CN107334768A - 一种新型情境应激箱在精神疾病及其治疗药物研究和开发中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提示新型情境应激箱对动物(如小鼠，大鼠，斑马鱼等)的行为产生明显的影响，可以作为应激相关精神疾病新的动物模型，用来研究精神疾病的发病机制。本发明公开了新型情境应激箱作为一种新的实验方法可以用来筛选和评价精神疾病治疗药物，研究精神疾病治疗药物的作用机理。

Description

一种新型情境应激箱在精神疾病及其治疗药物研究和开发中 的应用
一，技术领域
本发明涉及一种新型情境应激箱(又称梁氏情境应激箱)在精神疾病及其治疗药物研究和开发中的应用。更具体讲，作为一种新的实验工具和方法，新型情境应激箱可以用来研究精神疾病及其治疗药物。
二，背景技术
精神疾病主要指征是患者的认知，情感，意志以及行为表现明显的持久的异常，难以为社会常规所接受，社会功能和精神功能严重受损，不能维持正常的学习，工作和生活。在病态认知和情感的支配下，可以出现攻击行为，自残或自杀。精神疾病已经成为当今社会重大的医学和社会问题。
精神疾病包括不同病种和病型。如器质性和功能性精神病，外源性和内源性精神病，心因性精神病，症状性精神病，智能障碍，病态人格等。许多精神疾病的发病与应激刺激关系密切，或是直接因素，或是诱发因素，或加重病情，或促进病程恶化。其中抑郁症，焦虑症，狂躁症，双向情感障碍，精神分裂症，创伤后应激障碍，心因性精神障碍，攻击行为，自杀，自伤，自残行为等与应激因素的关系更加明显。
在医学心理学上，应激是一个专业术语，系指机体(动物和人)对外界环境(如自然环境，社会环境，社交环境，家庭环境，工作环境等)刺激的反应，以及适应和应对过程。这种反应过程可以分为三个阶段：第一阶段为警觉期，机体已经感受到周围环境的变化，但尚未能产生适应性；第二阶段担忧期或抵抗期，机体通过自身的调节作用，适应或抵抗周围环境的刺激作用，以保持机体的内在稳态；第三阶段耗竭期，机体难以适应周围环境的刺激，产生病理生理反应，可以引发或诱发相关疾病，特别是精神障碍。甚至，可以致衰竭死亡。情境应激是指特定自然环境对人或动物的刺激作用，对人或动物的行为，情感，甚至认识活动产生明显的影响。其实，在现实生活中，不同的自然环境，对人的精神状态和心理活动会产生异样的影响。幽闭的环境会产生不安和忧郁；悬岩之边，高楼之上，危塔之尖会让人产 生紧张和恐惧，空旷无边的沙漠会产生惊恐和无助，高分贝的噪音会让人烦躁激越，甚至冲动。
在临床上，药物是精神疾病治疗的主要手段和方法。精神疾病治疗药物主要包括抗精神病药，抗抑郁药，抗焦虑药，情绪稳定剂，镇静催眠药等。现代精神疾病治疗药物的研究和发展有赖于精神疾病动物模型的建立，因此，研究和建立新的试验方法和动物模型，可以促进精神疾病药物治疗的开发和应用，加强对相关精神疾病发病机制的理解，提高临床治疗效果，改善预后和结局。
迄今为止，已有许多精神疾病动物模型供医学研究，但它们都有各自的缺陷。例如，高架十字迷宫及其衍生版本(高架T迷宫，高架O迷宫等)被广泛用于焦虑障碍的相关研究。此类行为学实验的结果虽简单直观，便于测量和统计分析，但易受众多因素影响。且许多动物能够迅速适应实验环境，放弃对开放臂的探索，躲藏于闭合臂中。更有甚者，直接从开放臂中逃逸，而导致实验失败。强迫游泳实验和悬尾实验都属于经典的抑郁动物模型。但二者的刺激手段过于剧烈，实验过程易对动物的自身活动能力造成伤害。因此，表面效度和结构效度较低是此类实验的致命弱点。旷场试验主要用于观测动物的一般活动度和探索行为，而并非研究抑郁障碍的特异性试验。长期以来，各个实验室对旷场实验中央区范围的界定都各不相同，导致对同一问题得出不同的，甚至截然相反的结论。此外，还有慢性不可预知性温和应激模型，该模型表面效度和临床预测效度较高，但实验过程繁复，需长期干预且结果重复性较差。最重要的是，上述模型均只能模拟和反映抑郁或焦虑单方面的行为变化和特点。由此可见，现有的精神疾病动物模型并不能完全满足医学研究的需要，此类动物模型的发展速度和医学研究的实验需求之间存在着极大的矛盾。因此，我们需要建立一种新的精神疾病动物模型和方法，既能够反映相关精神疾病的临床特点，又能克服已有相关动物模型的缺陷，为今后相关精神疾病的研究提供新的研究手段和思路。
情境刺激是一种公认的精神疾病的诱因。众所周知，动物本能地会回避空旷的，没有遮挡物保护的场所。身处陌生环境时，动物一方面在好奇心的驱使下四处游走探索，另一方面则会出于自我保护意识而保持警惕。利用这一心理冲突，设计了新型情境应激箱，建立了一个新的精神疾病动物模型。
新型情境应激箱由中央区和周围臂组成，周围臂可以为2臂、3臂、4臂、5臂、6臂、7臂、8臂、9臂和10臂，属于多臂迷宫型封闭式情境应激箱。到目前为止，未见新型情境应 激箱在精神疾病及其治疗药物研究和开发中应用的记录和记载，也未见相关研究论文的发表和报道。
三，发明内容
1.发明目的
本发明的目的在于提供一种新的有实际应用价值的试验方法和动物模型，并在精神疾病及其治疗药物研究和开发中得到应用。
2.发明简述
本发明提供了一种新型的由中央区和周围臂组成的多臂迷宫型封闭式情境应激箱(又称梁氏情境应激箱)。经研究现已明确地发现新型情境应激箱对动物(如小鼠，大鼠，斑马鱼等)具有明显的应激刺激作用。该情境应激箱可用于建立新的与应激相关的精神疾病动物模型，研究相关精神疾病的发病机制，评价，筛选和开发精神疾病治疗药物。
因此，本发明第一方面涉及新型情境应激箱在焦虑症及其治疗药物研究和开发中的应用。
本发明再一方面涉及新型情境应激箱在抑郁症及其治疗药物研究和开发中的应用。
本发明再一方面涉及新型情境应激箱在狂躁症及其治疗药物研究和开发中的应用。
本发明再一方面涉及新型情境应激箱在双向情感障碍及其治疗药物研究和开发中的应用。
本发明再一方面涉及新型情境应激箱在精神分裂症及其治疗药物研究和开发中的应用。
本发明再一方面涉及新型情境应激箱在创伤后应激障碍及其治疗药物研究和开发中的应用。
本发明再一方面涉及新型情境应激箱在心因性精神障碍及其治疗药物研究和开发中的应用。
本发明再一方面涉及新型情境应激箱在攻击行为及其治疗药物研究和开发中的应用。
本发明再一方面涉及新型情境应激箱在上述两种或多种共患精神疾病及其治疗药物研究和开发中的应用。
3.发明内容
根据本发明，本发明中所使用的术语“新型情境应激箱(又称梁氏情境应激箱)”是指由中央区和周围臂组成的多臂迷宫型封闭箱，周围臂可以为2臂、3臂、4臂、5臂、6臂、7臂、8臂、9臂和10臂。对动物(如小鼠，大鼠，斑马鱼等)具有情境应激刺激作用。
根据本发明，本发明中所使用的术语“患者”是指人类。
根据本发明，本发明中所使用的术语“精神疾病”包括焦虑症，抑郁症，狂躁症，双向情感障碍，精神分裂症，创伤后应激障碍，心因性精神障碍，攻击行为障碍。
根据本发明，本发明中所使用的术语“精神疾病治疗药物”包括抗焦虑药，抗抑郁药，抗狂躁药，情绪稳定剂，抗精神病药，抗攻击行为药，镇静催眠药。
根据本发明，本发明中所使用的术语“动物”包括小鼠、大鼠、斑马鱼等。
根据本发明，新型情境应激箱中央区和周围臂的大小、长短、材质和规格取决于多种因素。如动物的种类、大小、性别、实验环境的湿度、灯光、动物行为的监控设备等。可由研究人员判断和选择。
根据本发明，动物在新型情境应激箱的监控方式存在多种形式，如摄像、红外线、动物小型雷达、电极等。
根据本发明，新型情境应激箱可以作为单一的动物应激刺激，也可以与其它的应激刺激联合作用形成动物复合性应激刺激。更进一步讲，其它的应激刺激包括电刺激、热辐射刺激、激光刺激、断水断粮刺激、冷刺激等。
根据本发明，新型情境应激箱的制作材料可以是木料、铁料、钢料、塑料、纸板、玻璃、有机玻璃等。
根据本发明，新型情境应激箱的材料可以使多种颜色，如黑、白、蓝、红、黄、紫、透明等。
根据本发明，本发明中所使用的术语“药物”是指具有药理活性的治疗作用的物质，包括小分子化合物、蛋白质、核酸、多肽、中药、中药提取物、中药组分、以及药物组合物。
根据本发明，新型情境应激箱可以与本专业领域已知的实验方法和仪器设备联合使用。如大、小鼠强迫游泳试验，高架十字迷宫实验，悬尾试验，旷场实验等。
下面实施例是对本发明的更为详细说明，不存在对本发明产生任何限制。
本发明实施例所使用的新型情境应激箱为三臂封闭迷宫型，由白色有机玻璃制成。
四.附图说明
图1是60分钟自由探索活动中三个种系小鼠中央区停留时间(a)和中央区活动路程(b)的时程变化。
图2是不同种系小鼠在新型情境应激箱三个外周臂和中央区停留时间(a)和活动路程(b)的比例。
图3是三个种系小鼠在新型情境应激箱外周区和中央区单位面积停留时间的比较。
图4是三个种系小鼠在新型情境应激箱外周区和中央区单位面积活动路程的比较。
图5是强光刺激对新型情境应激箱中小鼠各项行为观察指标的影响。
图6是束缚应激刺激对新型情境应激箱中小鼠各项行为观察指标的影响。
图7是悬尾应激刺激对新型情境应激箱中小鼠各项行为观察指标的影响。
图8是抗焦虑药丁螺环酮对新型情境应激箱中小鼠各项行为观察指标的影响。
图9是抗抑郁药米安色林对新型情境应激箱中小鼠各项行为观察指标的影响。
图10是本发明的结构图。
图11是本发明的实物图。
五.具体实施方式
实施例1：不同种系小鼠对新型情境应激箱中央区探索行为的时程变化
实验选用KM，ICR，C57BL/6J三种小鼠，成年雄性，体重为19-22g，每5只一笼饲养。动物房室温22±1℃，相对湿度30％-50％，12h昼夜循环光照(光照时间08:00-20:00)。实验前，小鼠在实验室适应性饲养4天，自由饮水及进食。实验操作间室温22±1℃，光照10lux，隔绝噪音干扰。实验在14:00到19:00之间进行，以消除生物昼夜节律的影响。在小鼠背部用黑色墨水标记便于监测，并提前1个小时将其由动物房转移至实验操作间以适应环境变化。每只小鼠仅使用一次。
实验的具体过程描述如下：实验者将小鼠单独放置于任意周围臂的末端，面朝中央区，任其自由探索。观察60分钟并记录：(1)小鼠首次进入中央区的潜伏期，(2)小鼠中央区停留时间，中央区单位面积停留时间，外周区单位面积停留时间，(3)小鼠央区活动路程，中央区单位面积活动路程，外周区单位面积活动路程，(4)区域间穿梭次数，(5)总活动度。选用西班牙Panlab公司设计研发的SMART 3.0系统监测并记录小鼠的行为学参数。每只小鼠实验后，都需用75％的酒精擦拭新型情境应激箱，以避免残留气味的干扰。数据采用双因素重复测量方差分析和post hoc Bonferroni检验。
首先，我们研究了KM,ICR和C57BL/6J三个种系小鼠在自由探索新型情境应激箱的过程中，其中央区停留时间和中央区活动路程随时间变化的情况。以60分钟为总观测时间，每隔15分钟记录一次行为指标并采用双因素重复测量方差分析法(two-way repeatedmeasures ANOVA)对数据加以分析。如图1a所示，所有小鼠的中央区停留时间均不随时间推移而有所波动(p>0.05)。横向比较各个时段内(0-15,15-30,30-45,45-60分钟)，不同种系小鼠的中央区停留时间，其结果亦无显著性差异(p>0.05)。说明60分钟内各种系小鼠对新型情境应激箱中央区的探索时间较稳定，且新型情境应激箱诱导各种系小鼠对中央区的探索时间具有很好的一致性。
图1b结果显示，与前三个时段相比，最后一个时段内C57BL/6J小鼠中央区活动路程明显下降(p<0.05)。KM和ICR小鼠的中央区活动路程也随着时间的流逝呈现出下降趋势。此结果说明三个种系小鼠中央区活动路程的变化基本一致。小鼠长时间的探索活动后，活动路程降低符合动物探索行为的基本规律和特性。三个种系间小鼠的中央区活动路程未见明显差异，进一步验证了新型情境应激箱对不同种系小鼠诱导的探索行为具有很好的一致性(p>0.05)。
由此可见，新型情境应激箱可以用来进行不同种系的动物实验。进一步分析发现，60分钟内，小鼠在第一个15分钟时程中所表现的探索行为兴趣更高，一致性更好，说明15分钟 的测试时间能够充分且全面的反映小鼠在新型情境应激箱中的心理状态和行为特点。因此，选择15分钟作为后续实验的测试时长。
实施例2：不同种系小鼠对新型情境应激箱外周臂和中央区探索行为观察指标的确定
图2a描述了三个不同种系小鼠在新型情境应激箱三个外周臂和中央区停留时间的比例。15分钟测试时程内，KM，ICR和C57BL/6J小鼠三个外周臂总停留时间的百分比分别为67.2％，68.4％，65.8％；中央区停留时间的百分比分别为32.8％，31.6％，34.2％。双因素方差分析显示，三个不同种系小鼠外周臂和中央区停留时间的百分比均无明显差异(p>0.05)。
与图2a中小鼠不同区域停留时间分布比例相似，图2b结果显示，15分钟内KM，ICR和C57BL/6J小鼠三个外周臂总活动路程的百分比分别为61.8％，61.3％，63.3％；中央区活动路程的百分比分别为38.2％，38.6％，36.7％。双因素方差分析显示，三个不同种系小鼠外周臂和中央区活动路程的百分比均无明显差异(p>0.05)。
因此，我们认为对于KM,ICR和C57BL/6J小鼠而言，新型情境应激箱外周臂1，外周臂2和外周臂3分别所处的位置及其内在环境均无明显差别。
新型情境应激箱外周区的面积为1125.0cm2，中央区的面积为706.5cm2，两者相差约1.6倍。因此，动物在新型情境应激箱外周区和中央区停留时间和活动路程的百分比并不能准确反映动物对不同区域的喜恶程度。为了进一步考证三个种系小鼠对新型情境应激箱外周区和中央区的倾向性，我们分别计算了外周和中央两个区域的单位面积停留时间和单位面积活动路程，并进行配对样本t检验分析(Paired t-test)。
图3的结果显示：15分钟测试时程中，KM(t＝-2.41,p<0.05)，ICR(t＝-3.72,p<0.01)和C57BL/6J(t＝-2.37,p<0.05)小鼠外周区单位面积停留时间均明显高于中央区，分别高出23.05％，26.87％，23.70％。
图4的结果显示：15分钟测试时程中，KM(t＝-2.31,p<0.05)，ICR(t＝-2.31,p<0.05)和C57BL/6J(t＝-2.91,p<0.05)小鼠外周区单位面积活动路程均明显多于中央区，分别多出24.52％，18.72％，23.49％。
总的来看，图3和图4的结果说明新型情境应激箱能诱导三个种系小鼠产生明显的矛盾心理或/和心理冲突。也就是说，小鼠对陌生的中央区存在明显的好奇心理，可以引发探索欲望和行为，同时，对中央区的空旷(外周臂的宽度为15cm，中央区的直径为30cm，相对而言，中央区的空旷性是外周臂的两倍)和暴露又存在明显的恐惧与厌恶，可以产生逃避心理和行为。动物的这种矛盾心理或/和心理冲突与精神疾病的抑郁和/或焦虑情绪密切相关。
动物模型的评价标准主要包括三大方面，即结构效度、表面效度和预测效度。结构效度即动物模型应与人类疾病具有相同的发病原因、病理生理学基础和神经生物学机制。综合分析实施例1和2，我们发现，新型情境应激箱为小鼠提供的情境应激刺仅从心理层面对小鼠形成压力，诱导其产生应激反应，影响其异常行为，这与人类情绪障碍的病因极为相似。它成功的克服了强迫游泳或饮水冲突等实验的缺陷，排除了躯体应激所导致的干扰。此外，KM,ICR和C57BL/6J三个种系小鼠在四个时间段内，中央区停留时间均维持在300秒左右，中央区活动路程则维持在2250厘米上下，二者均不随时间推移或种系改变而呈大幅波动。因此，我们认为，新型情境应激箱是一个设计独特的迷宫型应激场所，它所形成情境应激刺激具有普适性强、持续存在且强度恒定的特点，适合用于科学研究。
新型情境应激箱设定了6个行为学观察指标，从三个维度对小鼠的特定性行为进行了观察和解析：(1)首次进入中央区的潜伏期(Latency to central area，Latency toCA)，实验初始，小鼠身处新型情境应激箱任意外周臂末端，面向中央区。该指标记录小鼠首次从外周区(3个外周臂面积总和即为外周区)进入中央区的时间；(2)中央区停留时间(Time spent in central area,CA-time)，以上两个指标主要用来评价动物好奇探索欲望与恐惧逃避行为之间的心理冲突，与情境应激诱导的抑郁和/或焦虑情绪有关；(3)中央区活动路程(Travel ing distance in central area,CA-distance)，对动物好奇探索欲望与恐惧逃避行为之间的心理冲突作进一步评价；(4)区域间穿梭次数(Transitionnumber)，是指小鼠在三个外周臂和中央区之间的穿梭次数，上述两个指标可能与抑郁情绪有关。与经典的旷场试验箱相比较，迷宫型的新型情境应激箱就显得更加复杂。因此，封闭的、复杂的、迷宫型的新型情境应激箱可能造成小鼠难以“逃避”的情境而产生“行为绝望(behavioral despair)”，即抑郁情绪；(5)外周区活动路程(Traveling distance inperipheral area,PA-distance)，外周区活动路程是指小鼠在三个外周臂总的活动路程；(6)总活动度(Global activity)，用于描述小鼠在三维空间中总的活动程度，包括水平活动路程(locomotion)，直立(rearing)，理毛(grooming),嗅(sniffing)，爬或钻 (crawling over or down)，跳跃(jumping)等，这两个指标主要反映小鼠中枢神经系统的兴奋状态和运动功能。
统计学分析表明各个种系小鼠首次进入中央区的潜伏期(p>0.05)、中央区停留时间(p>0.05)、中央区活动路程(p>0.05)、外周区活动路程(p>0.05)、区域间穿梭次数(p>0.05)和总活动度(p>0.05)，均未出现显著性差异(见表1)。上述结论与图1和图2一致，再次验证了新型情境应激箱的普适性。ICR小鼠源于美国Hauschka研究所饲养的瑞士种小鼠，因其经济实惠、应用广泛等特点被选定为主要实验对象，用于后续研究。
表1不同种系小鼠对新型情境应激箱外周臂和中央区探索行为观察指标的比较
注：将小鼠放入新型情境应激箱任其自由探索15分钟后记录上述观察指标，所有数据均以均值±标准误(Mean±SEM)表示，n＝12。
实施例3：光照应激刺激对新型情境应激箱中小鼠抑郁和/或焦虑行为的影响
实验选用ICR小鼠，成年雄性，体重为19-22g，每5只一笼饲养。动物房室温22±1℃，相对湿度30％-50％，12h昼夜循环光照(光照时间08:00-20:00)。实验前，小鼠在实验室适应性饲养4天，自由饮水及进食。实验操作间室温22±1℃，隔绝噪音干扰。实验在14:00到19:00之间进行，以消除生物昼夜节律的影响。在小鼠背部用黑色墨水标记便于监测，提前1个小时将其由动物房转移至实验操作间以适应环境变化。每只小鼠仅使用一次。
小鼠随机分为三组，分别设置10lux，110lux，210lux三种不同强度的光照条件。实验者将ICR小鼠单独放置于任意周围臂的末端，面朝中央区，任其自由探索。观察15分钟并记录(1)首次进入中央区的潜伏期，(2)中央区停留时间，(3)中央区活动路程，(4)外周区活动路程，(5)区域间穿梭次数，(6)总活动度。
强光照射能够激化小鼠对陌生环境既好奇又惧怕的矛盾心理，诱导小鼠产生明显的行为异常。本实验的目的是研究强光照射对小鼠在新型情境应激箱中行为表现的具体影响。从图5a中可知，在10lux光照条件下，小鼠首次进入中央区的潜伏期是20.70±11.72，将光强调整为110lux和210lux时，该值则分别延长为131.33±33.57和114.40±31.68，变化显著(p<0.01)。图5b显示，强光照射组小鼠的中央区停留时间显著低于对照组(p<0.001)，110lux组和210lux组较对照组分别降低了59.21％和61.99％。图5c结果表明，110lux组和210lux组小鼠中央区活动路程(p<0.01)较对照组分别降低了51.88％和39.70％，然而，在外周区活动路程上无明显差异(p>0.05)。由图5d可知，随着光照强度的增加(从110lux到210lux)，小鼠的区域间穿梭次数(F(2,29)＝18.08,p<0.001)与对照组相比分别减少了55.16％和58.27％。图5e显示光照强度可明显提高小鼠的总活动度(p<0.001)，110lux组和210lux组小鼠总活动度与对照组相比分别提高了5.32倍和5.19倍。基于上述实验结果，我们认为强光照射可诱发并加重小鼠的抑郁和/或焦虑情绪。新型情境应激箱可以准确的检测出小鼠由情绪变化所引起的一系列行为异常。
实施例4：急性束缚应激刺激对新型情境应激箱中小鼠抑郁和/或焦虑行为的影响
实验选用ICR小鼠，成年雄性，体重为19-22g，每5只一笼饲养。动物房室温22±1℃，相对湿度30％-50％，12h昼夜循环光照(光照时间08:00-20:00)。实验前，小鼠在实验室适应性饲养4天，自由饮水及进食。实验操作间室温22±1℃，隔绝噪音干扰。实验在14:00到19:00之间进行，以消除生物昼夜节律的影响。在小鼠背部用黑色墨水标记便于监测，并提前1个小时将其由动物房转移至实验操作间以适应环境变化。每只小鼠仅使用一次。
小鼠随机分为三组，预先分别给予0，60，240分钟的急性束缚应激刺激，而后立刻置于新型情境应激箱中，任其自由探索。观察15分钟并记录(1)首次进入中央区的潜伏期，(2)中央区停留时间，(3)中央区活动路程，(4)外周区活动路程，(5)区域间穿梭次数，(6)总活动度。
总所周知，急性束缚应激可诱导小鼠出现压力相关的行为异常及生理心理改变，使其学习记忆功能受损，活动力降低，甚至产生焦虑和/或抑郁情绪。本实验将ICR小鼠随机分为一个对照组(n＝12)和两个束缚应激组(n＝10)，分别给予0，60和240分钟的急性束缚应激。图6a和b的结果显示，急性束缚60分钟和240分钟使小鼠首次进入中央区的潜伏期(p<0.01)分别延长为对照组的2.09倍和7.75倍，而小鼠中央区停留时间(p<0.001)则降为对照组的55.40％和39.68％。图6c表明无论是60分钟还是24分钟束缚应激均可导致小鼠中央区活动路程显著降低(p<0.001)，但对其外周区活动路程无影响(p<0.05)。由图6d可知，急性束缚60分钟和240分钟，小鼠区域间穿梭次数(p<0.01)比对照组减少了37.36％和46.71％。实验中并未观察到束缚应激对小鼠总活动度的影响(图6e,p<0.05)。因此，我们分析得出如下结论，束缚应激可以明显抑制小鼠在新型情境应激箱中的探索行为，诱发和加重小鼠的抑郁和/或焦虑情绪。
实施例5：悬尾应激刺激对新型情境应激箱中小鼠抑郁和/或焦虑行为的影响
实验选用ICR小鼠，成年雄性，体重为19-22g，每5只一笼饲养。动物房室温22±1℃，相对湿度30％-50％，12h昼夜循环光照(光照时间08:00-20:00)。实验前，小鼠在实验室适应性饲养4天，自由饮水及进食。实验操作间室温22±1℃，隔绝噪音干扰。实验在14:00到19:00之间进行，以消除生物昼夜节律的影响。在小鼠背部用黑色墨水标记便于监测，并提前1个小时将其由动物房转移至实验操作间以适应环境变化。每只小鼠仅使用一次。
小鼠随机分为三组，预先分别给予0，150，300秒的悬尾应激刺激，而后立刻置于新型情境应激箱中，任其自由探索。观察15分钟并记录(1)首次进入中央区的潜伏期，(2)中央区停留时间，(3)中央区活动路程，(4)外周区活动路程，(5)区域间穿梭次数，(6)总活动度。
小鼠在遭受悬尾应激刺激时会出现恐惧、绝望、静止不动、体温过高等一系列抑郁相关的行为改变。依据此特点，我们预先给予ICR小鼠0、150和300秒的悬尾应激刺激，并借助新型情境应激箱观测其情绪变化及行为表现。图7a中小鼠首次进入中央区的潜伏期受悬尾应 激刺激影响，明显延长(p<0.05)。与对照组相比，150秒悬尾组延长了902.22％，300秒悬尾组延长了1805.07％。此外，悬尾150秒可使小鼠中央区停留时间(图7b,p<0.001)降至对照组的一半，悬尾300秒使之降至对照组的四分之一。两两比较分析(post hocBonferroni’s test)可观察到，300秒悬尾组小鼠与150秒组相比，其中央区停留时间呈进一步下降趋势(p<0.05)。图7c显示，悬尾150秒和300秒时，小鼠中央区活动路程(p<0.01)与对照组相比分别下降了32.15％和72.25％，而其外周区活动路程不受影响(p<0.05)。图7d和e表明，小鼠的区域间穿梭次数(p<0.01)和总活动度(p<0.001)均因悬尾应激刺激受到了明显的抑制，150秒悬尾组小鼠的区域间穿梭次数下降了30.97％，总活动度降低了27.81％，300秒悬尾组小鼠则分别下降了66.67％和29.12％。
动物疾病模型的表面效度(face validity)主要是指动物模型各项观察指标的病理生理学意义，以及与临床疾病可能的内在联系。实际生活中，焦虑和抑郁的产生与人所受到的环境压力密切相关。持续存在的精神障碍可导致机体出现行动迟缓、畏光、快感缺失、冷漠、逃避、频繁的无法自控的无意识动作等一系列异常行为，扰乱我们的正常生活。前人的研究中，亦有将大、小鼠暴露于强光、束缚、悬尾等刺激下引发或加重其恐惧、抑郁和(或)焦虑等相关情绪。在实施例3-5中，强光、束缚和悬尾应激刺激使小鼠首次进入中央区的潜伏期显著延长，中央区停留时间缩短，中央区活动路程下降以及区域间穿梭次数减少(见表2)。以上三种刺激均明显强化了小鼠对原有情境应激刺激的反应，进一步降低了小鼠对新奇环境的探索欲望，剥夺了其探索的乐趣，使其更为强烈的感受到了恐惧、无助和绝望。有意思的是，三种不同类型的应激刺激对小鼠总活动度的作用却并不一致。强光刺激促使小鼠总活动度显著升高，束缚刺激对它没有影响，而悬尾刺激则使之明显降低(见表2)。我们知道，总活动度是用以衡量小鼠在三维空间内活动情况的一个行为学观测指标。小鼠在新型情境应激箱中频繁的直立、跳跃、理毛、抓挠、原地旋转、点头和嗅等小动作均可导致总活动度升高。Bi lkei-Gorzo and Gyertyan认为小鼠处于不利环境时，频繁的点头(head-dipping)、用鼻尖触碰地面或围墙、四处嗅(sniff)是在寻求出口，企图逃离。直立是小鼠的一种防御性姿势，而跳跃动作则被看做恐惧反应。同样，我们也认为，上述刻板行为表现可能反映了小鼠紧张慌乱、躁动不安的情绪。强光刺激明显加剧了小鼠的焦虑不安，相对温和的束缚刺激对这一指标影响微弱。依据前人经验，束缚1-2个小时，小鼠开始出现厌食、焦虑，2-5个小时使其探索活动稍有减少，6个小时以上会明显抑制其攻击探索行为，甚至进入僵立静止状态，这与我们的实验结果基本一致。较为激烈的悬尾刺激显著降低了小鼠的总活动度，这可能是物理体位倒置抑制了小鼠的活跃程度和探索行为所致。上述诸多行为表现均与焦虑和(或)抑郁患者的临床表现类似，说明利用新型情境应激箱建立的小鼠焦虑抑郁共病模型具有良好的表面效度。
表2应激刺激对小鼠在新型情境应激箱中行为观察指标的影响
注：↓或者↑表明该值与对照组相比轻微升高或降低，↓↓或↑↑表明该值与对照组相比显著升高或降低，差异具有统计学意义；“NS”表明该值与对照组相比基本无变化。
实施例6：抗焦虑剂丁螺环酮对小鼠焦虑行为观察指标的影响
实验选用ICR小鼠，成年雄性，体重为19-22g，每5只一笼饲养。动物房室温22±1℃，相对湿度30％-50％，12h昼夜循环光照(光照时间08:00-20:00)。实验前，小鼠在实验室适应性饲养4天，自由饮水及进食。实验操作间室温22±1℃，隔绝噪音干扰。实验在14:00到19:00之间进行，以消除生物昼夜节律的影响。在小鼠背部用黑色墨水标记便于监测，并提前1个小时将其由动物房转移至实验操作间以适应环境变化。每只小鼠仅使用一次。
小鼠随机分为三组，依组分别腹腔注射(ip)生理盐水或抗焦虑剂丁螺环酮(0.5mg·kg-1、1.0mg·kg-1)，30分钟后置于新型情境应激箱中，任其自由探索。观察15分钟并记录(1)首次进入中央区的潜伏期，(2)中央区停留时间，(3)中央区活动路程，(4)外周区活动路程，(5)区域间穿梭次数，(6)总活动度。
丁螺环酮是一种新型的抗焦虑药，属于氮杂螺环葵烷二酮化合物。腹腔注射丁螺环酮30min后，测定小鼠在新型情境应激箱的活动表现，并分析其行为特征。研究结果表明，与生理盐水组相比较：丁螺环酮明显缩短小鼠首次进入中央区的潜伏期(图8a,p<0.05)，0.5mg·kg-1和1.0mg·kg-1分别缩短71.9％和77.9％。进一步分析发现，丁螺环酮显著性增加小鼠在中央区停留时间(图8b,p<0.05)，0.5mg·kg-1和1.0mg·kg-1分别增加59.5％和73.8％，且呈现剂量依赖性，1.0mg·kg-1丁螺环酮的药理效应达到显著性，p<0.05。值得注意的是，丁螺环酮0.5-1.0mg·kg-1有效剂量中，对小鼠中央区(图8c,p<0.05)和外周(图8c,p<0.05)区活动路程均无明显影响。虽然0.5mg·kg-1和1.0mg·kg-1丁螺环酮均明显减少小鼠在新型情境应激箱中的区域间穿梭次数(图8d,p<0.05)，但是，对小鼠总活动度的影响无统计学意义(图8e,p<0.05)。抗焦虑剂丁螺环酮对小鼠部分行为指标的反转作用间接证实了小鼠在新型情境应激箱中可能处于焦虑状态。
实施例7：抗抑郁剂米安色林对小鼠抑郁行为观察指标的影响
实验选用ICR小鼠，成年雄性，体重为19-22g，每5只一笼饲养。动物房室温22±1℃，相对湿度30％-50％，12h昼夜循环光照(光照时间08:00-20:00)。实验前，小鼠在实验室适应性饲养4天，自由饮水及进食。实验操作间室温22±1℃，隔绝噪音干扰。实验在14:00到19:00之间进行，以消除生物昼夜节律的影响。在小鼠背部用黑色墨水标记便于监测，并提前1个小时将其由动物房转移至实验操作间以适应环境变化。每只小鼠仅使用一次。
小鼠随机分为三组，依组分别腹腔注射(ip)生理盐水或抗焦虑药米安色林(0.25mg·kg-1、0.5mg·kg-1)，30分钟后置于新型情境应激箱中，任其自由探索。观察15分钟并记录(1)首次进入中央区的潜伏期，(2)中央区停留时间，(3)中央区活动路程，(4)外周区活动路程，(5)区域间穿梭次数，(6)总活动度。
米安色林为四环化合物，是一种有别于三环类抗抑郁剂和单胺氧化酶抗抑郁剂的新型药物，被称为“第二代抗抑郁剂”。本实验观察腹腔注射米安色林0.25mg·kg-1和0.5mg·kg-1对小鼠在新型情境应激箱中行为测定指标的影响。图9a显示，0.25mg·kg-1和0.5mg·kg-1米安色林呈剂量依赖性减少小鼠首次进入中央区的潜伏期(p<0.01)，低剂量组和高剂量组分别缩短72.4％和82.3％。与生理盐水对组相比较，米安色林可以增加小鼠中央区停留时间， 0.25mg·kg-1增加39.1％，0.5mg·kg-1增加43.9％，并具有统计学意义(图9b,p<0.05)。虽然米安色林成剂量依赖性增加小鼠中央区活动路程(图9c,p<0.05)，0.5mg·kg-1剂量组的增加幅度达到显著性(p<0.05)，然而，统计分析结果显示，无论是低剂量(0.25mg·kg-1)，还是高剂量(0.5mg·kg-1)均对小鼠外周区活动路程无明显影响(图9c,p<0.05)。此外，米安色林还可明显增加小鼠在新型情境应激箱中的区域间穿梭次数(图9d,p<0.05)，0.25mg·kg-1和0.5mg·kg-1分别增加10.4％和40.1％。图9e结果显示，腹腔注射0.25mg·kg-1和0.5mg·kg-1米安色林对小鼠在新型情境应激箱中总活动度并无明显影响(p<0.05)。
利用药物明确的抗焦虑或抗抑郁药理作用可以对动物模型的预测效度(predictive validity)作出评价。研究资料表明：丁螺环酮主要对突触前膜5-HT1A受体具有激动作用，反馈性抑制神经末梢5-HT的释放，降低中枢5-HT神经系统的功能水平，发挥抗焦虑作用。米安色林属于四环类抗抑郁药，主要通过调节中枢神经系统去甲肾上腺素的含量和释放，产生抗抑郁作用。
本项研究采用新型情境应激箱观察抗焦虑药丁螺环酮和抗抑郁药米安色林对小鼠特征性行为的药理作用，评价其预测效度，实验结果表明(见表3)：①抗焦虑药和抗抑郁药均可明显缩短小鼠首次进入中央区的潜伏期，并呈剂量依赖性增加中央区停留时间。也就是说，两类药物皆显著缓解了小鼠的焦虑和/或抑郁样行为，帮助其稳定情绪，克服对新型情境应激箱中央区的恐惧、厌恶及回避心理，从而增加了其探索活动和逃脱欲望。这说明首次进入中央区的潜伏期和中央区停留时间是评价新型情境应激箱诱导小鼠焦虑和(或)抑郁情绪反应重要的行为学指标和参数。②与抗焦虑药减少区域间穿梭次数不同的是，抗抑郁明显增加小鼠中央区活动路程和区域间穿梭次数，说明这两个行为学指标与抑郁情绪关系更加密切，可能与抗抑郁药增加小鼠探索新奇环境的欲望和动机有关。此外，依据上述指标呈现出的截然不同的药理效果，研究人员能够准确的区分和鉴别这两类药物。必须强调的是，这两个行为学指标更加深入的行为医学和精神药理学意义有待进一步研究。③无论是抗焦虑药还是抗抑郁药对外周区活动路程和总活动度均无显著性影响。外周区活动路程，尤其是总活动度主要反映中枢神经系统的兴奋状态。本实验结果说明所选用的药物剂量既未产生非特异性的中枢抑制作用，又未产生明显的中枢兴奋效应。
表3抗焦虑药和抗抑郁药对小鼠在新型情境应激箱中行为观察指标的影响
注：↓或者↑表明该值与对照组相比轻微升高或降低，↓↓或↑↑表明该值与对照组相比显著升高或降低，差异具有统计学意义；“NS”表明该值与对照组相比基本无变化。
值得注意的是，对于首次进入中央区潜伏期和中央区停留时间这两个最为重要的观察指标来讲，不但抗焦虑药和抗抑郁药均发挥了明确的药理作用，且显示出基本相同的药理效应，提示新型情境应激箱对小鼠情绪应激反应的诱导作用，并非是单一的“心理冲突”诱导焦虑情绪，也可能存在难以逃避的“行为绝望”。因此，从动物疾病模型的三个评价标准来分析，新型情境应激箱诱导小鼠的情绪障碍更有可能是一种焦虑和抑郁共患疾病动物模型。正如前所述，焦虑和抑郁共病障碍在临床上更为常见，因此，我们不得不猜想，与单纯的焦虑或抑郁动物模型相比，共病模型或许更贴近临床实际情况，能够更准确的模拟患者真实表现。本项研究工作初步的结果表明，新型情境应激箱对小鼠情境应激反应的诱导作用既能够反映焦虑和抑郁情绪各自的变化，又能体现焦虑和抑郁共病的特点，为焦虑抑郁共病病理生理机制的研究和新型抗焦虑和(或)抗抑郁药物筛选和评价提供新的研究手段和思路。
一个信度效度高，重复性好，经济易行的动物模型对于促进生物医学研究有着十分重要的价值。实施例1-7通过对六项主要行为观察指标的综合分析和比较，可以发现新型情境应激箱诱导小鼠焦虑和(或)抑郁样行为表现的结构效度、表面效度和预测效度三者之间具有很好的一致性和相关性，且具有以下优势：①低成本、简单易行，无需对实验动物进行长期且复杂的训练；②实验时间短，获得实验结果快速直观；③实验程序规范，实验条件可 控性高，结果重复性好；④新型情境应激箱所提供的情境应激刺激具有普适性，且强度稳定，持续有效；⑤情境应激源诱导心理应激可以避免手术、电击、禁食、悬尾、强迫游泳等躯体伤害性刺激；⑥与经典的旷场试验箱相比较，新型情境应激箱中央区的界定明确和规范，提高不同研究机构实验数据的可比较性。此外，迷宫型新型情境应激箱增加情境应激的复杂性和强度；⑦与高架十字迷宫等实验相比较，封闭型新型情境应激箱可以防止动物逃逸；⑧新型情境应激箱设定6个行为学观察指标，从三个维度对小鼠的特定性行为进行观察和解析，可以全面多角度地评价小鼠在新型情境应激箱中的特定性行为。

Claims (10)

1.新型情境应激箱属于多臂迷宫型封闭箱，由中央区和周围臂组成，周围臂可以为2臂、3臂、4臂、5臂、6臂、7臂、8臂、9臂和10臂。新型情境应激箱对小鼠、大鼠，斑马鱼等可以产生特殊的情境应激刺激作用，是研究精神疾病及其治疗药物新的实验工具和方法。
2.根据权利要求书1所述，新型情境应激箱在焦虑症及其治疗药物研究和开发中的应用。
3.根据权利要求书1所述，新型情境应激箱在抑郁症及其治疗药物研究和开发中的应用。
4.根据权利要求书1所述，新型情境应激箱在狂躁症及其治疗药物研究和开发中的应用。
5.根据权利要求书1所述，新型情境应激箱在双向情感障碍及其治疗药物研究和开发中的应用。
6.根据权利要求书1所述，新型情境应激箱在精神分裂症及其治疗药物研究和开发中的应用。
7.根据权利要求书1所述，新型情境应激箱在创伤后应激障碍及其治疗药物研究和开发中的应用。
8.根据权利要求书1所述，新型情境应激箱在心因性精神障碍及其治疗药物研究和开发中的应用。
9.根据权利要求书1所述，新型情境应激箱在攻击行为及其治疗药物研究和开发中的应用。
10.根据权利要求书2至9所述，新型情境应激箱在任意两项或多项共患精神疾病及其治疗药物研究和开发中的应用。
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