CN111297721A - 羟乙基二磷酸在皂基沐浴露中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及羟乙基二磷酸在皂基沐浴露中的应用，羟乙基二磷酸在皂基沐浴露中的添加量为重量百分比0.05～0.4%，通过向皂基沐浴露原料中添加羟乙基二磷酸，使皂基沐浴露无需添加防腐剂，羟乙基二磷酸发挥其金属螯合的作用，抑制了促进细菌滋生的催化环境，加强了皂基沐浴露偏碱性环境对细菌的抑制作用，因而具有防腐抑菌的效果，具体的防腐抑菌效果：30d和60d，沐浴露的质变率分别为0.005%和0.011%；24h和48h大肠杆菌的抑菌率分别为94.47%和96.55%；24h和48h，变形链球菌的抑菌率分别为96.92%和98.37%；24h和48h，结核杆菌的抑菌率分别为94.68%和98.31%；24h和48h，金黄色葡萄球菌的抑菌率分别为95.86%和95.28%。

Description

羟乙基二磷酸在皂基沐浴露中的应用

技术领域

本发明涉及羟乙基二磷酸的新应用，具体涉及羟乙基二磷酸在皂基沐浴露中的应用，确切地说是一种羟乙基二磷酸在偏高pH值、不含防腐剂的皂基沐浴露中的应用。

背景技术

研究报道羟乙基二磷酸（又名羟基乙叉二磷酸、依替磷酸）常用作锅炉水、循环水、油田注水处理中的阻垢缓蚀剂。常与聚羟酸类阻垢分散剂复配；还可作无氰电镀络合剂，漂染业的固色剂，过氧化氢稳定剂，因此羟乙基二磷酸在工业应用中较为广泛，而含有羟乙基二磷酸的皂基沐浴露，羟乙基二磷酸能使皂基沐浴露无需添加防腐剂而具备防腐抑菌的作用未见报道。

现市面上有售的沐浴露产品，一般为了延长其保质期、防止沐浴露在短时间内腐败变质而在沐浴露产品中添加防腐剂，实践表明，采用防腐剂是达到上述目的的最经济、最有效和最简捷的办法之一，但是防腐剂对人体皮肤的刺激性较高，过量使用防腐剂会对人体皮肤造成伤害，严重者甚至会引发皮肤癌，因此市面上出现了一些不含有防腐剂的沐浴露产品，但是这种不含防腐剂的沐浴露产品的保质期一般不长，仅能保存一个月左右，使该沐浴露的推广应用受阻，无法得到大多数人的认可。

同时随着当今社会经济的稳步发展，作为代价的，环境也越来越差，空气中充斥着各种各样的病毒、细菌，我们暴露在空气中的皮肤自然也沾满了细菌和病毒，从而导致各种各样的内部疾病，衣物上的病菌则可能在与肌肤接触的过程中导致各种各样的皮肤病，针对上述问题，现有市面上有售沐浴露产品，虽然有不少贯以杀菌的功效，但事实上其中的杀菌成分很少，杀菌效果也很弱，对人体的保护作用很弱。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明提供羟乙基二磷酸在偏高pH值、不含防腐剂的皂基沐浴露中的应用，具有防腐抑菌的效果。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

羟乙基二磷酸在皂基沐浴露中的添加量为重量百分比0.05～0.4%。

进一步的，所述皂基沐浴露制备原料中不包括防腐剂。

本发明的有益效果是：本发明通过向皂基沐浴露原料中添加羟乙基二磷酸，使皂基沐浴露无需添加防腐剂，羟乙基二磷酸发挥其金属螯合的作用，抑制了促进细菌滋生的催化环境，加强了皂基沐浴露偏碱性环境对细菌的抑制作用，因而具有防腐抑菌的效果，具体的防腐抑菌效果：30d和60d，沐浴露的质变率分别为0.005%和0.011%；24h和48h大肠杆菌的抑菌率分别为94.47%和96.55%；24h和48h，变形链球菌的抑菌率分别为96.92%和98.37%；24h和48h，结核杆菌的抑菌率分别为94.68%和98.31%；24h和48h，金黄色葡萄球菌的抑菌率分别为95.86%和95.28%。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。

实施例一：

本实施例公开了羟乙基二磷酸在一种皂基沐浴露中的应用，由以下重量百分比的原料制成：

液体皂基：30%；

固含量为30%的丙烯酸酯共聚物：1.5%；

浓度为20%的氢氧化钾溶液：3.1%；

浓度为30%的磷酸氢二钾溶液：2%；

椰油酰胺丙基甜菜碱：5%；

椰油酰胺DEA： 3.6%；

浓度为20%的氯化钾溶液：20%；

羟乙基二磷酸：0.1%；

香精：1.2%；

余量为电导率小于2μs/cm的去离子水；

其中所述羟乙基二磷酸用浓度为20%的氢氧化钾溶液中和至pH值为8.5～10.0的溶液。

皂基沐浴露按以下步骤进行制备：

步骤一，在常温状态下，向搅拌锅中加入固含量为30%的丙烯酸酯共聚物和水，并搅拌均匀，加入适量的浓度为20%的氢氧化钾溶液将丙烯酸酯中和至液体透明；

步骤二，再向搅拌锅中依次加入浓度为30%的磷酸氢二钾溶液，羟乙基二磷酸，浓度为20%的氯化钾溶液，椰油酰胺丙基甜菜碱以及椰油酰胺DEA混合搅拌均匀；

步骤三，用浓度为20%的氢氧化钾溶液调节pH值至9～9.5；

步骤四，再向搅拌锅中加入液体皂基并搅拌均匀，得到料体；

步骤五，取出5克料体，与纯水按1:9配制成10%溶液，测定pH值，计算料体pH值调节应加入的氢氧化钾溶液量；

步骤六，用浓度为20%的氢氧化钾溶液调节料体的pH值至9.5～10，得到沐浴露产品。

其中所述丙烯酸酯聚合物通过以下步骤制备而成，

原料：

丙烯酸：3%；

甲基丙烯酸：10%；

丙烯酸乙酯：9.5%；

丙烯酸丁酯：7.8%；

交联剂： 0.1%；

引发剂0.1%；

乳化剂1%；

余量为电导率小于2μs/cm的去离子水；

丙烯酸酯聚合物的制备方法：

步骤一，将0.05%的引发剂放入适量的水中混合，充分溶解后，得到水相，所述引发剂为过硫酸钾；

步骤二，将3%的丙烯酸、10%的甲基丙烯酸、9.5%的丙烯酸乙酯、7.8%的丙烯酸丁酯以及0.1%的交联剂混合，得到油相；

步骤三，将1%的乳化剂、0.05%的引发剂和剩余的水放入乳化反应器中，升温至80℃，并将水相和油相缓慢等比例均匀抽入乳化反应器中搅拌混合，聚合反应发生并形成微乳液，在聚合乳化反应过程中，体系中可能暂时会出现少量的渣粒，可在反应后过滤去除；

步骤四，将微乳液冷却至50℃并过滤得到半成品；

步骤五，将步骤四中得到的微乳液脱水提纯得到丙烯酸酯共聚物。

丙烯酸酯共聚物的检验结果如下表：

检验项目	实测值	分析方法
			外观（25℃）	符合要求	目测
气味	符合要求	正常感观
			pH（10%水溶液）	2.75	GB/T6368
固含量（%）	30.1	QBT1974
			细菌（CFU/g）	N.D	GB7918.2
霉菌（CFU/g）	N.D	GB7918.2

可以通过加热将微乳液中的水分蒸发，蒸发后存在于蒸发皿中的固体物质主要成分即为丙烯酸酯共聚物，可以通过该固体物质的质量与微乳液的质量之比计算微乳液的固含量，通过微乳液的固含量计算微乳液中丙烯酸酯共聚物的质量，而在液体皂基配制时，添加丙烯酸酯共聚物可用微乳液进行添加，通过丙烯酸酯共聚物固含量的质量换算进行微乳液添加即可，而无需进行脱水提纯步骤，简化工作流程，相应的氢氧化钾和脂肪酸也可以使用相应的溶液进行质量换算即可。所述丙烯酸、甲基丙烯酸、丙烯酸乙酯、丙烯酸丁酯以及交联剂在引发剂的作用下发生共聚合反应形成丙烯酸酯共聚物，并使丙烯酸酯共聚物稳定存在。

所述液体皂基通过以下步骤制备而成，

固含量为30%的丙烯酸酯共聚物：5%；

氢氧化钾：8.5%；

十二酸：20%；

十四酸：4%；

余量为电导率小于2μs/cm的去离子水；

液体皂基制备，按以下步骤进行：

步骤一，在常温状态下，将5%丙烯酸酯共聚物（固含量30%）加入水中搅拌混合，再加入氢氧化钾形成均匀的稠状透明液体；

步骤二，将步骤一中均匀的稠状透明液体加热至80℃，保温30～40分钟，再加入十二酸搅拌混合；

步骤三，待全部十二酸反应完毕，溶液成均匀透明粘稠液体；

步骤四，再加入十四酸；

步骤五，待全部十四酸反应完毕，溶液成均匀透明粘稠液体；

步骤六，取出5克步骤五中得到的均匀透明粘稠液体，与纯水按1：9配制成10%溶液，测定pH值，计算液体pH值调节应加入的氢氧化钾溶液量；

步骤七，用浓度为20%的氢氧化钾溶液调节pH至9.5～11之间；

步骤八，冷却至常温状态，得到液体皂基。

以上原料的重量百分比含量采用该物质的溶液加入体系内的，均可以通过固含量进行该物质的百分比含量进行计数转化，使该物质添加到体系内的配比相符。

实施例二：

本实施例公开了羟乙基二磷酸在一种皂基沐浴露中的应用，由以下重量百分比的原料制成：

液体皂基：45%；

固含量为30%的丙烯酸酯共聚物：4.3%；

浓度为20%的氢氧化钾溶液：1.7%；

浓度为30%的磷酸氢二钾溶液：1.5%；

椰油酰胺丙基甜菜碱：10%；

羟乙基二磷酸：0.1%；

悬浮粒子：0.8%；

香精：0.8%；

余量为电导率小于2μs/cm的去离子水；

其中所述羟乙基二磷酸用浓度为20%的氢氧化钾溶液中和至pH值为8.5～10.0的溶液。

所述悬浮粒子可以为各类花瓣等物质，花瓣等悬浮粒子悬浮于体系内使皂基沐浴露的美观度提高，同时花瓣中含有众多天然的营养物质，可以帮助肌肤恢复活力和促进更新过程，还能滋养并提供肌肤所需的矿物质；增加肌肤弹性、保湿和防止肌肤提早老化；改善干燥皮肤，肌肤显现嫩滑，触感更细腻等多种功效；

皂基沐浴露按以下步骤进行制备：

步骤一，在搅拌锅中加入皂基，然后边搅拌边依次加入适量的去离子水（10%）、椰油酰胺丙基甜菜碱、浓度为30%的磷酸氢二钾溶液、浓度为20%的氢氧化钾溶液，搅拌作用下充分反应后得到组分A；

步骤二，在另一搅拌锅中加入剩余的去离子水和丙烯酸酯共聚物混合并搅拌均匀，得到组分B；

步骤三，在快速搅拌下（搅拌速度为500～700r/min）把组分B缓慢加入组分A中混合，待搅拌锅中的液体完全透明后，得到组分C；

步骤四，向组分C中加入悬浮粒子、香精和羟乙基二磷酸搅拌均匀，使悬浮粒子均匀悬浮与体系内，得到组分D；

步骤五，向组分D中加入适量浓度为20%的氢氧化钾溶液调节pH值至9.9～10.0，得到沐浴露产品。

由于本实施例中添加了悬浮粒子，因此需要添加更多的丙烯酸酯共聚物（＞2%）以提高体系的悬浮能力。

本实施例中丙烯酸酯共聚物、液体皂基的制备方法与实施例一中的制备方法相同。

实施例三：

本实施例公开了羟乙基二磷酸在一种皂基沐浴露中的应用，由以下重量百分比的原料制成：

液体皂基：50%；

固含量为30%的丙烯酸酯共聚物：0.5%；

浓度为20%的氢氧化钾溶液：1%；

浓度为30%的磷酸氢二钾溶液：2%；

浓度为20%的氯化钾溶液：20%

椰油酰胺丙基甜菜碱：5%；

椰油酰胺甲基MEA：2.5%；

羟乙基二磷酸：0.1%；

香精：1.4%；

余量为电导率小于2μs/cm的去离子水；

其中所述羟乙基二磷酸用浓度为20%的氢氧化钾溶液中和至pH值为8.5～10.0的溶液。

皂基沐浴露按以下步骤进行制备：

步骤一，往搅拌锅中加入丙烯酸酯聚合物和去离子水混合搅拌均匀，并加入浓度为20%的氢氧化钾溶液中和至溶液透明；

步骤二，再往搅拌锅中依次加入液体皂基、磷酸氢二钾、椰油酰胺丙基甜菜碱、椰油酰胺MEA、浓度为20%的氯化钾溶液混合搅拌均匀；

步骤三，再往搅拌锅中加入香精和羟乙基二磷酸溶液混合搅拌均匀；

步骤四，再加入适量的浓度为20%的氢氧化钾溶液将沐浴露的pH值调至9.9～10.0，得到沐浴露产品。

本实施例中丙烯酸酯共聚物、液体皂基的制备方法与实施例一中的制备方法相同。

实施例四：

本实施例公开了羟乙基二磷酸在一种皂基沐浴露中的应用，由以下重量百分比的原料制成：

液体皂基：60%；

浓度为30%的磷酸氢二钾溶液：2%；

浓度为20%的氯化钾溶液：20%

椰油酰胺丙基甜菜碱：5%；

椰油酰胺甲基MEA：2.5%；

羟乙基二磷酸：0.1%；

香精：0.7%；

浓度为20%的氢氧化钾溶液：0.7 %；

余量为电导率小于2μs/cm的去离子水；

其中所述羟乙基二磷酸用浓度为20%的氢氧化钾溶液中和至pH值为8.5～10.0的溶液。

皂基沐浴露按以下步骤进行制备：

步骤一，往搅拌锅中依次加入液体皂基、去离子水、磷酸氢二钾、椰油酰胺丙基甜菜碱、椰油酰胺MEA、浓度为20%的氯化钾溶液混合搅拌均匀；

步骤二，再往搅拌锅中加入香精和羟乙基二磷酸溶液混合搅拌均匀；

步骤三，再加入适量浓度为20%的氢氧化钾溶液将沐浴露的pH值调至9.9～10.0，得到沐浴露产品。

本实施例中丙烯酸酯共聚物、液体皂基的制备方法与实施例一中的制备方法相同。

实施例五：

本实施例公开了羟乙基二磷酸在一种皂基沐浴露中的应用，由以下重量百分比的原料制成：

十二酸：6.2%；

十四酸：11.8%；

氢氧化钾：4.7%；

椰油酰胺丙基甜菜碱：13%；

丙二醇：3%；

聚乙二醇-7椰子油甘油酯：5%；

甲基葡萄糖苷聚乙二醇-120油酸二酯：3.4%；

盐酸苯海拉明：1.4%；

薄荷脑：5%；

珠光剂：1%；

香精：1%；

螯合剂：0.1%；

羟乙基二磷酸：0.1%；

去离子水：余量；

制作方法：

步骤一，称取所需重量的原料，并将氢氧化钾用去离子水制成质量分数浓度为35％～55％水溶液，备用；
	步骤二，将十二酸、十四酸加入去离子水中，加热至70～90℃溶解；
步骤三，加入氢氧化钾溶液，加热至70～90℃进行皂化反应；
	步骤四，反应完全后保持加热至70～90℃，加入椰油酰胺丙基甜菜碱、丙二醇、聚乙二醇-7椰子油甘油酯、甲基葡萄糖苷聚乙二醇-120油酸二酯、珠光剂，混合均匀；
步骤五，冷却至35～45℃后加入其余原料，混合均匀即得。

实施例六：

本实施例公开了羟乙基二磷酸在一种皂基沐浴露中的应用，由以下重量百分比的原料制成：

十二酸：6%；

十四酸：3.2%；

十六酸：6%；

十八酸：0.7%；

氢氧化钾：4%；

珠光剂：3%；

脂肪酸单乙醇酰胺：1.2%；

悬浮稳定剂：1%；

多元醇：5%；

阴离子表面活性剂：0.5%；

两性表面活性剂：0.5%；

增稠剂：1%；

调理剂：0.5%；

羟乙基二磷酸：0.1%；

香精：0.5%；

去离子水：余量。

制备方法为：先将十二酸、十四酸、十六酸、十八酸混合均匀，在搅拌下加热至65～70℃，再将65～75℃去离子水加入其中，混合均匀后，加入氢氧化钾充分中和皂化反应，加入珠光剂、脂肪酸单乙醇酰胺、悬浮稳定剂、多元醇、阴离子表面活性剂、两性表面活性剂、调理剂和增稠剂，混匀后冷却至38～42℃，最后加入羟乙基二磷酸、香精，充分搅拌均匀，待温度降至常温即得。

实施例七：

本实施例公开了羟乙基二磷酸在一种皂基沐浴露中的应用，由以下重量百分比的原料制成：

十二酸：8%；

十四酸：5.2%

羟苯甲酯：0.1%；

羟苯丙酯：0.1%；

氢氧化钾：3%；

羟丙基纤维素：0.2%；

丙二醇：2%；

乙二胺四乙酸二钠：0.05%；

椰油酰胺：2%；

乙二醇二硬脂酸酯：2%；

异硬脂酰乳酰乳酸钠：1.5%；

椰油酰胺丙基甜菜碱：9%；

甲基椰油酰基牛磺酸钠：5%

羟乙基二磷酸：0.1%；

香精0.6%；

去离子水：余量。

制备方法为：乳化锅清洗干净，称取所需重量的原料，备用；羟丙基纤维素和去离子水加入到乳化锅中，继续保温80℃搅拌30分钟至完全透明；将十二酸、十四酸、羟苯甲酯、羟苯丙酯、氢氧化钾加入乳化锅中完全反应形成透明粘稠状液体；继续加入丙二醇、乙二胺四乙酸二钠、椰油酰胺、乙二醇二硬脂酸酯、异硬脂酰乳酰乳酸钠至乳化锅中，保温80℃搅拌约30分钟至完全溶解无颗粒物；降温到60℃加入椰油酰胺丙基甜菜碱、甲基椰油酰基牛磺酸钠，搅拌30分钟至完全溶解；冷却至40℃时加入羟乙基二磷酸，香精，搅拌均匀，待温度降至常温即得。

实施例八：

百里香酚：0.1%；

水杨酸：0.5%；

植物提取物：1%；

乙醇：0.2%；

丙二醇：3.5%；

赤藓醇：0.3%；

月桂酸：2%；

肉豆蔻酸：9%；

棕榈酸：2%；

氢氧化钾：3.4%；

乙二醇二硬脂酸酯：1%；

磺基琥珀酸二乙基己酯钠：1%；

椰油酰胺丙基甜菜碱：7%；

椰油酰甘氨酸钠：1%；

聚季铵盐-7：0.1%；

聚甘油脂肪酸酯组合物：1.2%（其中聚甘油-6辛酸酯：0.6%、聚甘油-4葵酸酯：0.36%、聚甘油-3椰油酸酯：0.24%）；

香精：0.2%；

羟乙基二磷酸：0.4%；

去离子水：余量。

制备方法为：

步骤一，将百里香酚、水杨酸加入乙醇中溶解至透明，再加入植物提取物、丙二醇搅拌至完全透明，制备成抗菌组合物，备用；

步骤二，向组分总重量45%的去离子水中加入氢氧化钾溶解并搅拌均匀，然后加入月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸，持续搅拌加热到75℃，保温中和反应60min；

步骤三，反应完成后，加入乙二醇二硬脂酸、磺基琥珀酸二乙基己酯钠、椰油酰胺丙基甜菜碱、聚甘油脂肪酸酯组合物，并搅拌均匀；

步骤四，体系降温至55℃，加入椰油酰甘氨酸钠、聚季铵盐-7，并搅拌均匀；

步骤五，体系降温至35℃，然后向体系中加入赤藓醇、乙二胺四乙酸四钠、氯化钠、柠檬酸、香精，搅拌至完全溶解；

步骤六，加入步骤一的抗菌组合物，搅拌均匀，最后加入羟乙基二磷酸和水，搅拌均匀即可。

通过沐浴露质变检测仪对本发明所述的羟乙基二磷酸的皂基沐浴露的防腐效果进行了验证，通过将实施例一至八得到的皂基沐浴露产品分别取10mL放入沐浴露质变检测仪中进行质变率检测，分别记为皂基沐浴露实验组1～8，以加入时沐浴露的体系内的各项参数为基准进行质变检测，30天和60天后的质变率分别在0.005～0.007%和0.011～0.016%之间，各项检测结果如下表所示：

下面通过试验对本发明所述的添加羟乙基二磷酸的皂基沐浴露的抑菌效果进行了验证，试验中所用的羟乙基二磷酸可自行精炼制备得到，也可直接从市面上进行购置，来源广泛、价格适中；

实验目的：验证添加羟乙基二磷酸的皂基沐浴露对大肠杆菌、变形链球菌、结核杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌性能。

1.实验材料与方法

1.1材料

1.1.1实验样本

沐浴露产品（取实施例一至八中的沐浴露产品），羟乙基二磷酸（又名羟基乙叉二磷酸、依替磷酸）。

1.1.2试剂与仪器

厌氧培养箱（美国GeneScience，E500），细菌恒温培养箱（上海昕仪，XY-DR-360），生物安全柜（上海利康，HFsafe-1200A2），全波长酶标仪（瑞士TECAN，Infinite 200 Pro），荧光显微镜（奥林巴斯，BX53），可调式移液枪（梅特勒，XLS+），电子天平（德国赛多利斯，BT25S）；牛心脑肉汤培养基（北京华越洋，GU9-2814），布氏肉汤培养基（北京索莱宝，LA3560），LB培养基（北京索莱宝，L1010），氯化血红素（北京索莱宝，H8130），WST-8试剂盒（日本同仁，M439），微生物活性荧光染色试剂盒（美国赛默，L7012）。

1.1.3供试病原菌菌株

大肠杆菌、变形链球菌、结核杆菌和金黄色葡萄球菌。

1.2实验方法：

1.2.1培养基的配置：

配置LB培养基用于大肠杆菌的培养：LB培养基粉末加蒸馏水配成2.5%浓度，高压蒸汽121℃灭菌25分钟后，置于超净台内冷却，备用。对应琼脂板制备加入1.5%琼脂，冷却至50℃倒板，备用。

配置BHI培养基用于变形链球菌的培养：牛心脑浸液培养基粉末，加蒸馏水配成3.7%浓度，高压蒸汽121℃灭菌25分钟后，置于超净台内冷却，备用。对应琼脂板制备加入1.5%琼脂，冷却至50℃倒板，备用。

配置布氏培养基用于结核杆菌的培养：首先将2.4g KHPO、0.6g柠檬酸镁、0.24gMgSO7HO、3.6g天门冬素、12mL丙三醇和600mL蒸馏水加热溶解，121℃下灭菌20min制备成基础液；而后将2.0g孔雀绿染料和100mL无菌蒸馏水在37℃下在温箱内放置1-2小时助溶制备得到孔雀绿溶液；然后将新鲜鸡蛋用洗洁精刷洗干净后于75%乙醇中浸泡30min，晾干后使用，以无菌操作方式制备匀化全卵液，并用双层以上无菌纱布过滤出去不能匀化的膜状物完成全卵液的匀化；最后在无菌条件下将基础液、孔雀绿溶液和匀化的全卵也充分混匀，混匀后静置30-60min，然后分装在无菌螺旋盖培养瓶内，分装结束后15分钟内凝固，备用。

配置BHI培养基用于金黄色葡萄球菌的培养：牛心脑浸液培养基粉末，加蒸馏水配成3.7%浓度，高压蒸汽121℃灭菌25分钟后，置于超净台内冷却，备用。对应琼脂板制备加入1.5%琼脂，冷却至50℃倒板，备用。

1.2.2菌株复苏与培养

大肠杆菌复苏：将大肠杆菌冻干菌接种于LB琼脂平板上，在37℃细菌恒温培养箱中（含5% CO2）培养24小时。

大肠杆菌培养：挑已复苏的大肠埃希菌菌株接种于LB液体培养基中培养24小时，采用麦氏比浊法用PBS，配成细菌混悬液(108CFU/mL)，备用。

变形链球菌复苏：将变形链球菌冻干菌株接种于BHI琼脂平板上，在37℃细菌恒温培养箱中（含5% CO2）培养24小时。

变形链球菌培养：挑已复苏的变形链球菌菌株接种于BHI液体培养基中培养24小时，采用麦氏比浊法用PBS，配成细菌混悬液(108CFU/mL)，备用。

结核杆菌复苏：将结核杆菌冻干菌株接种于布氏培养基平板上，在37℃细菌恒温培养箱中（含5% CO2）培养24小时。

结核杆菌培养：挑已复苏的结核杆菌菌株接种于布氏液体培养基中培养24小时，采用麦氏比浊法用PBS，配成细菌混悬液（108CFU/mL），备用。

金黄色葡萄球菌复苏：将金黄色葡萄球菌冻干菌株接种于LB琼脂平板上，在37℃细菌恒温培养箱中（含5% CO2）培养24小时。

金黄色葡萄球菌培养：挑已复苏的金黄色葡萄球菌菌株接种于LB液体培养基中培养24小时，采用麦氏比浊法用PBS，配成细菌混悬液(108CFU/mL)，备用。

1.2.3实验分组

精确称量0.20g羟乙基二磷酸，将羟乙基二磷酸用浓度为20%的氢氧化钾溶液中和至pH值为8.5～10.0的溶液，超声分散于100mL的4种待测细菌对应的培养基，取2mL该溶液，加入2μL待测细菌混悬液，记为羟乙基二磷酸实验组（药物终浓度为：0.004%羟乙基二磷）；分别精确称量相当于0.20g羟乙基二磷酸的8种沐浴露产品，超声分散于100mL的4种待测细菌对应的培养基，取2mL该溶液，加入2μL待测细菌混悬液，记为实验组1至8（药物终浓度为：0.004%羟乙基二磷酸）；取2mL待测细菌对应的培养基，加入2μL待测细菌混悬液，记为阳性对照；取2mL待测细菌对应的培养基作为阴性对照。实验分组如表1。实验在33孔板内进行，每组设置3个平行样本。

表1 添加羟乙基二磷酸的皂基沐浴露对细菌敏感试验实验分组情况

组别	培养基（mL）	羟乙基二磷酸（mL）	细菌悬液（μL）	羟乙基二磷酸终浓度
					阳性对照	2.00	0	2.00	0
阳性对照	2.00	0	0	0
					羟乙基二磷酸实验组	0	2.00	2.00	0.004%羟乙基二磷酸
添加羟乙基二磷酸的皂基沐浴露的实验组1至8	0	2.00	2.00	0.004%羟乙基二磷酸

1.2.4抗菌性能检测：

各实验组分别在对应培养条件下培养24和48小时，采用WST-8试剂盒测试各组样本抗菌性能：各实验组培养既定时间后，各组取3个样本，每个样本0.15mL，加至132孔板，随后132孔板每孔分别加入15μL WST-8试剂，混匀后于37℃下孵育1h后，利用全波长酶标仪测量OD450nm。抗菌率计算公式如下：

抗菌率=（OD阳性对照-OD实验组）/(OD阳性对照-OD阴性对照)×100%

其中，OD阳性对照为阳性对照组待测液的吸光度值，OD实验组为各实验组待测液对应的吸光度值，OD阴性对照为阴性对照组对应的待测液的吸光度值。本实验取抗菌率＞95%具有抗菌效果，抗菌率大于80%具有抑菌效果。

为进一步证实抗菌效果，采用L7012染色试剂盒对各分组的表面的菌斑生物膜及死活细菌进行了染色，使用FV3000激光共聚焦显微镜观察细菌的生存状态及菌斑生物膜的附着情况。具体操作如下：取无菌玻片置于无菌33孔板中，加入0.22μm 滤器过滤除菌的人工汗液包被12小时，随后如表1加样，培养12小时后吸弃菌液，以无菌PBS轻洗玻片表面，每孔加入1ml L7012染料后避光冷藏染色15分钟，轻洗后置于荧光显微镜下观察并随机选择视野拍照，其中荧光绿染部分为活菌，荧光红染部分为死菌。

1.2.5统计学方法

使用SPSS 21.0软件进行数据处理，采用单因素方差分析，取P＜0.05具有统计学意义。

2.实验结果

2.1添加羟乙基二磷酸的皂基沐浴露处理及不同处理时间对不同细菌的抑菌效果

2.1.1 WST-8测试各分组抑菌效率

将各组108CFU/mL的菌液使用对应含药培养基稀释1000倍后培养24h及48h。抑菌效果如下：

大肠杆菌培养24h后，羟乙基二磷酸实验组抑菌率为91.59%、添加羟乙基二磷酸的皂基沐浴露实验组1至8抑菌率在90.52%~94.47%之间。培养48h后，羟乙基二磷酸实验组抑菌率为87.75%，添加羟乙基二磷酸的皂基沐浴露实验组1至8抑菌率在90.75%~96.55%之间。变形链球菌培养24h后，羟乙基二磷酸实验组抑菌率为94.75%、添加羟乙基二磷酸的皂基沐浴露实验组1至8抑菌率在92.02%~96.92%之间。培养48h后，羟乙基二磷酸实验组抑菌率为96.67%、添加羟乙基二磷酸的皂基沐浴露实验组1至8抑菌率在89.71%~98.37%之间。结核杆菌培养24h后，羟乙基二磷酸实验组抑菌率为89.51%、添加羟乙基二磷酸的皂基沐浴露实验组1至8抑菌率在89.18%~94.68%之间。培养48h后，羟乙基二磷酸实验组抑菌率为92.46%、添加羟乙基二磷酸的皂基沐浴露实验组1至8抑菌率在89.61%~98.31%之间。金黄色葡萄球菌培养24h后，羟乙基二磷酸实验组抑菌率为94.74%、添加羟乙基二磷酸的皂基沐浴露实验组1至8抑菌率在89.12%~95.86%之间。培养48h后，羟乙基二磷酸实验组抑菌率为92.45%、添加羟乙基二磷酸的皂基沐浴露实验组1至8抑菌率在90.36%~95.28%之间。

综上数据，羟乙基二磷酸实验组、添加羟乙基二磷酸的皂基沐浴露实验组将见统计学差异（P＜0.05），各含有羟乙基二磷酸的分组表现优异的抗菌效果，而空白对照组沐浴露未见抑菌趋势。添加羟乙基二磷酸的皂基沐浴露实验组抑菌效果较羟乙基二磷酸实验组有更佳的抑菌趋势，添加羟乙基二磷酸的皂基沐浴露实验组抑菌效果亦优于羟乙基二磷酸实验组，但差异无明显统计学意义（P＞0.05）。

表2 WST-8测试各分组抑菌效率结果

2.1.2 微生物活性荧光染色试剂盒染色结果

微生物活性荧光染色试剂盒染色结果发现，各细菌阳性对照组样本表面见大量绿色荧光，即有大量活菌存在。不同细菌对应的羟乙基二磷酸实验组与添加羟乙基二磷酸的皂基沐浴露实验组样本表面见大面积红色荧光与少量绿色荧光，即大量细菌被杀灭。综合上述分析表明，羟乙基二磷酸实验组、添加羟乙基二磷酸的皂基沐浴露成分抑菌效果显著。本部分结果与先前实验结果吻合。

试验结论：

1、实验结果证明添加羟乙基二磷酸的皂基沐浴露，对大肠杆菌、变形链球菌、结核杆菌和金黄色葡萄球菌均具有显著的抗菌效果，且与羟乙基二磷酸实验组效果相当，明显优于对照组。

2、实验结果证明添加羟乙基二磷酸的皂基沐浴露，能迅速抗菌，且抗菌时间长达48小时。

以上所述仅为本发明的优选实施方式，只要以基本相同手段实现本发明目的的技术方案都属于本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.羟乙基二磷酸在皂基沐浴露中的应用，其特征在于，皂基沐浴露制备原料中包括有羟乙基二磷酸。

2.根据权利要求1所述的羟乙基二磷酸在皂基沐浴露中的应用，其特征在于，所述羟乙基二磷酸在皂基沐浴露中的添加量为重量百分比0.05～0.4%。

3.根据权利要求2所述的羟乙基二磷酸在皂基沐浴露中的应用，其特征在于，所述皂基沐浴露制备原料中不包括防腐剂。