CN111295589A - 牙周炎患者的分类 - Google Patents
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Abstract
公开了一种用于评估患有牙周炎的人类患者是否患有轻度牙周炎或重度牙周炎的系统、试剂盒、用途和体外方法。系统和方法基于见解，以将聚类技术应用于患者数据的参考集合，并且然后进一步区分要应用的生物标志物的集合。基于生物标志物肝细胞生长因子(HGF)、基质金属蛋白酶8(MMP8)和基质金属蛋白酶9(MMP9)确定聚类。患者的实际分类基于生物标志物的两个集合中的任一集合的浓度的测量进行。针对一个聚类，这些生物标志物是白介素‑1β(IL1β)、白介素‑6(IL6)和胶原端肽。针对另一聚类，这些生物标志物是HGF和金属肽酶抑制剂1(TIMP1)。
Description
技术领域
本发明属于口腔护理领域，并且涉及基于口腔液(诸如唾液)中的生物标志物的牙周疾病的诊断。特别地，本发明涉及一种用于将牙周炎患者分类为轻度或重度牙周炎的试剂盒、系统、用途和方法。
背景技术
牙周炎是一种由口腔微生物引起的慢性多因素炎性疾病，其特征在于硬组织(骨)和软组织(牙周膜)逐渐破坏，最终导致牙齿松动和脱落。牙周炎区别于牙龈炎，牙龈炎是牙龈组织的可逆性感染和炎症。炎性牙周炎是最普遍的慢性人类疾病之一，并且是成年牙齿脱落的主要原因。除了牙周炎对口腔健康的实质性负面影响外，还有越来越多的证据表明牙周炎具有全身性后果，并且它是多种全身性疾病(包括心脏病(例如动脉粥样硬化、中风)、糖尿病、妊娠并发症、类风湿性关节炎和呼吸道感染)的危险因素。
因此，从口腔健康和整体健康两者的角度，对牙周疾病进行早期和准确的诊断都很重要。
在一般的牙科实践中，牙周疾病的诊断仍然很差(Morgan RG(2001).Brit Dent J191:436-41)，从而导致相对较低的治疗干预率和大量未治疗的病例。当前的诊断依赖于牙科专业人员对口腔组织状况(颜色、肿胀、探查时出血的程度、探查牙周袋深度和根据口腔x射线的骨损失)进行的不精确的主观临床检查。这些常规方法很耗时，并且所使用的一些技术(牙周袋深度、x射线)反映了历史事件，诸如过去的疾病活动而不是当前的疾病活动，或对其他疾病的易感性。因此，期望更客观、更快、更准确、更易于使用的诊断，其优选地也可以由非专家执行。从而，期望测量当前的疾病活动以及可能的对象对其他牙周疾病的易感性。
长期以来，唾液或口腔液一直被认为是口腔和一般疾病的诊断液，并且随着微型化生物传感器(也称为实验室芯片)的出现，已经获得了用于快速椅旁测试的即时诊断更大的科学和临床关注。尤其针对牙周疾病检测，与组织炎症和破坏相关联的炎性生物标志物可能由于邻近而容易地存在于唾液中，从而表明唾液具有牙周疾病检测的强大潜力。的确，因此该领域已经获得了极大的关注，并呈现了令人鼓舞的结果，但是还没有出现确切的测试。
生物标志物表示支持临床表现的生物学指示物，并且因此是客观测量，通过该客观测量以诊断牙周疾病的临床结果。最终，可以利用经过验证的生物标志物来评估未来疾病的风险、在最早期阶段辨识疾病、辨识对初始疗法的反应并允许实施预防策略。
唾液生物标志物即时测试开发的先前限制包括缺乏适用于椅旁应用的技术以及无法分析单个样本中的多种生物标志物。同样，在这种测试中包括哪些多种生物标志物的选择还没有在文献中充分地解决，也没有在实际测试中实施。
而且，牙周炎可以在疾病的轻度、轻度至中度到重度形式的范围内的整个严重程度中表现出来。为了容易地评估病状的严重性，牙医通常将患有牙周炎的患者分为两组——患有轻度牙周炎(包括中度牙周炎)的患者和患有重度牙周炎的患者。然而，进行这种评估的可用方法涉及劳动密集型过程，即牙医将不会对每个患者和/或在每次来访时执行例行检查，并且消费者无法执行(自我诊断)。
期望提供一种更简单的过程，并且特别地提供一种仅需要从患者以及可能由患者他或她自己获取少量唾液样本的过程。期望使这种样本进入到体外诊断设备中，该体外诊断设备将允许基于测量结果对唾液样本进行分类，使得该体外诊断设备可以返回对患者将分类为患有轻度牙周炎或患有重度牙周炎的可能性的指示。在基于生物标志物寻找体外测定中的一个特殊挑战是，尽管患者人群天生具有非均质性，但要寻找仍然有限的生物标志物集合，从而提供可取的诊断敏感性和特异性。
发明内容
为了更好地解决前述需求，本发明一方面涉及一种用于将人类对象分类为患有轻度牙周炎或重度牙周炎的系统，该系统包括：
-检测装置，被配置为在对象的口腔液的样本中测量生物标志物肝细胞生长因子(HGF)、基质金属蛋白酶8(MMP8)、基质金属蛋白酶9(MMP9)、白介素-1β(IL1β)、白介素-6(IL6)、胶原端肽和可选的金属肽酶抑制剂1(TIMP1)的浓度；
-一个或多个处理单元，被配置为从对象的口腔液样本中的生物标志物的所测量的浓度确定分类结果；
-其中系统被配置为在第一阶段中测量包括HGF、MMP8和MMP9的生物标志物的集合的浓度，以便获得第一阶段浓度的测量结果，并且其中处理单元被配置为处理所述第一阶段浓度，以便呈现是否在第二阶段中测量包括IL1-β、IL6和胶原端肽的生物标志物的集合的浓度的结果，由此所述处理单元可选地被配置为处理所述第一阶段浓度，以便备选地指示在第二阶段中测量TIMP1的浓度，其中，系统被配置为获得第二阶段浓度的测量结果，并且由此处理单元被配置为处理第二阶段浓度，以便呈现轻度或重度牙周炎的分类结果。
系统可选地包含数据连接，该数据连接允许将从一个或多个处理单元获得的结果导向到能够呈现信息的界面，特别是图形用户界面，所述界面是系统的一部分或远程界面。
可选地，使前述项目中的一个或多个(特别是处理器)能够“在云中”起作用，即，不是在固定机器上起作用，而是通过基于因特网的应用程序来起作用。
在另一方面，本发明提出了一种用于评估怀疑患有牙周炎的人类对象是否患有轻度牙周炎或重度牙周炎的体外方法，其中该方法包括
-在来自所述对象的口腔液的样本中测量蛋白质HGF、MMP8和MMP9的浓度：
-将测量结果与通过以下方式获得的聚类中心进行比较以便确定针对对象的测量结果是否符合第一聚类或第二聚类：(i)确定已知患有牙周炎的一组患者的口腔液样本中的蛋白质HGF、MMP8和MMP9的浓度；(ii)对针对所述患者获得的结果进行聚类技术，以便获得两个聚类，即，定义的第一聚类和未定义的第二聚类；
-在对象符合第一聚类的情况下，对所述对象的口腔液的样本进行蛋白质浓度的进一步测量，所述蛋白质包括IL1-β、IL6和胶原端肽，从而获得反映针对所述蛋白质而测量的联合浓度的测试值；
-在对象符合第二聚类的情况下，可选地对所述对象的口腔液的样本进行TIMP1浓度的进一步测量，从而获得反映针对所述TIMP1和较早测量的HGF浓度而测量的联合浓度的测试值；
-将获得的测试值与以相同方式反映与重度牙周炎相关联的联合浓度的阈值进行比较，以便评估结果是否指示所述对象的轻度牙周炎或重度牙周炎。
在另一方面，本发明提供一种用于确定针对口腔液中牙周炎的生物标志物的浓度的试剂盒，所述试剂盒包括七种检测试剂，每种检测试剂针对不同的生物标志物，其中，检测试剂能够分别结合HGF、MMP8、MMP9、IL1-β、IL6、胶原端肽和TIMP1，并且其中，试剂盒被配置为以分别处理所述生物标志物的三个不同集合的浓度，即，包括HGF、MMP8和MMP9的第一集合，包括IL1-β、IL6和胶原端肽的第二集合，以及包括TIMP1和HGF的第三集合。
在又一方面，本发明提供一种基于来自患者的口腔液的样本中蛋白质的浓度诊断怀疑患有牙周炎的人类患者是否患有轻度牙周炎或重度牙周炎的方法，该方法包括：
-在人类患者的口腔液的样本中测量蛋白质HGF、MMP8和MMP9的浓度；
-将测量结果与通过以下方式获得的聚类中心进行比较，以便确定针对对象的测量结果是否符合第一聚类或第二聚类：(i)确定已知患有牙周炎的一组患者的口腔液样本中的蛋白质HGF、MMP8和MMP9的浓度；(ii)对针对所述患者获得的结果进行聚类技术，以便获得两个聚类，即，定义的第一聚类和未定义的第二聚类；
-在对象符合第一聚类的情况下，对所述对象的口腔液的样本进行蛋白质浓度的进一步测量，所述蛋白质包括IL1-β、IL6和胶原端肽，从而获得反映针对所述蛋白质而测量的联合浓度的测试值；
-在对象符合第二聚类的情况下，可选地对所述对象的口腔液样本进行TIMP1浓度的进一步测量，从而获得反映针对所述TIMP1和较早测量的HGF的浓度而测量的联合浓度的测试值；
-将获得的测试值与以相同方式反映与重度牙周炎相关联的联合浓度的阈值进行比较，以便评估结果是否指示所述对象的轻度牙周炎或重度牙周炎。
在另一方面，本发明提供一种检测蛋白质HGF、MMP8和MMP9并分别检测(i)蛋白质IL1-β、IL6和胶原端肽或(ii)蛋白质TIMP1的方法，包括：
(a)从人类患者获得口腔液样本；以及
(b)通过使样本与用于结合所述蛋白质的检测试剂接触并检测每种蛋白质与检测试剂之间的结合来检测样本中是否存在蛋白质。
在又一方面，本发明提供一种蛋白质HGF、MMP8和MMP9以及(i)蛋白质IL1-β、IL6和胶原端肽或(ii)蛋白质TIMP1在人类患者的口腔液样本或人类患者的样本中作为生物标志物的用途，以用于评估患者是否患有轻度牙周炎或重度牙周炎的。
附图说明
图1示意性地表示用于如本公开中所描述的方法中的系统。
图2是图示了轮廓值的曲线图。
图3图示了患者人群数据的聚类结果。
图4图示了如何将样本分数分配给聚类1或聚类2。
具体实施方式
在一般意义上，本发明基于审慎的见解，以将聚类技术应用于患者数据的参考集合，并且然后进一步区分要应用的生物标志物集合。这特别有助于应对患者人群固有的不均一性。
可以通过收集已知患有牙周炎的患者的口腔液(诸如唾液)样本获得参考集合。该知识可以基于不同的诊断，特别是以常规方式进行，如由牙医或其他牙科保健专业人员进行检查时所进行的。针对参考集合，测量HGF、MMP8、MMP9的浓度。然后对结果进行聚类技术。该聚类技术可以指技术人员已知的任何这种技术。因此，例如，可以将“k平均值”聚类技术应用于HGF、MMP8和MMP9的浓度读数。这导致针对所辨识的2个聚类中的每一个获得聚类中心。例如，针对三个生物标志物B1、B2和B3：
聚类中心
并且聚类中心
这些聚类中心是根据多个T个对象的生物标志物读数计算出的，其中，U个对象属于聚类C1，并且T-U个对象属于聚类C2。数量T将是至少2，诸如通常是至少10，诸如至少20，诸如至少30，优选至少40。还可以想到的是，首先从较大临床数据集合中选择两个或多个数据点，并且然后应用这些选择的数据点来描述聚类。本发明特别基于应用这种聚类以便获得两个聚类。在这种情况下，获得第一聚类，该第一聚类是定义的聚类。这是指这种聚类，其允许尽可能多的对象(即，前文提到数量的U个对象)以示出与将用大于0.8(诸如大于0.9，诸如0.95或更接近1)的轮廓值表达的结果类似的结果。同样，未定义对应的聚类(针对T-U个对象)，由在0与1之间变化的轮廓值所表达。
在提供本发明时，发明人已经参照下文所描述的临床研究的结果进一步辨识了两个聚类的分类器模型。从而将理解，通常，可以使用任何标准的机器学习分类器。在本公开中，使用k最近邻分类器图示了分类过程。
针对使用生物标志物IL1-β、IL6、胶原端肽作为分类特征且k＝7的聚类C1，在对“轻度牙周炎”和“重度牙周炎”进行分类时，产生88.1％的准确性。
针对使用生物标志物TIMP1和HGF作为分类特征且k＝3的聚类C2，在对“轻度牙周炎”和“重度牙周炎”进行分类时，产生81.25％的准确性。
在实施本发明的过程中，首先对要测试的对象的口腔液样本进行与聚类相关联的生物标志物的确定。口腔液通常是指唾液或龈沟液。唾液样本可以是从口腔内获得的唾液，或可以是作为唾沫获得的唾液。唾液样本也可以是包括唾液的样本，如通过用采样冲洗液体(通常是例如无菌水)进行口腔冲洗并且然后收集冲洗液获得的唾液样本，然后该冲洗液包括用冲洗液体稀释的唾液。在此之前和之后，术语“口腔液”可包括唾液本身、唾沫、包括唾液的口腔冲洗液、龈沟液和包括龈沟液的液体。优选地，口腔液是唾液样本。术语“唾液样本”包括从口腔内获得的唾液、作为唾沫获得的唾液和从用采样液体(诸如无菌水)进行的口腔冲洗而获得的唾液。在下文中，一般仅参照“样本”。
接下来，对样本进行针对两个聚类中的任一个的实际分类而被选择的生物标志物的确定。从而，可以使用两个样本或同一样本的两个不同液滴进行两阶段测试。备选地，对单个样本进行所有涉及的生物标志物的确定。针对HGF、MMP8和MMP9的数据视需要进行数据处理，并与聚类中心进行比较，距离中心对系统中的用于实施本发明的处理单元是可用的。该比较返回对象属于哪个聚类的指示。如果该对象是第一聚类，则将针对IL1-β、IL6、胶原端肽获得的数据进行处理，并将其与阈值进行比较，以便确定轻度或重度牙周炎的存在。如果对象属于第二聚类，则将针对HGF(在单个样本的情况下，其基于与过程的前文提到的第一阶段中所应用的测量相同的测量)和TIMP1所获得的数据进行处理并将其与对应的阈值进行比较。
备选地，如果对象属于第二聚类，则确定测试结果为不确定的。在这种实施例中，本发明(在其所有方面)允许确定对象是否有进一步测试的资格，以便对所述对象的牙周炎进行分类。在那时，不属于明确定义的第一聚类的对象将不会进行进一步浓度测量。这种情况具有的优势是：将用于进一步生物标志物检测以及必要的进一步治疗的资源的用途限制到仅那些对他们而言分类可能更准确的对象。然后，根据常规的牙科护理实践，将在稍后的阶段对其他对象进行监测。
应用于本发明的蛋白质是肝细胞生长因子(HGF)、基质金属蛋白酶8(MMP8)、基质金属蛋白酶9(MMP9)、白介素-1β(IL1β)、白介素-6(IL6)、胶原端肽和金属肽酶抑制剂1(TIMP1)。
HGF是旁分泌细胞生长、运动和形态发生因子。它由间充质细胞分泌，并且主要靶标和作用于上皮细胞和内皮细胞，但也作用于造血祖细胞。已经示出HGF在肌发生和伤口愈合中具有重要作用。它刺激有丝分裂、细胞运动和基质侵袭的能力使其在血管生成、肿瘤发生和组织再生中起着核心作用。HGF刺激上皮细胞的生长并阻止结缔组织附着的再生。HGF被称为血清标志物，指示各种疾病的疾病活动。
IL-1β是白介素1细胞因子家族的成员。该细胞因子由活化的巨噬细胞以原蛋白形式产生，其被胱天蛋白酶1(CASP1/ICE)蛋白水解加工成其活性形式。该细胞因子是炎性反应的重要介体，并参与多种细胞活动，包括细胞增殖、分化和凋亡。
IL-6是既可充当促炎性细胞因子又可充当抗炎性肌细胞因子的白介素。在人类体内，它由IL6基因编码。例如在感染期间和创伤(尤其是烧伤或导致炎症的其他组织损伤)后，白介素6由T细胞和巨噬细胞分泌，以刺激免疫反应。IL-6在抵抗感染中也起着重要的作用，因为已在小鼠中示出需要IL-6以对肺炎链球菌具有抵抗力。另外，成骨细胞分泌IL-6以刺激破骨细胞形成。许多血管的中膜中的平滑肌细胞也产生IL-6，作为促炎细胞因子。
MMP是负责降解细胞外基质成分(诸如胶原蛋白、蛋白聚糖、层粘连蛋白、弹性蛋白和纤连蛋白)的酶家族。在生理和病理条件两者下，MMP在牙周膜(PDL)重塑中都起着核心作用。MMP-8(也称为中性白细胞胶原酶或PMNL胶原酶(MNL-CL))是存在于大多数哺乳动物的结缔组织中的胶原蛋白酶。
MMP-9(也称为92kDa IV型胶原酶、92kDa明胶酶或明胶酶B(GELB))是一种基质素，是属于参与降解细胞外基质的锌金属蛋白酶家族的一类酶。TIMP1是调节基质金属蛋白酶(MMP)和去整合素金属蛋白酶(ADAM和ADAMTS)的抑制性分子。在调节MMP时，TIMP1在细胞外基质(ECM)组成、伤口愈合和怀孕中起着至关重要的作用。
上文提及的七种蛋白质是本领域中已知的。技术人员知道这些蛋白质的结构和在含水样本(诸如口腔液样本)中检测它们的方法。在下文中，将前文提到的蛋白质生物标志物统称为“本发明的生物标志物组(panel)”。在一个实施例中，本发明的生物标志物组由上文所论述的蛋白质生物标志物的三个集合组成。
优选地，本发明的生物标志物组由不超过在本发明的每一集合中辨识的蛋白质生物标志物组成。除了本发明的生物标志物组外，其他生物标志物和或数据(诸如人口统计数据(例如年龄、性别))也可以被包括在应用于确定牙周炎类型的数据的集合中。
然而，本发明的可取的优势是可以通过优选地测量不超过上文所辨识的七种生物标志物来确定对象的牙周炎的分类。或，如果不在同一样本中测量所有生物标志物，则在第一聚类的情况下仅检测六种不同的生物标志物(HGF、MMP8、MMP9、IL1-β、IL6和胶原端肽)，或在第二聚类的情况下仅检测四种不同的生物标志物(HGF、MMP8、MMP9和TIMP1)。特别地，该确定不需要涉及其他数据的使用，这有利地提供了简单且直接的诊断测试。
视需要，方法仅需要从对象获取少量样本(例如水滴大小)。如上文所述，该样本可指单个样本或任一阶段的两个不同的样本。样本的大小通常将为0.1μl至2ml，诸如1到2ml，由此可以使用较少的量(例如0.1至100μl)以用于体外设备处理，并且由此也可以获取较大的样本，诸如最多20ml，诸如7.5至17ml。
使该样本进入到体外诊断设备中，该体外诊断设备测量所涉及的蛋白质的浓度，并在如所论述的两个阶段中返回诊断结果，从而基于患有轻度牙周炎或重度牙周炎的可能性对对象进行分类。
本发明的易用性将使得有可能定期(例如，作为定期牙齿检查的一部分或甚至在家)对患有牙周炎或具有患上牙周炎的高风险的大多数牙科患者进行测试。这尤其允许在轻度牙周炎发展为重度牙周炎之前对其存在进行检测，并且因此可以更及时地采取口腔护理措施，以防止牙周炎恶化。或，例如，在已知处于牙周炎的高风险下并首次进行测试的患者的情况下，该方法允许辨识牙周炎是轻度还是重度。同样，方法可以在治疗先前诊断为重度牙周炎的患者之后应用，以便检查牙周炎是否已经改善，以便变为轻度。特别地，方法也适用于自我诊断，由此，可以由患者他或她自己进行取得样本并使其进入到设备中的步骤。
当实施本发明以确定牙周炎是轻度还是重度时，通常可能怀疑或已知患者患有牙周炎。因此，在某些实施例中，方法用于评估怀疑或已知患有牙周炎的人类患者是否患有轻度牙周炎或重度牙周炎。
本发明的方法通常包括通过使用一种或多种检测试剂来检测构成适用的生物标志物组的前文提到的蛋白质和可选的其他生物标志物蛋白质。
“检测”是指测量、定量、计分或测定生物标志物蛋白质的浓度。评估包括生物标志物蛋白质的生物化合物的方法是本领域中已知的。认识到检测蛋白质生物标志物的方法包括直接测量和间接测量。本领域的技术人员将能够选择测定特定生物标志物蛋白质的适当方法。
相对于蛋白质生物标志物的术语“浓度”应赋予其一般含义，即一定体积中蛋白质的丰度。蛋白质浓度通常以每体积的质量进行测量，最通常为mg/ml或μg/ml，但有时低至pg/ml。备选测量是容积摩尔浓度(或摩尔浓度)，mol/L或“M”。可以通过检测已知、确定或预定体积的样本中蛋白质的量来确定浓度。
用以确定浓度的备选方法是确定样本中蛋白质生物标志物的绝对量，或确定样本中生物标志物的质量分数，例如相对于样本中所有其他蛋白质的总量的生物标志物的量。
“检测试剂”是特异性地(或选择性地)结合到所关注的蛋白质生物标志物、与该所关注的蛋白质生物标志物相互作用或检测该所关注的蛋白质生物标志物的试剂或化合物。这种检测试剂可以包括但不限于优先结合蛋白质生物标志物的抗体、多克隆抗体或单克隆抗体。
当指代检测试剂时，短语“特异性地(或选择性地)结合”或“特异性地(或选择性地)与之发生免疫反应”是指决定了蛋白质和其他生物制剂的异质群体中蛋白质生物标志物的存在的结合反应。因此，在指定的免疫测定条件下，指定的检测试剂(例如抗体)与特定蛋白质的结合至少是背景的两倍，并且基本上不与样本中存在的其他蛋白质大量结合。在这种条件下的特异性结合可能需要针对其对特定蛋白质的特异性进行选择的抗体。可以使用多种免疫测定形式来选择与特定蛋白质发生特异性免疫反应的抗体。例如，常规使用固相ELISA免疫测定(酶联免疫吸附测定)来选择与蛋白质发射特异性免疫反应的抗体(参见例如Harlow和Lane，Antibodies，A Laboratory Manual(1988)，关于可用于确定特异性免疫反应性的免疫测定形式和条件的描述)。通常，特异性或选择性反应将至少是背景信号或噪声的两倍，并且更通常超过背景的10至100倍。
“抗体”是指基本上由一个或多个免疫球蛋白基因或其片段编码的多肽配体，其特异性地结合并识别表位(例如抗原)。公认的免疫球蛋白基因包括κ和λ轻链恒定区基因、α、γ、δ、ε和μ重链恒定区基因以及无数免疫球蛋白可变区基因。抗体例如以完整的免疫球蛋白形式或以通过用各种肽酶消化产生的许多充分表征的片段形式存在。这包括例如Fab'和F(ab)'2片段。如本文中所使用，术语“抗体”还包括通过修饰完整抗体或使用重组DNA方法重新合成的抗体产生的抗体片段。抗体还包括多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或单链抗体。抗体的“Fc”部分是指免疫球蛋白重链的包括一个或多个重链恒定区结构域CH1、CH2和CH3但不包括重链可变区的部分。抗体可以是双特异性抗体，例如具有与第一抗原特异性结合的第一可变区和与第二不同的抗原特异性结合的第二可变区的抗体。使用至少一种双特异性抗体可以减少所需的检测试剂的数量。
诊断方法的敏感性和特异性不同。诊断测定的“敏感性”是测试阳性的患病个体的百分比(“真阳性”的百分比)。由测定未检测到的患病个体是“假阴性”。没有患病并且在测定中测试为阴性的对象被称为“真阴性”。诊断测定的“特异性”为1减去假阳性率，其中，“假阳性”率定义为没有疾病的患者测试为阳性的比例。
可以通过任何手段在样本中检测本发明的生物标志物蛋白质。用于生物标志物检测的优选方法是基于抗体的测定、蛋白质阵列测定、基于质谱(MS)的测定和基于(近)红外光谱的测定。例如，免疫测定包括但不限于使用技术(诸如蛋白质印迹、放射免疫测定、ELISA、“三明治”免疫测定、免疫沉淀测定、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散测定、荧光免疫测定等)的竞争性和非竞争性测定系统。这种测定是常规的并且是本领域中众所周知的。示例性免疫测定在下文简要描述(但不旨在作为限制)。
免疫沉淀方案通常包括在补充有蛋白质磷酸酶和/或蛋白酶抑制剂(例如EDTA、PMSF、抑蛋白酶肽、钒酸钠)的裂解缓冲液(诸如RIPA缓冲液(1％NP-40或Triton X-100、1％脱氧胆酸钠、0.1％SDS、0.15M NaCl、pH 7.2下的0.01M磷酸钠、1％抑肽酶)中裂解细胞群，向细胞裂解物中添加所关注的抗体，在4℃下孵育一段时间(例如1到4小时)，将蛋白质A和/或蛋白质G琼脂糖珠粒添加到细胞裂解物中，在4℃下孵育约一小时或更长时间，在裂解缓冲液中洗涤珠粒，并且使珠粒重新悬浮在SDS/样本缓冲液中。抗体免疫沉淀特定抗原的能力可以通过例如蛋白质印迹分析来评估。本领域的技术人员将了解关于可以被修改以增加抗体与抗原的结合并减少背景(例如，用琼脂糖珠粒预先清除细胞裂解物)的参数。
蛋白质印迹分析通常包括制备蛋白质样本，在聚丙烯酰胺凝胶中对蛋白质样本进行电泳(例如，取决于抗原的分子量进行8％-20％SDS-PAGE)，将蛋白质样本从聚丙烯酰胺凝胶转移到膜(诸如硝酸纤维素、PVDF或尼龙)上，在封闭溶液(例如含3％BSA的PBS或脱脂牛奶)中封闭膜，在洗涤缓冲液(例如PBS-Tween 20)中洗涤膜，用在封闭缓冲液中稀释的第一抗体(所关注的抗体)封闭膜，在洗涤缓冲液中洗涤膜，用在封闭缓冲液中稀释的偶联到酶促底物(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)或放射性分子(例如32P或125I)的第二抗体(其识别第一抗体，例如抗人抗体)封闭膜，在洗涤缓冲液中洗涤膜，并检测抗原的存在。本领域的技术人员将了解关于可以被修改以增加检测到的信号并减少背景噪声的参数。
ELISA通常包括制备抗原(即所关注的生物标志物蛋白质或其片段)，用抗原涂布96孔微量滴定板的孔，向孔中添加偶联到可检测化合物(诸如酶促底物(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)的所关注的抗体，并孵育一段时间，并检测抗原的存在。在ELISA中，所关注的抗体不必偶联到可检测化合物；相反，可以将偶联到可检测化合物的第二抗体(其识别所关注的抗体)添加到孔中。此外，代替用抗原涂布孔，可以将抗体涂布到孔中。在该情况下，在将所关注的抗原添加到涂布的孔中之后，可以添加偶联到可检测化合物的第二抗体。本领域的技术人员将了解关于可以被修改以增加检测到的信号的参数以及本领域中已知的其他ELISA变型。
由于使用了多种标志物，因此在本发明的过程的第二阶段中，基于这些生物标志物的联合浓度确定阈值。该阈值确定对象是否被分类为患有轻度牙周炎或重度牙周炎。本发明反映了可以基于如上文所指示的生物标志物的组合的测量以足够的准确性来检测作为轻度或重度的牙周炎的见解。
本发明的方法的第二阶段包括确定反映针对所述蛋白质测量的联合浓度的测试值。联合浓度值可以是通过输入如所确定的浓度并对这些值进行算术运算而获得的任何值。例如，该算术运算可以是浓度的简单加法。该算术运算还可以涉及将每个浓度乘以反映这些浓度的所需权重的因子，并且然后将结果相加。该算术运算还可以涉及将浓度彼此相乘、或以下项的任何组合：相乘、除法、减法、乘幂和加法。该算术运算可以进一步涉及将浓度提高到某种程度。
将所得联合浓度值与阈值进行比较，该阈值以相同的方式反映与重度牙周炎的存在相关联的联合浓度。比较允许评估测试值是否指示在进行唾液测试的对象中是否存在重度牙周炎或轻度牙周炎。
阈值例如可以是基于针对与重度牙周炎的存在相关联的参考样本中(即，诊断为患有重度牙周炎的对象中)针对相同蛋白质所确定的浓度以相同方式获得的联合浓度值。通常，从而，反映相同或更高联合浓度的值指示受测试的对象的重度牙周炎的存在。类似地，反映受测试的牙周炎对象的唾液中较低联合浓度的值指示牙周炎为轻度或中度(即，非重度)。然而，应理解，也可以计算阈值(例如，通过使用负乘数)，使得指示重度牙周炎的测试值将低于阈值，并且指示轻度牙周炎的测试值将高于阈值。
阈值还可以基于测量样本的集合中的本生物标志物蛋白质的浓度来确定，这些样本包括已知诊断为重度牙周炎和非重度(轻度和/或中度)牙周炎的患者。从而，可以对测量到的浓度值进行统计分析(可能包括机器学习方法)，从而允许以期望的敏感性和特异性来区分被分类为患有轻度或中度牙周炎的对象和被分类为患有重度牙周炎的患者。由此，可以获得期望的阈值。基于该阈值，可以对待测试样本进行相同的浓度测量，并且然后以与获得阈值相同的方式处理浓度值，以便确定可以将阈值进行比较的联合浓度值，因此允许将受测试的样本分类为患有轻度或重度牙周炎。
在令人感兴趣的实施例中，以如下分数形式获得联合浓度值。数值(例如以ng/ml为单位的蛋白质浓度值)被分配给每个测量，并且这些值以线性或非线性组合使用以计算介于零与一之间的分数。在如上所述基于对象集合来确定阈值的情况下，通常用将联合浓度作为输入的sigmoid函数来计算介于0与1之间的分数(如进一步所示)。
当分数超过某个阈值时，方法指示对象患有重度牙周炎。阈值可以基于期望的敏感性和特异性来选择。
应理解，根据本发明，在对对象执行‘轻度或重度牙周炎分类’时，这是对怀疑患有牙周炎的对象执行的。这可以基于例如先前执行的牙周炎诊断，尽管可能无法区分其范围，或可以基于对象的口腔健康状况记录而怀疑。然而，生物标志物测量的第一阶段(即测量HGF、MMP8和MMP9的浓度)也可以用于评估对象是否事实上患有牙周炎，以及所述对象是否是属于第一聚类的患者。
本领域公认的临床定义基于以下内容：
牙龈指数(GI)
将基于评级为0到4的尺度的Lobene改良牙龈指数(MGI)记录全口牙龈指数，其中：
-0＝没有炎症，
-1＝轻度炎症；颜色略有变化，但任何部分(并非整个边缘或乳头状牙龈单元)的纹理变化很小，
-2＝轻度发炎；但涉及整个边缘或乳头状单元，
-3＝中度发炎；边缘或乳头状单元的发亮、发红、水肿和/或肥大，
-4＝重度炎症；边缘或乳头状牙龈单元明显发红、水肿和/或肥大、自发性出血、充血或溃疡]。
探查深度(PD)
将使用手动UNC-15牙周探针将探查深度记录到最接近的mm。探查深度是从探针尖端(假定位于牙周袋的底部处)到游离龈缘的距离。
牙龈萎缩(REC)
将使用手动UNC-15牙周探针将牙龈萎缩记录到最接近的mm。牙龈萎缩是从游离龈缘到釉牙骨质界的距离。牙龈萎缩将指示为正数，并且牙龈过度生长将指示为负数。
临床附着丧失(CAL)
临床附着丧失将计算为每个部位处的探查深度+萎缩的总和。
探查出血(BOP)
探查后，将在探查时评估每个部位的出血，如果在探查的30秒内发生出血，则将为该部位分配1分，否则，将分配0分。
所得对象组(患者组)定义如下，由此轻度-中度牙周炎组和重度牙周炎组与本发明相关：
-健康组(H)：所有部位中的PD≤3mm(但在最后站立的磨牙远端处将允许最多四个4mm的牙周袋)，没有牙间隙附着丧失的部位，≤10％部位中的≥2.0的GI，％BOP分数≤10％；
-牙龈炎组(G)：在>30％的部位中GI>3.0，无牙间隙附着丧失的部位，无PD>4mm的部位，％BOP分数>10％；
-轻度-中度牙周炎组(MP)：在≥8颗牙齿时牙间隙PD为5-7mm(相当于大约2-4mmCAL)，％BOP分数>30％
-重度牙周炎组(AP)：在≥12颗牙齿时牙间隙PD为≥7mm(相当于大约≥5mmCAL)，％BOP分数>30％
在实施例中，本发明的方法利用如图1中示意性表示的系统。系统可以是具有整合在其中的各种设备组件(单元)的单个装置。系统还可以具有作为单独装置的其各种组件或这些组件中的一些。图1中所示的组件是测量设备(A)、图形用户界面(B)和计算机处理单元(C)。
如上所述，本发明的系统包括到界面的数据连接，由此界面本身可以是系统的一部分或可以是远程界面。远程界面是指使用不同的装置(最好是手持装置(诸如智能手机或平板电脑))以用于提供实际界面的可能性。在这种情况下，数据连接最好将涉及无线数据传输，诸如通过Wi-Fi或蓝牙，或通过其他技术或标准。
测量设备(A)被配置为例如通过将唾液滴放在药筒(A1)上来容纳一个或多个样本，该药筒可以插入到设备(A)中。设备可以是能够从同一样本中确定适用蛋白质的浓度的现有设备。如上所述，这可以指对在本发明的系统中实施的方法的两个阶段中可能涉及的所有七种蛋白质的测量。该设备也可以指不同的单元，每个单元被配置为确定所涉及的蛋白质生物标志物的三个不同集合的任何一个(即：[HGF、MMP8、MMP9]、[IL1-β、IL6、胶原端肽]和[HGF、TIMP1])。
处理单元(C)从部分(A)接收蛋白质浓度的数值。单元(C)设置有软件(通常是嵌入式软件)，从而允许其实施本发明的方法的两个阶段。针对第一阶段，这引起与聚类中心进行的比较。
例如，如果新患者的生物标志物读数如下：
患者
计算出患者P1的读数与聚类C1和C2之间的距离。存在各种距离度量，但是在本公开中，示例使用Euclidean距离。
P1与C1之间的距离：
P1与C2之间的距离：
如果d(P1,C1)≤d(P2,C2)，则P1属于C1。类似地，如果d(P1,C1)＞d(P2,C2)，则P1属于C2。
可以如图4中描绘与聚类中心的该比较。在此，单个样本Q(在此：X、Y、Z作为说明)需要分配给聚类。存在3个选项：
如果距离A-Q＜距离B-Q，则聚类C1：点X
如果距离A-Q＞距离B-Q，则聚类C2：点Y
如果距离A-Q＝距离B-Q，则不确定：点Z(注意：此处分配给C1)。
针对第二阶段，单元C被配置为计算介于0与1之间的分数(S)。软件进一步包括阈值(T)的数值。如果计算值(S)超过(T)，则单位(C)将向GUI(B)输出‘高级牙周炎’的指示(I)，否则将输出‘轻度牙周炎’。另一实施例可以使用(S)的特定值来指示确定性，利用确定性进行指示(I)。这可以是可能性分数，由此0.5是可能的阈值，并且例如分数S＝0.8将指示重度牙周炎的可能性。令人感兴趣的选项是以下情况：
基于分数S，人们可以直接指示确定性，即S＝0.8意味着重度牙周炎的确定性为80％；
-基于分数S，人们可以做出二进制或三级指示：
-S<T->轻度牙周炎，S≥T->重度牙周炎；
-S<R1->轻度牙周炎，R1≤S<R2->不确定，
-S≥R2->重度牙周炎；
另外，可以对这种二进制或三次指示附加确定性。该确定性将由分数S与(多个)所选阈值的距离(T,R1,R2)确定。
分数的特定计算可以例如通过应用以下公式的sigmoid函数来实施：
其中，N是所使用的蛋白质/生物标志物的数量。c0、c1等是系数(数值)，并且B1、B2等是相应的蛋白质浓度。
系数的确定可以通过训练程序来完成：
-选择N1个患有重度牙周炎的对象和N2个患有轻度牙周炎的对象。
没有轻度牙周炎的对象被认为得分为S＝0，患有重度牙周炎的对象被认为得分为S＝1。
-如上所述，从每个对象中取样并确定生物标志物组合的蛋白质浓度。
-在蛋白质浓度与分数之间执行逻辑回归。
*其他回归或机器学习方法(线性回归、神经网络、支撑向量机、逻辑回归)可用于训练分类器，该分类器基于蛋白质浓度预测对象是否患有牙龈炎或具有健康的口腔状况。
参照前文提到的系统，在另一方面，本发明还提供一种用于将人类对象分类为患有轻度牙周炎或重度牙周炎的系统。系统包括
-检测装置，其被配置为在对象的口腔液样本中测量生物标志物肝细胞生长因子(HGF)、基质金属蛋白酶8(MMP8)、基质金属蛋白酶9(MMP9)、白介素-1β(IL1β)、白介素-6(IL6)、胶原端肽和金属肽酶抑制剂1(TIMP1)的浓度；
-一个或多个处理单元，其被配置为从对象的口腔液样本中的生物标志物的测量浓度确定分类结果；
可选地，数据连接，该数据连接允许将从一个或多个处理单元获得的结果导向到能够呈现信息的界面，特别是图形用户界面，所述界面是系统的一部分或远程界面；
如上所述，蛋白质检测手段是已知的，并且对于技术人员而言是容易获得的。通常，提供一个或多个用于在其中容纳对象的口腔样本的容器，该容器设置有检测装置。可选界面(或到远程界面的数据连接)具体地是能够显示信息的图形用户界面(GUI)；GUI是一种用户界面，其允许用户通过图形图标和可视指示符(诸如辅助符号)而不是基于文本的用户界面、键入的命令标签或文本导航(在本发明中这种界面均不被排除)来与电子设备进行交互；GUI是众所周知的，并且通常用于手持移动设备(诸如MP3播放器、便携式媒体播放器、游戏设备、智能手机以及较小的家庭、办公室和工业控件)中；如所述，还可以可选地选择界面，以便能够输入信息，诸如对象的年龄、性别、BMI(身体质量指数)；
处理器能够并且适于从对象的口腔样本中的生物标志物的集合的检测到的浓度中确定诊断结果，该诊断结果包括对象所属的聚类的指示以及在第二阶段中，对象是否被分类为患有轻度牙周炎或重度牙周炎。
本发明还(单独或作为前文提到的系统的一部分)提供一种用于确定唾液中牙周炎的生物标志物的浓度的试剂盒，试剂盒包括七种检测试剂，每种检测试剂针对不同的生物标志物，其中，检测试剂能够分别结合HGF、MMP8、MMP9、IL1-β、IL6、胶原端肽和TIMP1，并且其中，试剂盒被配置为以分别处理所述生物标志物的三个不同集合的浓度，即，包括HGF、MMP8和MMP9的第一集合，包括IL1-β、IL6和胶原端肽的第二集合，以及包括TIMP1和HGF的第三集合。如上文参照本发明的方法所论述，试剂盒可以包括用于生物标志物的三个单独集合的检测试剂的单独集合，或用于所涉及的所有生物标志物的检测试剂的一个集合。在后一种情况下，处理单元被配置为以便处理浓度测量的结果，以便反映生物标志物的相关集合。
优选地，所述试剂盒包括固体支持物，诸如芯片、微量滴定板或包括所述检测试剂的珠粒或树脂。在一些实施例中，试剂盒包括质谱探针，诸如ProteinChipTM。
试剂盒还可提供用于未结合的检测试剂或所述生物标志物的特异性的洗涤溶液和/或检测试剂(三明治型测定)。
本发明还提供一种基于来自患者的口腔液样本中蛋白质的浓度诊断怀疑患有牙周炎的人类患者是否患有轻度牙周炎或重度牙周炎的方法，方法包括：
-在人类患者的口腔液样本中测量蛋白质HGF、MMP8和MMP9的浓度；
-将测量结果与通过以下方式获得的聚类中心进行比较以便确定针对对象的测量结果是否符合第一聚类或第二聚类：(i)确定已知患有牙周炎的一组患者的口腔液样本中的蛋白质HGF、MMP8和MMP9的浓度；(ii)对针对所述患者所获得的结果进行聚类技术，以便获得两个聚类，即，定义的第一聚类和未定义的第二聚类；
-在对象符合第一聚类的情况下，对所述对象的口腔液样本进行蛋白质浓度的进一步测量，所述蛋白质包括IL1-β、IL6和胶原端肽，从而获得反映针对所述蛋白质而测量的联合浓度的测试值；
-在对象符合第二聚类的情况下，可选地对所述对象的口腔液样本进行TIMP1浓度的进一步测量，从而获得反映针对所述TIMP1和较早测量的HGF浓度而测量的联合浓度的测试值；
-将获得的测试值与以相同方式反映与重度牙周炎相关联的联合浓度的阈值进行比较，以便评估结果是否指示所述对象的轻度牙周炎或重度牙周炎。
可选地，该方面的方法包括进一步治疗患者的牙周炎的步骤。该可选的治疗步骤可包括施用已知的治疗剂或牙科程序，或治疗剂与牙科程序的组合。已知的治疗剂包括施用含抗菌剂，诸如漱口剂、芯片、凝胶或微球。用于治疗牙周炎的典型抗微生物剂是洗必泰。其他治疗剂包括抗生素(通常是口服抗生素)以及酶抑制剂，诸如强力霉素。已知的非外科手术治疗程序包括刮牙和牙根平整(SRP)。已知的外科手术程序包括外科手术牙周袋减少、皮瓣手术、牙龈移植或骨移植。
本发明进一步提供一种检测蛋白质HGF、MMP8和MMP9并分别检测(i)蛋白质IL1-β、IL6和胶原端肽或(ii)蛋白质TIMP1的方法，其包括：
(a)从人类患者获得口腔液样本；以及
(b)通过使样本与用于结合所述蛋白质的检测试剂接触并检测每种蛋白质与检测试剂之间的结合来检测样本中是否存在蛋白质。
将参照以下非限制性示例进一步说明本发明。
示例
在针对58个对象的临床研究中，有31个患者被诊断为患有轻度牙周炎，并且27个患有重度牙周炎。K平均值聚类被用于使用HGF、MMP8和MMP9对所有对象进行聚类。注意，k在2到10之间变化。针对每个k，计算出所有58个对象的平均轮廓值。
轮廓系数组合了凝聚力和分离力两者(请参阅https://cs.fit.edu/～pkc/ classes/ml-internet/silhouette.pdf)。以下步骤解释了如何计算单个点的轮廓系数，是由以下三个步骤组成的过程。
1.针对第i个对象，计算其与其聚类中的所有其他对象的平均距离。将该值称为ai。
2.针对第i个对象和不包含该对象的任何聚类，计算对象与给定聚类中的所有对象的平均距离。找到这种值相对于所有聚类的最小值；将该值称为bi。
3.针对第i个对象，轮廓系数识别si＝(bi–ai)/max(ai,bi)。
轮廓系数的值可以在-1与1之间变化。负值是不希望的，因为这对应于ai(与聚类中的点的平均距离)大于bi(与另一聚类中的点的最小平均距离)的情况。我们希望轮廓系数为正(ai<bi)，并且使ai尽可能接近0，因为当ai＝0时系数假定其最大值为1。
聚类的平均轮廓系数可以通过简单地取属于该聚类的点的轮廓系数的平均值来计算。可以通过计算所有点的平均轮廓系数来获得对聚类的优度的总体度量。
图2图示了当k的值从2变为10时的平均轮廓值。该图清楚地示出，当k＝9时达到了最大轮廓值。在图3中示出了k＝9的轮廓图。
轮廓图图示了，很好地定义了聚类1，因为其平均值非常接近1。为了定义聚类1，需要满足以下两个条件：
-所选聚类应具有最高的平均轮廓值
-所选聚类应包含所有数据点的至少40％(在该特定示例中，58个患者中有42个(即72％)落在聚类1内)
然而，其他点并没有形成任何清楚和明显的聚类。因此，没有落在聚类1中的点都被放置在聚类2中。聚类2被称为未定义聚类。
一旦确定了聚类，接下来的步骤是识别患者属于哪个聚类，并且然后执行分类，以便使用适当的生物标志物清单来评估患者是否患有轻度或重度牙周炎。下文描述了这些步骤的细节：
阶段1：测量HGF、MMP8和MMP9(或这些的任何组合)的浓度。获得的读数用于确定患者属于聚类C1还是聚类C2。
阶段2：根据阶段1中的患者属于聚类C1还是聚类C2，测量某些蛋白质的浓度
如果患者属于聚类C1，则可用于对轻度/重度牙周炎进行分类的前三种蛋白质生物标志物是：IL1-β、IL6和胶原端肽。
下表示出了聚类1(基于对42个患者的临床研究)使用上述的前三种蛋白质生物标志物的不同组合的准确性(accuracy)结果：
(注意：基于混淆矩阵，
)
因此，如果患者属于聚类1，则IL1-β、IL6、胶原端肽是以88.1％的准确度允许患者被识别为轻度牙周炎或重度牙周炎的生物标志物。类似地，仅使用IL6和胶原端肽产生78.6％的准确性。
如果患者属于聚类C2，则可用于对轻度/重度牙周炎进行分类的前三种蛋白质生物标志物是：TIMP1和HGF。
下表示出了聚类2(基于对16个患者的临床研究)使用上述的前三种蛋白质生物标志物的不同组合的准确性结果：
注意，IL6_d是指在治疗患者之前和之后获得的IL6读数的差。如可看出，选择TIMP1和HGF作为将要确定的生物标志物，就无需考虑(更复杂)确定两个测量值之间的差异。
虽然已经在附图和前面的描述中详细图示了并且描述了本发明，但是这种图示和描述被认为是说明性的或示例性的而不是限制性的；本发明不限于所公开的实施例。
例如，可以以不同单位提供用于不同生物标志物的检测试剂。或，方便地，本发明的试剂盒可以包括用于第一阶段中的用于蛋白质生物标志物的检测试剂的固定集合，即HGF、MMP-8和MMP-9，以及包括用于第二阶段中的两个集合中的任一个或两个的检测试剂的灵活(单独)模块。在另一备选方案中，单个单独的模块可用于所有四个第二阶段生物标志物。
通过学习附图、公开内容和所附权利要求书，本领域的技术人员在实践要求保护的本发明时可以理解和实现所公开的实施例的其他变型。在权利要求书中，措辞“包括”不排除其他元件或步骤，并且不定冠词“一”或“一个”不排除多个。在相互不同的从属权利要求中叙述本发明的某些特征的事实并不指示不能有利地使用这些特征的组合。权利要求书中的任何附图标记都不应该被解释为是对范围的限制。
总之，我们在此公开了一种用于评估患有牙周炎的人类对象是否患有轻度牙周炎或重度牙周炎的系统和体外方法。系统和方法基于见解，以将聚类技术应用于患者数据的参考集合，并且然后进一步区分将要应用的生物标志物的集合。基于生物标志物肝细胞生长因子(HGF)、基质金属蛋白酶8(MMP8)和基质金属蛋白酶9(MMP9)确定聚类。对象的实际分类基于生物标志物的两个集合中的任一集合的浓度的测量进行。针对一个聚类，这些生物标志物是白介素-1β(IL1β)、白介素-6(IL6)和胶原端肽。针对另一聚类，这些生物标志物是HGF和金属肽酶抑制剂1(TIMP1)。
Claims (16)
1.一种将人类对象分类为患有轻度牙周炎或重度牙周炎的系统，所述系统包括：
-检测装置，被配置为在所述对象的口腔液的样本中测量生物标志物肝细胞生长因子(HGF)、基质金属蛋白酶8(MMP8)、基质金属蛋白酶9(MMP9)、白介素-1β(IL1β)、白介素-6(IL6)、胶原端肽和可选的金属肽酶抑制剂1(TIMP1)的浓度；
-一个或多个处理单元，被配置为从所述对象的口腔液样本中的生物标志物的所测量的所述浓度确定分类结果；
其中所述系统被配置为在第一阶段中测量包括HGF、MMP8和MMP9的生物标志物集合的所述浓度，以便获得第一阶段浓度的测量结果，并且其中处理单元被配置为处理所述第一阶段浓度，以便呈现是否在第二阶段中测量包括IL1-β、IL6和胶原端肽的生物标志物集合的所述浓度的结果，由此所述处理单元可选地被配置为处理所述第一阶段浓度，以便备选地指示在第二阶段中测量TIMP1的所述浓度，其中所述系统被配置为获得第二阶段浓度的测量结果，并且由此处理单元被配置为处理所述第二阶段浓度，以便呈现轻度牙周炎或重度牙周炎的分类结果。
2.根据权利要求1所述的系统，其中所述人类患者被怀疑患有牙周炎。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的系统，包括一个或多个用于在其中容纳所述对象的所述口腔液的样本的容器，所述一个或多个容器设置有所述检测装置，所述检测装置被配置为在所述样本中测量所述生物标志物的所述浓度。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的系统，进一步包括：
-用户界面，用于向用户呈现指示，所述界面是所述系统的一部分或远程界面；以及
-数据连接，在所述一个或多个处理单元与所述用户界面之间，以用于将所述指示从所述处理器传输到所述用户界面。
5.根据任一前述权利要求所述的系统，包括单个容器，所述单个容器被配置为容纳口腔液样本，并且设置有检测装置，所述检测装置被配置为测量所述生物标志物中的所有生物标志物的所述浓度。
6.根据任一前述权利要求所述的系统，包括第一容器、第二容器和第三容器，第一容器被配置为容纳口腔液样本，并且设置有检测装置，所述检测装置被配置为测量HGF、MMP8和MMP9的所述浓度；所述第二容器被配置为测量IL1-β、IL6和胶原端肽的所述浓度；所述第三容器被配置为测量HGF和TIMP-1的所述浓度。
7.根据权利要求6所述的系统，其中所述第二容器和第三容器被表示为单独的模块，所述模块中的任一个模块能够被插入到所述系统中。
8.根据前述权利要求中任一项所述的系统，其中所述处理器能够借助于基于因特网的应用程序来起作用。
9.一种用于评估人类对象是否患有轻度牙周炎或重度牙周炎的体外方法，其中所述方法包括
-在来自所述对象的口腔液的样本中测量所述蛋白质HGF、MMP8和MMP9的所述浓度：
-将所述测量结果与通过以下方式获得的聚类中心进行比较，以便确定针对所述对象的所述测量结果是否符合第一聚类或第二聚类：(i)确定已知患有牙周炎的一组患者的口腔液样本中的所述蛋白质HGF、MMP8和MMP9的所述浓度；(ii)对针对所述患者获得的所述结果进行聚类技术，以便获得两个聚类，即，定义的所述第一聚类和未定义的所述第二聚类；
-在对象符合所述第一聚类的情况下，对所述对象的口腔液的样本进行蛋白质浓度的进一步测量，所述蛋白质包括IL1-β、IL6和胶原端肽，从而获得反映针对所述蛋白质而测量的联合浓度的测试值；
-在对象符合所述第二聚类的情况下，可选地对所述对象的口腔液的样本进行所述TIMP1浓度的进一步测量，从而获得反映针对所述TIMP1和较早测量的所述HGF浓度而测量的联合浓度的测试值；
-将获得的所述测试值与以相同方式反映与重度牙周炎相关联的所述联合浓度的阈值进行比较，以便评估所述结果是否指示所述对象的轻度牙周炎或重度牙周炎。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述人类患者被怀疑患有牙周炎。
11.根据权利要求9或10所述的方法，其中所述阈值是基于针对所述蛋白质在与重度牙周炎的存在相关联的参考样本中所确定的所述浓度。
12.一种用于确定唾液中用于牙周炎的生物标志物的浓度的试剂盒，所述试剂盒包括七种检测试剂，每种检测试剂针对不同的生物标志物，其中所述检测试剂能够分别结合HGF、MMP8、MMP9、IL1-β、IL6、胶原端肽和TIMP1，并且，其中所述试剂盒被配置成以分别处理所述生物标志物的三个不同集合的所述浓度，即，包括HGF、MMP8和MMP9的第一集合，包括IL1-β、IL6和胶原端肽的第二集合，以及包括TIMP1和HGF的第三集合。
13.根据权利要求12所述的试剂盒，其中所述检测试剂被包含在固体支持物上，诸如芯片、微量滴定板、珠粒或树脂。
14.一种基于来自患者的口腔液的样本中蛋白质的浓度来诊断人类患者是否患有轻度牙周炎或重度牙周炎的方法，所述人类患者被怀疑患有牙周炎，所述方法包括：
-在所述人类患者的口腔液的样本中测量所述蛋白质HGF、MMP8和MMP9的所述浓度；
-将所述测量结果与通过以下方式获得的聚类中心进行比较，以便确定针对所述对象的所述测量结果是否符合第一聚类或第二聚类：(i)确定已知患有牙周炎的一组患者的口腔液样本中的所述蛋白质HGF、MMP8和MMP9的所述浓度；(ii)对针对所述患者获得的所述结果进行聚类技术，以便获得两个聚类，即，定义的所述第一聚类和未定义的所述第二聚类；
-在对象符合所述第一聚类的情况下，对所述对象的口腔液的样本进行蛋白质浓度的进一步测量，所述蛋白质包括IL1-β、IL6和胶原端肽，从而获得反映针对所述蛋白质而测量的联合浓度的测试值；
-在对象符合所述第二聚类的情况下，可选地对所述对象的口腔液的样本进行所述TIMP1浓度的进一步测量，从而获得反映针对所述TIMP1和较早测量的所述HGF浓度而测量的联合浓度的测试值；
-将所获得的所述测试值与以相同方式反映与重度牙周炎相关联的所述联合浓度的阈值进行比较，以便评估所述结果是否指示所述对象的轻度牙周炎或重度牙周炎。
15.一种检测蛋白质HGF、MMP8和MMP9并分别检测(i)蛋白质IL1-β、IL6和胶原端肽或(ii)蛋白质TIMP1的方法，包括：
(a)从人类患者获得口腔液样本；以及
(b)通过使所述样本与用于结合所述蛋白质的检测试剂接触并检测每种蛋白质与所述检测试剂之间的结合来检测所述样本中是否存在所述蛋白质。
16.一种蛋白质HGF、MMP8和MMP9以及(i)蛋白质IL1-β、IL6和胶原端肽或(ii)蛋白质TIMP1在人类患者的口腔液样本或人类患者的样本中作为生物标志物的用途，以用于评估所述患者是否患有轻度牙周炎或重度牙周炎。
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