组和化学药物干扰组，每一组每个药物浓度均设置3个复孔，实验独立重复三次。
(2)将SK-N-SH细胞铺在24孔细胞培养板上培养12-16h，使得开展实验时细胞密度约为孔面积的70％-80％。吸出培养上清，每孔加入等量的病毒稀释液(MOI＝0.5)，37℃孵育1h进行病毒感染，结束后弃去病毒液，预温PBS润洗3次。每孔分别加入终浓度为50μM的氯喹二磷酸盐药物的细胞全培液500μl继续培养，分别于培养后的2h，24h，48h收集各组细胞用于病毒检测。JEV检测方法同步骤2。
8动物实验
(1)将54只3周龄C57BL/6雌性小鼠随机分为3组，对照组、JEV感染组、JEV感染组+氯喹二磷酸盐组，每组只18只。
(2)将JEV病毒株SA14用DMEM培养液稀释，将病毒按照100μl/只(2LD50)的剂量对JEV感染组、JEV感染组+氯喹二磷酸盐组进行腹腔注射，对照组按照100μl/只腹腔注射等量DMEM培养液。接种后将小鼠置于SPF级条件下进行饲养。
(3)病毒接种后，JEV感染组+氯喹二磷酸盐组按照10mg/kg的剂量尾静脉注射氯喹二磷酸盐稀释液，每日注射一次。对照组与JEV感染组则尾静脉注射等体积的PBS溶液。每日观察并记录小鼠情况，并分别于病毒感染后的2，4，6天从每组随机选取6只小鼠，麻醉处死后采集脑组织，冻存于-80℃。待实验结束后，提取各组脑组织基因组用于检测病毒量。检测方法同步骤2。
实验结果：
采用不同浓度梯度的氯喹二磷酸盐作用于SK-N-SH细胞，检测药物作用后对JEV感染靶细胞的影响。结果发现随着药物浓度的提高，JEV的病毒量逐渐降低(图1)，提示氯喹二磷酸盐对JEV感染具有抑制作用，且呈现浓度依赖性。为排除药物作用于细胞的毒性作用，采用CCK8法检测不同浓度药物作用后靶细胞的增殖活性，结果如图2所示，不同浓度氯喹二磷酸盐作用并未产生明显的细胞毒性，表明氯喹二磷酸盐对病毒感染的抑制作用并非由于其细胞毒性所致。进一步，不同浓度氯喹二磷酸盐作用后，采用免疫荧光法检测病毒抗原来分析对JEV感染的影响，发现随着氯喹二磷酸盐浓度的提高对JEV感染抑制作用增强，具有梯度依赖性，与病毒RNA检测结果相一致(图3、图4)。以上结果表明，氯喹二磷酸盐能够抑制JEV感染且抗病毒能力与药物浓度成正相关性。
采用病毒入侵实验分析氯喹二磷酸盐是否作用于病毒的入侵环节，结果发现，不同浓度氯喹二磷酸盐作用后抑制了JEV进入SK-N-SH细胞，且呈现浓度依赖性(图5)，表明氯喹二磷酸盐可作用于病毒的入侵环节。进一步分析氯喹二磷酸盐对病毒复制的影响发现，氯喹二磷酸盐作用后可明显抑制JEV的拷贝数(图6)，表明氯喹二磷酸盐显著抑制了病毒的复制。采用C57小鼠病毒感染动物模型分析氯喹二磷酸盐对JEV在体内复制的影响发现，与未给药组相比，剂量的氯喹二磷酸盐作用后可明显抑制小鼠脑组织中JEV的病毒量(图7)，进一步证实氯喹二磷酸盐抗JEV感染作用。
通过以上实验结果证明：本发明发现氯喹二磷酸盐可明显抑制JEV在SK-N-SH细胞中的感染，进一步发现氯喹二磷酸盐可通过抑制乙型脑炎病毒侵入靶细胞并可抑制病毒在靶细胞内的复制从而影响病毒的感染，起到抗病毒的作用。本发明为乙型脑炎病毒的预防和治疗提供了新的药物，具有较好的市场价值和临床应用前景。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (6)

1.氯喹二磷酸盐的新用途，其特征在于，将氯喹二磷酸盐用于制备预防和治疗乙型脑炎药物的应用。
2.如权利要求1所述的新用途，其特征在于，将氯喹二磷酸盐用于制备预防和治疗乙型脑炎药物的应用时，氯喹二磷酸盐具有对乙型脑炎病毒具有抑制作用。
3.如权利要求2所述的新用途，其特征在于，氯喹二磷酸盐作用于乙型脑炎病毒的入侵环节，对乙型脑炎病毒侵入靶细胞具有抑制作用。
4.如权利要求2所述的新用途，其特征在于，氯喹二磷酸盐具有抑制乙型脑炎病毒在侵入的靶细胞中进行复制的作用，进而抑制所述病毒的感染。
5.如权利要求1-4任一一项所述的新用途，其特征在于，将氯喹二磷酸盐用于制备预防和治疗乙型脑炎药物的应用时，氯喹二磷酸盐的预防和治疗效果、抑制乙型脑炎病毒作用均与氯喹二磷酸盐浓度成正相关。
6.如权利要求5所述的新用途，其特征在于，所述氯喹二磷酸盐浓度为25％-100％。
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