CN111296329A - 一种斑马鱼痛觉记忆及成瘾行为实验装置及其方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种斑马鱼痛觉记忆及成瘾行为实验装置及其方法，夹板设置在鱼缸壁上，夹板的上端设置有自动弹缩装置，自动弹缩装置通过钛合金丝连接有用于训练斑马鱼形成摄食行为‑痛觉记忆的摄食行为‑痛觉记忆模块，摄食行为‑痛觉记忆模块与夹板上设置的成瘾行为模块连接，用于评价斑马鱼成瘾相关行为，夹板的下方设置有视频采集装置和能够进行四色切换的LED灯板，视频采集装置用于采集实验区域的斑马鱼行为轨迹，通过控制电脑进行相关行为学变化及运动轨迹分析。本发明解决了目前在斑马鱼研究过程中对长期/短期记忆、工作记忆、思维转换能力和成瘾相关行为等高级认知功能评价方法不足的问题；为相关领域研究提供了有力的软硬件支撑。
Description
技术领域
本发明属于实验装置技术领域，具体涉及一种斑马鱼痛觉记忆及成瘾行为实验装置及其方法。
背景技术
斑马鱼是公认的良好的模式动物，但关于斑马鱼行为学研究的装置主要局限于视觉、听觉、嗅觉和简单运动能力的观察，对于高级认知功能如学习记忆能力等观察的装置较少。目前有Y迷宫、T迷宫等方法用以评价斑马鱼的位置偏好和社交行为，但尚未见有关斑马鱼痛觉记忆和成瘾行为研究的相关装置。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种斑马鱼痛觉记忆及成瘾行为实验装置及其方法，解决了现有技术无法完成对斑马鱼痛觉记忆及成瘾性行为研究的装置与方法问题。
本发明采用以下技术方案：
一种斑马鱼痛觉记忆及成瘾行为实验装置，其特征在于，包括夹板，夹板设置在鱼缸壁上，夹板的上端设置有自动弹缩装置，自动弹缩装置通过钛合金丝连接有用于训练斑马鱼形成摄食行为-痛觉记忆的摄食行为-痛觉记忆模块，摄食行为-痛觉记忆模块与夹板上设置的成瘾行为模块连接，用于评价斑马鱼成瘾相关行为，夹板的下方设置有视频采集装置和能够进行四色切换的LED灯板，视频采集装置用于采集实验区域的斑马鱼行为轨迹，通过控制电脑进行相关行为学变化及运动轨迹分析。
具体的，摄食行为-痛觉记忆模块包括诱食鱼钩，诱食鱼钩通过尼龙线与自动弹缩装置上的高弹性钛合金丝连接，通过尼龙线的牵引力大小控制自动弹缩装置。
进一步的，诱食鱼钩入水段的周围设置有透明罩，透明罩上集成有能够独立控制的四色切换灯环和声信号发生器，四色切换灯环和声信号发生器沿透明罩上端周向设置，诱食鱼钩上设置有诱食饲料。
更进一步的，透明罩为喇叭型结构，与实验装置为一体式连接。
更进一步的，成瘾行为模块包括微量液体推进器和感应探头，微量液体推进器通过不锈钢管与透明罩底部设置的环形透析管连接，不锈钢管与电流发生器和传导电极连接，感应探头设置在透明罩内，同电流发生器和微量液体推进器一起与控制电脑连接。
本发明的另一个技术方案是，一种斑马鱼痛觉记忆及成瘾行为实验方法，采用权利要求1所述的斑马鱼痛觉记忆及成瘾行为实验装置，包括以下步骤：
S1、依据斑马鱼对食物摄入的需求，在斑马鱼进行摄食行为过程中加入诱食鱼钩刺入上颚的痛觉信号，观察斑马鱼对于摄食-疼痛记忆的关联能力，在进行8～10次训练后，斑马鱼形成摄食行为-痛觉记忆，斑马鱼在形成摄食行为-痛觉记忆后，通过继续投喂不包含鱼钩的的其他形态与味道诱食饲料即可实现已形成记忆的消除；
S2、在完成斑马鱼原有痛觉记忆消除后，利用LED灯板及透明罩LED灯环进行复杂摄食行为-痛觉记忆训练；
S3、在斑马鱼形成复杂摄食行为-痛觉记忆后，通过每个LED灯环的颜色与声音信号进行逆向复杂摄食行为-痛觉记忆训练；
S4、斑马鱼对成瘾性物质产生依赖性并主动摄取的行为，观察斑马鱼成瘾相关行为。
具体的，步骤S1中，每次痛觉刺激过程均进行视频采集与分析，采集诱食饲料入水后斑马鱼游向诱食饲料的时间、斑马鱼进入目的区域到吸入诱食饲料的潜伏期、斑马鱼在目的区域围绕诱食饲料游动的时间及斑马鱼游向诱食饲料后的转身时间，用于评价斑马鱼摄食行为-痛觉记忆功能。
具体的，步骤S2中，每次诱食饲料入水伴随有LED灯板不同颜色光和/或声音信号，斑马鱼受饥饿影响继续发生摄食行为，通过设置至少两组不同的信号组合，并随机选择一组信号作为无鱼钩投喂的安全信号，经过训练后，斑马鱼将在安全信号发出后发生摄食行为，形成复杂摄食行为-痛觉记忆；当斑马鱼掌握光和/或声音信号与痛觉刺激的联系后，可以进一步通过四色灯环提高训练难度，即每次投喂诱食饲料后，除发出安全信号的透明罩外，其他三个非安全信号的透明罩内均为含有诱食鱼钩的诱食饲料，并且每次不含诱食鱼钩的安全信号在四个透明罩之间随机切换，经过训练，斑马鱼将只摄食安全信号透明罩内的诱食饲料；实验过程均进行视频采集与分析，采集鱼钩饲料入水后斑马鱼在不同信号刺激后游向安全信号透明罩区域的潜伏期、斑马鱼连续5次正确进入目的区域之前的训练次数、斑马鱼进入目的区域到吸入诱食饲料完成摄食的潜伏期、斑马鱼在目的区域围绕诱食饲料游动的时间及斑马鱼游向诱食饲料后的转身时间等，用于对斑马鱼复杂摄食行为-痛觉记忆形成能力的评价。
具体的，步骤S3中，每次诱食饲料入水伴随有不同颜色LED灯环和/或声音信号，斑马鱼在形成复杂摄食-痛觉记忆后，将对安全信号透明罩内的诱食饲料发生摄食行为，通过随机选择与之前安全信号不同的组合作为新安全信号，经过训练后，斑马鱼将对新安全信号透明罩内的诱食饲料发生摄食行为，形成逆向复杂摄食行为-痛觉记忆；实验过程均进行视频采集与分析，采集诱食饲料入水后斑马鱼游向原有安全信号透明罩内的潜伏期、继续摄食原有安全信号透明罩内诱食饲料的次数、尝试进入其他信号透明罩内的潜伏期、进入其他透明罩内区域后进行摄食的潜伏期、在成功摄食新安全信号透明罩内诱食饲料后再次游向新安全信号透明罩区域的潜伏期及发生摄食行为的潜伏期，用于对斑马鱼逆向摄食行为-痛觉记忆形成能力的评价。
具体的，步骤S4中，LED灯板和/或声音发生装置首先通过与成瘾性物质的释放建立关系，训练斑马鱼利用释放信号获得成瘾性物质；在斑马鱼掌握释放信号与成瘾性物质的关系后，以具有独立控制的LED灯环和/或声音为释放信号，随机选择某一组合作为成瘾物质释放信号，发生释放信号的透明罩内释放成瘾物质，其他干扰信号组合不释放成瘾物质，当斑马鱼没有按照时间间隔或错误进入非释放信号透明罩区域后，装置将在较长时间内停止发生释放信号和释放成瘾物质，并给予电击惩罚；以斑马鱼连续5次按释放信号正确进入目的区域的训练次数、释放信号发出后斑马鱼游向目的透明罩的潜伏期作为成瘾行为形成的判定数据；
通过分配LED灯板和/或声音信号与成瘾性物质释放的关系，斑马鱼在某一特定信号发出后的5s内，将在所有透明罩下方区域获得成瘾性物质；经过练习后，斑马鱼将在特定信号发出后，迅速进入透明罩下方区域；为获得更理想的训练效果，建议同时选择两个装置分别安装在实验鱼缸的相对两侧；以特定信号发出后斑马鱼游向透明罩的潜伏期及在特定信号发出后连续正确的选择游动方向为其成瘾行为相关记忆形成的判定依据；
通过启用随机信号触发模式，成瘾物质将随机在某一个透明罩区域内释放，斑马鱼可能在任意一个透明罩下方启动释放信号，成瘾物质将在释放信号发出5s后停止释放，灯环颜色和声音信号也将在5s后停止，此后，当鱼进入其他任意三个灯环区域内将再次触发信号，当触发非释放信号时，透明罩内不释放成瘾物质，信号将在斑马鱼离开此区域后停止，当触发释放信号时，实验设定同前；当斑马鱼在释放信号停止前进入其他区域，其他透明罩不产生释放/非释放信号也不释放成瘾物质，并且在30s后所有区域才重新启动，为更好的达到训练效果，研究者可以根据实验需求，设定在斑马鱼提前进入其他区域后给予低强度电击；斑马鱼在释放信号停止后进入其他区域，将继续引发其他透明罩发出释放/非释放信号；经过练习后，斑马鱼表现为有时间间隔的搜索其他透明罩区域，形成复杂自发成瘾行为，以斑马鱼提前进入其他区域次数，首次开始按时间间隔搜索其他透明罩区域的训练次数为判定依据。
与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：
本发明一种斑马鱼痛觉记忆及成瘾行为实验装置，装置的夹板可以适用于大多数斑马鱼饲养缸，并且集成所有的实验干预及记录装置，更加易于安装；装置的四个单元模块既可以同时工作以实现简单的测试，也可以通过电脑程序控制选择随机开启或触发开启模式，完成复杂的认知功能和成瘾行为的评价；在本装置的基本原理基础上，研究者可以依据实验需要创新实验方法，同时在同一鱼缸内展开2-4个装置，安装于鱼缸各个缸壁，或者编程新的测试流程并选择新的评价指标，或依据诱食饲料的味道开展相关研究等；装置除解除鱼嘴内的鱼钩和加注成瘾物质外，所有信号的发生及装置的运行均通过电脑或自动化装置控制，有效简化了操作步骤和操作难度。
进一步的，摄食行为-痛觉记忆模块可以完成对斑马鱼短期/长期记忆、空间记忆、思维转换能力等高级认知功能的评价。其中诱食鱼钩为0.5号无倒刺袖钩，在诱发痛觉刺激的同时不会对鱼嘴造成严重损伤；装配有高弹性钛合金丝的自动弹缩装置由牵引力启发，进一步确保斑马鱼在吸入诱食饲料后，诱食鱼钩能够刺入鱼嘴；同时，钛合金丝弹力自根部至尖端逐渐减少的力学结构能够防止斑马鱼在被鱼钩牵引后因过度拉扯尼龙线而造成缠绕等意外损伤；同时，喇叭形透明罩对被鱼钩牵引的斑马鱼具有进一步的保护左右，防止因其用力挣扎而触发周围鱼钩弹缩，造成自身和其他斑马鱼的损伤。
进一步的，透明罩上端装配的4色切换LED灯环和声音信号发生器可供研究人员根据实验目的编程实验流程，并且保证光/声音信号在透明罩区域内发出；同时，透明罩还集成有感应探头，当斑马鱼进入透明罩区域内后，将启动透明罩底部的环形透析管并释放成瘾物质，并且能够减少由于鱼缸内的循环系统运行而引起的药物洗脱，保证透明罩区域内的药物浓度；最后，透明罩的边缘也是评价斑马鱼成瘾行为的视频分析参考范围，使研究人员更易于划分相应区域。
进一步的，成瘾行为模块根据斑马鱼对成瘾性物质的趋向性，建立了通过触发特定光/声音信号而释放成瘾性物质的主动成瘾行为评价体系，实现了对模式动物斑马鱼的主动成瘾相关行为的评价，为相关药物研发、成瘾机制研究和成瘾相关脑功能研究提供良好的实验装置。感应探头在感应到斑马鱼进入透明罩区域后将启动光/声音信号和释放成瘾物质；环形透析管能够保证成瘾物质持续快速的释放入透明罩范围内的水域；水中的传导电极和不锈钢管构成水中电极，可以在区域内施加能够调节强度的电击刺激，提高训练效果，缩短训练周期。
一种斑马鱼痛觉记忆及成瘾行为实验方法，在痛觉记忆评价过程中，以斑马鱼摄食需求为基础，有效解决了鱼类生物的实验依从性问题，为后续研究方法制定和评价指标选择提供了可持续的方法学基础；通过引入鱼钩刺入上颚产生的痛觉感受并结合实验过程中加入的LED灯板颜色、LED灯环颜色、声音及电击等刺激，对斑马鱼的短期/长期记忆、工作记忆、思维转换能力等高级脑功能和成瘾行为相关机制与相关脑功能改变进行评价。
进一步的，通过单纯引入诱食鱼钩产生的痛觉刺激，研究人员将能够实现对斑马鱼摄食行为-痛觉记忆的评价，该评价是相对简单的认知行为，经过8-10次的训练即可接近训练效果；本阶段测试以斑马鱼摄食需求为基础，避免了因痛觉刺激产生的实验依从性降低的问题，而斑马鱼在形成摄食行为-痛觉记忆后，通过继续投喂不包含诱食鱼钩的其他形态与味道的诱食饲料即可实现相应记忆的消除。
进一步的，在对斑马鱼第一阶段的记忆进行初步消除后，通过引入LED灯板灯光和/或声音信号，可以实现对斑马鱼复杂摄食行为-痛觉记忆即工作记忆的评价，在该阶段测试中，经过反复训练，斑马鱼需要掌握区分灯光/声音信号的能力；在斑马鱼掌握安全摄食信号后，本实验装置能够进一步提高测试难度，将安全摄食信号转移至透明罩上的灯环，只有发出安全摄食信号的透明罩内不设有鱼钩，并且每次投喂过程中，安全摄食信号的灯环是随机切换的，可以进一步筛查认知功能损伤不显著的实验分组，有效提高评价的准确性和特异性。
进一步的，在斑马鱼掌握灯光/声音信号与痛觉刺激的联系之后，研究人员可以进一步提高测试难度，观察斑马鱼的思维转换能力，通过改变原有安全摄食信号的颜色，斑马鱼将很快掌握新的安全信号。
进一步的，能够观察斑马鱼的成瘾行为，根据斑马鱼对成瘾性物质产生依赖性并主动摄取的行为，在实验鱼缸相对的缸壁同时安装两个实验装置，通过观察斑马鱼连续正确的选择在特定信号发出后进入透明罩区域内的次数评价斑马鱼成瘾行为相关的学习记忆功能；在斑马鱼掌握LED灯光颜色/声音信号与成瘾物质的联系后，通过设定在斑马鱼触发某一特定光/声音的灯环后能够引起成瘾物质释放，研究人员能够进一步观察斑马鱼主动成瘾行为；本方法中设定当斑马鱼错误地进入其他灯环后将引起成瘾物质释放延迟和/或在提前进入其他区域后释放电击刺激的策略将有效提高训练的成功率，缩短训练周期。
综上所述，本发明提供了一种评价模式动物斑马鱼学习记忆和成瘾行为等高级认知功能的实验装置，解决了目前在斑马鱼研究过程中对长期/短期记忆、工作记忆、思维转换能力和成瘾相关行为等高级认知功能评价方法不足的问题；本实验装置配套有相关模块的评价方法与评价指标，为相关领域研究提供了有力的软硬件支撑。
下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
附图说明
图1为本发明结构示意图；
图2为本发明摄食行为-痛觉记忆模块示意图；
图3为本发明识别区域示意图。
其中：1.诱食鱼钩；2.尼龙线；3.钛合金丝；4.透明罩；5.微量液体推进器；6.不锈钢管；7.透析管；8.声信号发生器；9.LED灯板；10.夹板；11.自动弹缩装置；12.诱食饲料；13.视频采集装置；14.传导电极；15.电流发生器；16.感应探头；17.四色切换灯环；18.第一识别区；19.第二识别区；20.第三识别区。
具体实施方式
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“中心”、“纵向”、“横向”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”、“一侧”、“一端”、“一边”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
请参阅图1，本发明一种斑马鱼痛觉记忆及成瘾行为实验装置，包括夹板10、摄食行为-痛觉记忆模块和成瘾行为模块。
夹板10固定设置在鱼缸壁上，夹板10的上部设置有自动弹缩装置11，自动弹缩装置11通过钛合金丝3与摄食行为-痛觉记忆模块连接，用于评价斑马鱼成瘾相关行为；成瘾行为模块设置在夹板10上，用于训练斑马鱼形成成瘾行为-痛觉记忆，夹板10的下方设置有能够进行四色切换的LED灯板9和视频采集装置13，用于采集实验区域的斑马鱼行为轨迹，进行相关行为学变化及运动轨迹分析。
请参阅图2，摄食行为-痛觉记忆模块包括4个独立控制且具有自动弹缩功能的诱食鱼钩1，诱食鱼钩1通过尼龙线2分别与固定于自动弹缩装置11上的高弹性钛合金丝3连接，自动弹缩装置11由尼龙线2远端的牵引力大小控制。
诱食鱼钩1入水段的周围设置有喇叭型结构的透明罩4，透明罩4与实验装置为一体式结构，透明罩4上集成有能够独立控制的四色切换灯环和声信号发生器8，四色切换灯环和声信号发生器8沿透明罩4上端周向设置，诱食鱼钩1上设置有诱食饲料12，为避免斑马鱼对诱食饲料的形状或味道产生记忆，诱食饲料12可以根据试验需要采用不同形态与味道。
LED灯板9和四色切换灯环17分别对应不同的训练模式，当启用LED灯板9时，四个透明罩内的各种信号与效应同时发出，当启用四色切换灯环17时，每个透明罩内的信号与效应单独发出；LED灯板9应用于基础训练，四色切换LED灯环则用于进一步行为学评价。
成瘾行为模块包括4个独立控制的微量液体推进器5、传导电极14、电流发生器15和感应探头16，微量液体推进器5通过不锈钢管6与透明罩4底部设置的环形透析管7连接，感应探头16设置在对应的透明罩4内；电流发生器15与传导电极14和不锈钢管6相连，传导电极14与不锈钢管6在水下构成水中电极，当电流发生器15发出电流后，将引起所在透明罩4区域内发生电击刺激。
声信号发生器8、LED灯板9、四色切换灯环、微量液体推进器5、电流发生器15和和感应探头16均与控制电脑连接，声信号、LED灯颜色、四色切换灯环颜色、电流强度以及微量液体推进量均通过电脑程序控制，自动弹缩装置11由尼龙线2远端的牵引力大小控制，实验区域的斑马鱼行为轨迹由底部设置的视频采集装置13采集，相关行为学变化及运动轨迹由电脑软件进行分析。
本发明一种斑马鱼痛觉记忆及成瘾行为实验方法，包括以下步骤：
摄食行为-痛觉记忆
S1、在摄食行为-痛觉记忆模块中，依据鱼类对食物摄入的需求，在进行摄食行为过程中加入诱食鱼钩1刺入上颚时产生的痛觉信号，观察其对于摄食-疼痛记忆的关联能力，在进行8～10次训练后，斑马鱼对诱食鱼钩1上的诱食饲料12不再进行摄食或表现为高度警觉性，说明其摄食行为-痛觉记忆形成；通过持续投喂不含诱食鱼钩1的其他形态与味道的诱食饲料12直至斑马鱼对后续投喂不再产生警觉性，即完成原有痛觉记忆的消除过程，可以进行后续实验。
每次痛觉刺激过程均进行视频采集与分析，主要采集诱食饲料12入水后斑马鱼游向诱食饲料12的时间、斑马鱼进入目的区域到吸入诱食饲料12的潜伏期、斑马鱼在目的区域围绕诱食饲料12游动的时间及斑马鱼游向诱食饲料12后的转身时间等，以上数据用于评价斑马鱼痛觉记忆水平。
S2、在斑马鱼形成痛觉记忆后，利用四色切换的LED灯板9和灯环17进行摄食行为-痛觉记忆训练；
斑马鱼在饥饿预处理后，放入实验装置所在鱼缸；每次诱食饲料12入水伴随有不同LED灯板9颜色和/或声音信号，斑马鱼由于受到饥饿的影响，将继续发生摄食行为。实验者可以通过设置几组不同的信号组合，并随机选择一组作为无诱食鱼钩1投喂的安全信号，经过训练后，斑马鱼将只对安全信号发生摄食行为，说明其复杂摄食行为-痛觉记忆形成；进一步的，实验者可以采用四色切换灯环17继续观察，每次投喂过程中随机选择某一个透明罩4发出安全信号，其他三个透明罩4为含有诱食鱼钩1的诱食饲料12，通过训练，斑马鱼将只选择安全信号透明罩4内的诱食饲料12。
实验过程均进行视频采集与分析，主要采集诱食饲料12入水后斑马鱼在不同信号刺激后游向诱食饲料12的潜伏期、斑马鱼进入目的区域到吸入诱食饲料12的潜伏期、斑马鱼在目的区域围绕诱食饲料12游动的时间、斑马鱼游向诱食饲料12后的转身时间及斑马鱼连续5次正确的选择安全信号透明罩4内诱食饲料12的训练次数等，以上数据用于斑马鱼复杂摄食行为-痛觉记忆形成能力的评价。
S3、在斑马鱼形成复杂摄食行为-痛觉记忆后，通过每个LED灯环的颜色与声音信号进行逆向复杂摄食行为-痛觉记忆训练。
斑马鱼在饥饿预处理后，放入实验装置所在鱼缸。每次诱食饲料12入水伴随有两种或两种以上不同颜色LED灯环和/或声音信号，斑马鱼在形成复杂摄食-痛觉记忆后，将对原有安全信号透明罩4内诱食饲料12发生摄食行为。实验者选择与之前信号不同的组合作为新安全信号，经过训练后，斑马鱼将对新的安全信号发生摄食行为，说明其逆向复杂摄食行为-痛觉记忆形成。
实验过程均进行视频采集与分析，主要采集诱食饲料12入水后斑马鱼继续摄食原安全信号透明罩4内诱食饲料12的次数、尝试进入其他信号透明罩4区域的潜伏期、进入新信号目的区域后进行摄食的潜伏期、在新安全信号发出后游向目的区域的潜伏期及发生摄食行为的潜伏期等，以上数据用于对斑马鱼逆向摄食行为-痛觉记忆形成能力的评价。
成瘾相关行为评价
S4、在成瘾相关行为评价中，本装置依据鱼类对阿片等类物质可能的成瘾性，观察其成瘾行为相关的记忆功能与主动成瘾行为。
本评价方法建议选择两套装置同时进行实验，分别安装于鱼缸壁相对两侧。方法将首先评价斑马鱼成瘾行为相关记忆功能，实验者选择一组LED灯板9颜色和/或声音信号作为成瘾物质的释放信号，在释放信号发出后5s内，所有透明罩4下发区域将释放成瘾物质，经过10s空白期后开始下一次释放，两侧装置随机依次发出信号。当斑马鱼建立成瘾相关行为的记忆后，将在释放信号发出后迅速进入透明罩4下方。以其开始连续5次正确进入透明罩4下方区域前所用的训练次数和在信号发出后转向目的区域的潜伏期等作为其建立成瘾行为相关记忆的评价指标；
在斑马鱼主动成瘾行为评价方法中，感应探头16感知斑马鱼进入任一透明罩4下方区域后将触发透明罩4产生随机的LED灯环17和/或声音信号(随机信号种类越少，训练时间越短)，当触发释放信号后，环形透析管7将释放成瘾物质，当触发非释放信号后，将不引起任何反应，成瘾物质将在释放信号发出5s后停止释放，LED灯环17颜色和声音信号也将在5s后停止，此后，当鱼进入其他任意三个透明罩4区域内将再次触发信号，当触发非释放信号时，透明罩4内不释放成瘾物质，信号将在斑马鱼进入其他区域后停止，直到成功触发释放信号；当斑马鱼在释放信号停止前进入其他区域后，其他透明罩4不产生释放/非释放信号也不释放成瘾物质，并且在30s后所有区域才重新启动，为更好的达到训练效果，研究者可以根据实验需求，设定在斑马鱼提前进入其他区域后给予低强度电击；斑马鱼在释放信号停止后进入其他区域，将继续引发其他透明罩4发出释放/非释放信号；经过练习后，斑马鱼表现为有时间间隔的搜索各透明罩4区域，形成复杂自发成瘾行为，以斑马鱼提前进入其他区域次数，进入非释放信号透明罩4区域后离开的潜伏期，首次开始按时间间隔搜索透明罩4的训练次数为判定依据。
请参阅图3，图像识别的区域从内至外依次包括第一识别区18、第二识别区19和第三识别区20，第一识别区18为图像识别后的诱食饲料区域，以诱食饲料为圆心，半径为1cm，当斑马鱼对诱食饲料具有强烈摄食欲望或探究欲望时，其头部将进入该区域，发生摄食行为或在该区域较长时间停留；第二识别区19为图像识别后的核心区域，以诱食饲料为圆心，半径为3cm，当斑马鱼对诱食饲料具有较高警觉性但仍保留探究欲望时，将停留在此区域内；第三识别区20为图像识别后的透明罩4区域，以诱食饲料为圆心，半径为5cm，作为斑马鱼进入透明罩4区域的判定标准。以上区域为进一步分析斑马鱼运动轨迹、行为特征和认知功能改变特性等提供影像学资料。
综上所述，本发明一种斑马鱼痛觉记忆及成瘾行为实验装置，针对现有研究装置对于斑马鱼高级脑功能评价方法的不足，提供能够观察斑马鱼短期/长期记忆、工作记忆、思维转换能力和成瘾相关行为等高级脑功能检测的装置和基本方法，为相关领域研究提供了有力的软硬件支撑。
以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种斑马鱼痛觉记忆及成瘾行为实验装置，其特征在于，包括夹板(10)，夹板(10)设置在鱼缸壁上，夹板(10)的上端设置有自动弹缩装置(11)，自动弹缩装置(11)通过钛合金丝(3)连接有用于训练斑马鱼形成摄食行为-痛觉记忆的摄食行为-痛觉记忆模块，摄食行为-痛觉记忆模块与夹板(10)上设置的成瘾行为模块连接，用于评价斑马鱼成瘾相关行为，夹板(10)的下方设置有视频采集装置(13)和能够进行四色切换的LED灯板(9)，视频采集装置(13)用于采集实验区域的斑马鱼行为轨迹，通过控制电脑进行相关行为学变化及运动轨迹分析。
2.根据权利要求1所述的斑马鱼痛觉记忆及成瘾行为实验装置，其特征在于，摄食行为-痛觉记忆模块包括诱食鱼钩(1)，诱食鱼钩(1)通过尼龙线(2)与自动弹缩装置(11)上的高弹性钛合金丝(3)连接，通过尼龙线(2)的牵引力大小控制自动弹缩装置(11)。
3.根据权利要求2所述的斑马鱼痛觉记忆及成瘾行为实验装置，其特征在于，诱食鱼钩(1)入水段的周围设置有透明罩(4)，透明罩(4)上集成有能够独立控制的四色切换灯环(17)和声信号发生器(8)，四色切换灯环(17)和声信号发生器(8)沿透明罩(4)上端周向设置，诱食鱼钩(1)上设置有诱食饲料(12)。
4.根据权利要求3所述的斑马鱼痛觉记忆及成瘾行为实验装置，其特征在于，透明罩(4)为喇叭型结构，与实验装置为一体式连接。
5.根据权利要求3所述的斑马鱼痛觉记忆及成瘾行为实验装置，其特征在于，成瘾行为模块包括微量液体推进器(5)和感应探头(16)，微量液体推进器(5)通过不锈钢管(6)与透明罩(4)底部设置的环形透析管(7)连接，不锈钢管(6)与电流发生器(15)和传导电极(14)连接，感应探头(16)设置在透明罩(4)内，同电流发生器(15)和微量液体推进器(5)一起与控制电脑连接。
6.一种斑马鱼痛觉记忆及成瘾行为实验方法，其特征在于，采用权利要求1所述的斑马鱼痛觉记忆及成瘾行为实验装置，包括以下步骤：
S1、依据斑马鱼对食物摄入的需求，在斑马鱼进行摄食行为过程中加入诱食鱼钩刺入上颚的痛觉信号，观察斑马鱼对于摄食-疼痛记忆的关联能力，在进行8～10次训练后，斑马鱼形成摄食行为-痛觉记忆，斑马鱼在形成摄食行为-痛觉记忆后，通过继续投喂不包含鱼钩的其他形态与味道的诱食饲料即可实现已形成记忆的消除；
S2、在完成斑马鱼原有痛觉记忆消除后，利用LED灯板及透明罩LED灯环进行复杂摄食行为-痛觉记忆训练；
S3、在斑马鱼形成复杂摄食行为-痛觉记忆后，通过每个LED灯环的颜色与声音信号进行逆向复杂摄食行为-痛觉记忆训练；
S4、斑马鱼对成瘾性物质产生依赖性并主动摄取的行为，观察斑马鱼成瘾相关行为。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤S1中，每次痛觉刺激过程均进行视频采集与分析，采集诱食饲料入水后斑马鱼游向诱食饲料的时间、斑马鱼进入目的区域到吸入诱食饲料的潜伏期、斑马鱼在目的区域围绕诱食饲料游动的时间及斑马鱼游向诱食饲料后的转身时间，用于评价斑马鱼摄食行为-痛觉记忆功能。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤S2中，每次诱食饲料入水伴随有LED灯板不同颜色光和/或声音信号，斑马鱼受饥饿影响继续发生摄食行为，通过设置至少两组不同的信号组合，并随机选择一组信号作为无鱼钩投喂的安全信号，经过训练后，斑马鱼将在安全信号发出后发生摄食行为，形成复杂摄食行为-痛觉记忆；当斑马鱼掌握光和/或声音信号与痛觉刺激的联系后，可以进一步通过四色灯环提高训练难度，即每次投喂诱食饲料后，除发出安全信号的透明罩外，其他三个非安全信号的透明罩内均为含有诱食鱼钩的诱食饲料，并且每次不含诱食鱼钩的安全信号在四个透明罩之间随机切换，经过训练，斑马鱼将只摄食安全信号透明罩内的诱食饲料；实验过程均进行视频采集与分析，采集鱼钩饲料入水后斑马鱼在不同信号刺激后游向安全信号透明罩区域的潜伏期、斑马鱼连续5次正确进入目的区域之前的训练次数、斑马鱼进入目的区域到吸入诱食饲料完成摄食的潜伏期、斑马鱼在目的区域围绕诱食饲料游动的时间及斑马鱼游向诱食饲料后的转身时间等，用于对斑马鱼复杂摄食行为-痛觉记忆形成能力的评价。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤S3中，每次诱食饲料入水伴随有不同颜色LED灯环和/或声音信号，斑马鱼在形成复杂摄食-痛觉记忆后，将对安全信号透明罩内的诱食饲料发生摄食行为，通过随机选择与之前安全信号不同的组合作为新安全信号，经过训练后，斑马鱼将对新安全信号透明罩内的诱食饲料发生摄食行为，形成逆向复杂摄食行为-痛觉记忆；实验过程均进行视频采集与分析，采集诱食饲料入水后斑马鱼游向原有安全信号透明罩内的潜伏期、继续摄食原有安全信号透明罩内诱食饲料的次数、尝试进入其他信号透明罩内的潜伏期、进入其他透明罩内区域后进行摄食的潜伏期、在成功摄食新安全信号透明罩内诱食饲料后再次游向新安全信号透明罩区域的潜伏期及发生摄食行为的潜伏期，用于对斑马鱼逆向摄食行为-痛觉记忆形成能力的评价。
10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤S4中，LED灯板和/或声音发生装置首先通过与成瘾性物质的释放建立关系，训练斑马鱼利用释放信号获得成瘾性物质；在斑马鱼掌握释放信号与成瘾性物质的关系后，以具有独立控制的LED灯环和/或声音为释放信号，随机选择某一组合作为成瘾物质释放信号，发生释放信号的透明罩内释放成瘾物质，其他干扰信号组合不释放成瘾物质，当斑马鱼没有按照时间间隔或错误进入非释放信号透明罩区域后，装置将在较长时间内停止发生释放信号和释放成瘾物质，并给予电击惩罚；以斑马鱼连续5次按释放信号正确进入目的区域的训练次数、释放信号发出后斑马鱼游向目的透明罩的潜伏期作为成瘾行为形成的判定数据；
通过分配LED灯板和/或声音信号与成瘾性物质释放的关系，斑马鱼在某一特定信号发出后的5s内，将在所有透明罩下方区域获得成瘾性物质；经过练习后，斑马鱼将在特定信号发出后，迅速进入透明罩下方区域；为获得更理想的训练效果，建议同时选择两个装置分别安装在实验鱼缸的相对两侧；以特定信号发出后斑马鱼游向透明罩的潜伏期及在特定信号发出后连续正确的选择游动方向为其成瘾行为相关记忆形成的判定依据；
通过启用随机信号触发模式，成瘾物质将随机在某一个透明罩区域内释放，斑马鱼可能在任意一个透明罩下方启动释放信号，成瘾物质将在释放信号发出5s后停止释放，灯环颜色和声音信号也将在5s后停止，此后，当鱼进入其他任意三个灯环区域内将再次触发信号，当触发非释放信号时，透明罩内不释放成瘾物质，信号将在斑马鱼离开此区域后停止，当触发释放信号时，实验设定同前；当斑马鱼在释放信号停止前进入其他区域，其他透明罩不产生释放/非释放信号也不释放成瘾物质，并且在30s后所有区域才重新启动，为更好的达到训练效果，研究者可以根据实验需求，设定在斑马鱼提前进入其他区域后给予低强度电击；斑马鱼在释放信号停止后进入其他区域，将继续引发其他透明罩发出释放/非释放信号；经过练习后，斑马鱼表现为有时间间隔的搜索其他透明罩区域，形成复杂自发成瘾行为，以斑马鱼提前进入其他区域次数，首次开始按时间间隔搜索其他透明罩区域的训练次数为判定依据。
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