CN111289541A - 一种利用近场微波显微装置对细胞成像的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用近场微波显微装置对活体细胞进行成像的方法，属于近场微波特性显微领域。这种方法对比传统的活体细胞成像方法具有对成像样品细胞无添加剂、无损害、快速成像的特点；成像技术利用了微波的穿透特性，揭示样品本征特性的特点，能够通过简单方便地操作实现活体细胞成像。此方法的装置包括被配置为接收来自样品微扰近场回波信号的探针，耦合到探针的四分之一波长同轴谐振腔被配置为放大来自样品微扰信号产生的近场回波信号，活体维持装置被配置为维持细胞样品的活性，由成像分析单元对来自信号处理器所采集到相应的参数进行分析并反演绘制参数图像。

Description

一种利用近场微波显微装置对细胞成像的方法
技术领域
本发明属于近场微波特性显微领域。更具体涉及到一种能够用于活体细胞成像的方法。
背景技术
在活细胞内生物单分子尺寸下研究各种各样的生物化学和遗传尤其重要。这样的研究意味着要在不影响细胞正常生命周期活动的前提下实现单分子显微探测，在众多单分子显微技术中人们首先想到了光学的方法。其中，当前发展潜力最大的是荧光成像法，因其有灵敏度高且成像“可视化”、形貌可见等优点。然而，活体细胞自身不仅具有高散射性，而且细胞内含有大量只发荧光物质，这些都影响了荧光成像图像的质量。所以，荧光成像法在图像信噪比和成像速度上受到影响。虽然近年来发展了一些包括转盘式共聚焦显微术(SDCM)、全内反射荧光显微术(TIRFM)和荧光共振能量转移技术(FRET)在内的单分子荧光成像技术，但是仍不满足应用于活细胞毒性小的无损检测技术的发展需求。不管使用哪种成像技术，考虑活体细胞的健康性是很非常重要的。细胞很容易发生光损伤，特别是荧光团存在的情况下，荧光团在光漂白的情况下会产生自由基损害细胞组织，这就是荧光蛋白质具有毒性的原因。所以，在众多使用于活体细胞成像的技术中，应该考虑到三种因素：探测灵敏度、图像质量、样品的生存能力。
另一方面，成像中用到的显微镜也是成像技术中一个很关键的因素。显微镜是研究微观物体结构和特征的工具。它通过将某种波动能量作用于物体，然后探测带有物体信息的载波来重构物体某种特征的空间信息。经过长期的发展，远场显微镜及其相应的理论己经日臻成熟，并在科技的发展中起了至关重要的作用。然而，由于受到阿贝衍射现象的影响，远场显微镜不能分辨出物体尺寸小于二分之一载波波长的细节。于是，人们又发展了近场显微镜。近场显微镜突破了衍射极限，可以分辨出小于二分之一载波波长的物体。在光学近场显微镜中，已经能观测到最短光波长的十分之一以下的物体尺寸，但是可见光仅限于物体表面特征。而是在微波频段研究物体本征特性的一种测量方法。与远场显微镜相同，近场微波显微镜是用波动来探测物体，然后通过载波带的信息来重构物体。近场扫描显微镜通过探针探测到来自样品微扰而产生的谐振频率偏移、品质因数变化、反射系数变化，可以推测出样品的许多本征性质，如，样品不同微小区域内的介电常数，导电系数，压电系数等。因而，近场微波显微镜被用于研究导体材料、半导体材料、介质材料、及生物材料的局部微观特性。
在现有报道中，未见到有使用近场微波技术用作活体细胞成像的应用及方法，仅在医学检测成像技术领域中，报道了一种微波近场探测空间内的介电常数差异分布检测方法，为早期乳腺肿瘤微波成像提供直观和有效的三维信息。一方面该专利方案在测量点与被测目标3λ～5λ的距离内进行测量，而根据近场微波显微理论，近场显微术的基本思想是要将远小于波长的“点”源或“点”探测器控制在离样品足够近的距离之内，说明此技术方案严格意义上没有利用近场微波技术进行成像。另一方面，该技术方案对乳腺癌成像技术是根据乳腺癌组织和正常乳腺组织的介电常数的差异，通过分析回波的特性，进而确定探测目标的特性，并通过对多个探测点的数据进行联合分析，反演计算得出乳腺内部的介电常数特性分布，进而显示成像的技术。从分辨率上来看，该技术方案检测出6mm左右的乳腺肿瘤团，这仅用于确定乳腺癌的大小形状及位置，而没有对单个细胞进行成像，因为该技术方案的分辨率远远达不到微米左右的量级。而本发明的技术方案中，探测器和“源”与样品的距离严格控制在一个波长内扫描，因此检测到的回波为隐失波，这是远场探测所检测不到的回波，远场显微术的分辨能力受波动衍射极限的制约，对小于1/2波长的细节，远场显微术无能为力，本发明专利分辨率可达到微米以下的高分辨率。
发明内容
本发明的目的在于，克服现有技术的不足，提供一种对比传统活体细胞成像方法具有对成像样品细胞无添加剂、无损害的快速扫描成像方法。本发明利用近场微波显微技术，利用了微波的穿透特性，揭示样品本征特性的特点，能够通过活体细胞样品对扫描参数产生的微扰简单而方便地操作实现活体细胞本征特性的成像。
本发明的目的是通过下述方式实现的：
一种利用近场微波显微装置对细胞成像的方法；其步骤包括：
步骤1：由微波发生器产生小功率微波信号，经过参数测试装置分成两路信号，一路作为参考信号直接输入信号处理器，另一路通过四分之一波长同轴谐振腔把微波信号耦合到金属探针尖端处；
步骤2：通过所述金属探针发射微波信号照射待成像细胞样品，所述金属探针尖端距离待成像细胞样品的距离小于或等于一个波长，通过金属探针发射的微波信号频率范围为2.45-20GHz；
步骤3：通过所述金属探针接收待成像细胞样品近场回波信号，该信号包括反射信号和透射信号，采用四分之一波长同轴谐振腔对接收到的近场回波信号进行放大处理，得到携带待成像细胞样品信息的扫描信号；
步骤4：通过滤波装置把部分回波信号的噪声滤除，采用信号处理器对去噪后的扫描信号和参考信号进行计算处理，得到待成像细胞样品的散射参数，包括四分之一波长同轴谐振腔的谐振频率、品质因数和金属探针的反射系数；在信号处理器中，由于接收到的信号是电场和磁场信号，由方程
Figure BDA0001740344660000031
和
Figure BDA0001740344660000032
求得一些列的K系数，采用Kr表示，其中▽2表示求二阶偏导数，
Figure BDA0001740344660000033
分别为电场矢量和磁场矢量,再通过
Figure BDA0001740344660000034
求得谐振频率；在四分之一波长同轴谐振腔中，由于固有品质因数
Figure BDA0001740344660000035
如果探针加载样品后，有载品质因数
Figure BDA0001740344660000036
Figure BDA0001740344660000037
其中δ为同轴谐振腔金属材料的趋肤深度，a为内导体半径，b为外导体半径，λr为谐振波长，k定义为腔体和外界负载之间的耦合程度，Qc为同轴谐振腔与负载样品的耦合品质因数；反射系数为反射信号与参考信号的幅度相位之比值，透射系数为透射信号与参考信号的幅度相位之比值；
步骤5：移动所述金属探针，采用步骤1到步骤4的方法逐点扫描，获取待成像细胞样品不同位置的散射参数，扫描的方式采用轻敲模式扫描，即在采集信号时，每个扫描点探针近距离与样品发生相互作用，在探针移动时，探针与样品的距离足够远(探针与样品相互作用足够小)，这样的方式能减少线性扫描中探针与样品作用速度不及扫描速度导致图像中形成的扫描线伪影；
步骤6：采用步骤5获得随细胞样品分布的谐振频率品质因数或反射系数或透射系数对待成像细胞样品进行成像。
进一步的，所述步骤5中逐点扫描的步长为4-5um。
进一步的，采用局部加权回归的方法对所述步骤5中得到的细胞样品不同位置散射参数进行处理。
为了得到去噪、扫描线伪影被去除，并且更清晰度的图像，得到的散射参数需要通过局部加权回归的方法处理；在细胞样品平面内，因为不同的生物细胞成分具有不同本证电磁特性，且由于微波具有的穿透特性、揭示样品本征特性的特点，得到每个扫描点的散射参数存在差异，利用这样的差异就得到散射参数随空间位置不同的分布，通过绘制这种散射参数分布图即可得到反映细胞样品分布的二维图形，因为微波具有穿透性，实际上散射参数也携带了细胞样品的高度信息，这样也能够绘制出细胞样品分布的三维图像。
一种利用近场微波显微装置对活体细胞成像方法的成像装置，其中包括：带针尖修饰的柔性金属探针、四分之一波长同轴谐振腔、滤波装置、数据采集单元组、三维位移台、成像分析单元、活体维持装置；所述金属探针为尖端处依次包裹有导电黏性材料和柔性材料的探针，使得探针的灵敏度更高，同时柔性材料降低因为探针与样品误触而产生的损坏率，探针用银胶耦合到下述四分之一波长同轴谐振腔(如图3)，并且针尖靠近样品的近场中，被配置为将微波信号施加到细胞样品和接收来自细胞样品的近场回波信号(即倏逝波)；所述探针倒置于被测样品的下方；所述数据采集单元组作用为产生微波信号和根据探测到的微扰近场回波信号提供参数输出；所述数据采集单元组包括：微波发生器、参数测试装置、信号处理器，所述微波发生器输出信号端与所述参数测试装置连接，所述参数测试装置一端与滤波装置双通道连通，用作输出和接收信号；所述参数测试装置输出端与信号处理器连通，用于传输参考信号、反射信号、透射信号；所述三维位移台分别可以作X、Y、Z移动，用于控制耦合有所述探针的四分之一波长同轴谐振腔移动，从而可以操纵探针在样品下方作轻敲模式扫描；所述成像分析单元作用为发出控制指令和对探测到的参数进行反演计算绘制图像；所述活体维持装置作用为维持活体细胞活性的装置。
本发明提出了一种利用近场微波显微装置对活体细胞成像的方法，与传统的荧光细胞成像技术相比，具有以下显著的优势：
第一，这种方法可以对成像活体细胞样品无添加剂，无损害。由于本发明提出的利用扫描近场微波显微装置是倒置在细胞下方，利用微波的穿透性穿透底层玻璃器皿，由于活体细胞的存在对四分之一波长同轴谐振腔产生微弱干扰，利用微扰理论可得到同轴谐振腔随着空间位置的变化而变化的谐振频率、品质因数和反射系数参数，然后反演出相应散射参数绘制参数图像，从而得到活体细胞本征特性的图像。不同于传统的荧光成像法，需要先对活体细胞进行荧光标记，这就会影响到细胞正常的生命活动，甚至由于“毒性”导致出现活体细胞死亡的现象。
第二，这种方法具有操作简单快速扫描成像的特点。与荧光标记法不同，不需要进行染色标记等复杂的操作。另外如果设置的扫描步长足够小，相应近场微波显微装置的分辨率就足够高。由于利用的是近场微波微扰理论，可以突破阿贝衍射现象，不存在远场显微镜不能分辨出小于二分之一载波波长细节的缺点，在扫描过程中，非常小的变化对四分之一波长谐振腔产生的影响也十分明显。这就相当于一个放大器的作用，它把微弱的变化放大成为能够记录变化的参数，从而实现比远场微波成像更高分辨率的成像。
第三，在轻敲模式下，扫描成像时针尖对活细胞样品逐点“敲击”扫描，两者间只有瞬间“接触”，克服了传统扫描模式下因针尖被拖过样品而受到来自与样品之间产生互作用的粘附力、静电力等的影响，这些影响对造成图像拖影，结合探针针尖耦合柔性介质，有效的克服了扫描过程中针尖划伤样品的缺点，适合于柔软或吸附样品的检测，特别适合检测有生命的生物样品。
第四，本发明中得到的近场回波信号为倏逝波，因为该倏逝波携带的信息特征是远场显微装置接收的远场信号不具有的信号特征，从而能提高本发明对细胞的成像精度。
附图说明
图1是本发明所述一种利用近场微波显微装置对活体细胞成像装置的简化结构示意图。附图标记：1、活体维持装置；2、四分之一波长同轴谐振腔；3、三维位移台；4、滤波装置；5、微波发生器；6、参数测试装置；7、信号处理器；8、成像分析单元；9、带针尖修饰的柔性金属探针
图2是本发明所述尖端处包裹导电粘性层和柔性材料层的金属探针示意图。其中：最里层为金属探针；中间层为导电粘性层；最外层为柔性材料层。
图3是本发明用到的四分之一波长同轴谐振腔。
图4利用近场微波显微装置获得动物内皮细胞S11参数图像的俯视图。
图5利用近场微波显微装置获得动物内皮细胞的谐振频率参数图像。
参图1，将培养好的待观测细胞样品放入活体维持装置1中，并且固定好；把四分之一波长同轴谐振腔2固定在位移台3上，谐振腔输入输出端与集成有微波发生器5相连，位移台连接成像分析单元8，该单元可以进行成像分析亦可发出指令控制三维位移台移动，数据采集单元输出端连接成像分析单元。
具体实施方式
利用所述近场微波显微装置对动物内皮细胞进行扫描成像分析
实验一：
(1)将动物内皮细胞通过培养与孵化制成所需样品，注意活细胞的培养环境要针对特定的细胞进行培养，因为要维持细胞的活性条件比较苛刻，稍有异常就会导致活体细胞受损。实验培养时，封装了一定量的动物内皮单细胞层，放置于环境维持装置(即活体维持装置，用于保持细胞的湿度/温度)中，固定好活体维持装置。
(2)在实验室中按照图1、图2、图3所述连接所用设备并接通电源，金属探针的针尖处通过导电粘性材料和柔性材料修饰。
(3)在成像分析单元端通过LabVIEW软件(由美国国家仪器(NI)公司研制开发)给三维位移台发出操作指令，从而操纵金属探针在靠近活体细胞的近场处(距离小于一个波长)作轻敲模式进行逐行逐点面扫描，扫描步长为4.7um，在每个点金属探针与样品作用时，探针上升50um(即金属探针作用时要比金属探针横向移动时更靠近样品)。
(4)由微波发生器发送小功率微波信号，此次使用频率为20GHz的微波信号做实验。这个信号经过参数测试装置分成两路，一路作为参考信号直接传送到信号处理器，另一路信号经过滤波器，由四分之一波长同轴谐振腔(谐振频率为20GHz)耦合到柔性金属探针针尖处，最后作用到待测细胞样品中。
(5)由金属探针接收携带细胞样品信息的近场回波信号(倏逝波)，此信号通过滤波装置滤除干扰信号再传输到参数测试装置，由参数测试装置将得到的近场回波信号分成发射信号和传输信号。
(6)信号处理器响应来自扫描产生的近场回波信号通过计算输出随空间变化的反射参数(S11)。在成像分析单元中，利用得到的参数进行反演计算，在绘制参数图像之前对得到数据利用局部回归加权法得到更精确的参数，去除干扰参数，使得到的绘制的图像拖影不严重，通过MATLAB软件(由美国MathWorks公司出品的商业数学软件)绘制出反应动物内皮细胞的本征特性随空间变化的参数图像，从而得到反应细胞分布的图像，该图像与“可视化”图像不同，不仅能分辨出形貌特征，而且因为记录的参数包括透射近场微波信号和反射近场微波信号，参数携带了样品厚度、样品其他电磁本征特性(如介电常数等)的信息。
(7)如图4所示，由反射参数(S11)绘制出的参数图像即可反应细胞分布的图像，扫描区域300*300um，扫描空间分辨率为4um。从参数图像中可以看出，S11的幅值为-4.74dB～-4.72dB处对应了样品的细胞质，形状为整个细胞的形状；S11的幅值更小的-4.82dB～-4.80dB处对应了样品的细胞核，这是因为细胞核吸收的微波能量比细胞质吸收的微波能量更多，所以反射信号的幅值更小；S11的幅值更大的-4.70dB～-4.66dB处对应了样品不含细胞的培养液分布，这是因为培养液吸收的微波能量比细胞质吸收的微波能量更少，所以反射信号的幅值更大；其他幅值处对应了因为存在细胞破裂细胞质或者细胞核溢出到培养液中所形成的没有明显界限区域或不完整细胞区域。
实验二：
(1)作为对比实验，我们又在实验一的基础上做了实验二。与实验一相比，仅在步骤(4)中改变微波发生器发出微波信号的频率，为2.45GHz，同时更换谐振频率为2.45GHz的四分之一波长同轴谐振腔，扫描步长为4.7um，其他条件不变的，包括样品还是原来的样品。
(2)信号处理器响应来自扫描产生的近场回波信号通过计算输出随空间变化的谐振频率(frequency)，并在成像分析单元中绘制出反应细胞分布的谐振频率参数图像。
(3)如图5所示，由谐振频率(frequency)绘制出反应细胞分布的图像。从图中可以看出，谐振频率fr为2.4473GHz～2.4474GHz范围内对应了细胞质的分布，谐振频率fr在2.4476GHz～2.4478GHz范围内对应了细胞核的分布，谐振频率fr在2.4472GHz～2.4473GHz范围内对应了不含细胞的培养液分布，其他谐振频率fr介于且不同于上述谐振频率，是因为存在细胞破裂细胞质或者细胞核溢出到培养液中所形成的没有明显界限区域或不完整细胞区域。
由实验一和实验二绘制的参数图像可见，因为上述实验用到同一细胞样品，所以由图5和图4反应的动物内皮细胞分布基本吻合。
实验三：
(1)将动物内皮细胞通过培养与孵化制成所需样品，注意活细胞的培养环境要针对特定的细胞进行培养，因为要维持细胞的活性条件比较苛刻，稍有异常就会导致活体细胞受损。实验培养时，封装了一定量的动物内皮单细胞层，放置于环境维持装置(即活体维持装置，用于保持细胞的湿度/温度)中，固定好活体维持装置。
(2)在实验室中按照图1、图2、图3所述连接所用设备并接通电源，金属探针的针尖处通过导电粘性材料和柔性材料修饰。
(3)在成像分析单元端通过LabVIEW软件(由美国国家仪器(NI)公司研制开发)给三维位移台发出操作指令，从而操纵金属探针在靠近活体细胞的近场处(距离小于一个波长)作轻敲模式进行逐行逐点面扫描，扫描步长为5um，在每个点金属探针与样品作用时，探针上升50um(即金属探针作用时要比金属探针横向移动时更靠近样品)。
(4)由微波发生器发送小功率微波信号，此次使用频率为11GHz的微波信号做实验。这个信号经过参数测试装置分成两路，一路作为参考信号直接传送到信号处理器，另一路信号经过滤波器，由四分之一波长同轴谐振腔(谐振频率为11GHz)耦合到柔性金属探针针尖处，最后作用到待测细胞样品中。
(5)由金属探针接收携带细胞样品信息的近场回波信号(倏逝波)，此信号通过滤波装置滤除干扰信号再传输到参数测试装置，由参数测试装置将得到的近场回波信号分成发射信号和传输信号。
(6)信号处理器响应来自扫描产生的近场回波信号通过计算输出随空间变化的反射参数(S11)。在成像分析单元中，利用得到的参数进行反演计算，在绘制参数图像之前对得到数据利用局部回归加权法得到更精确的参数，去除干扰参数，使得到的绘制的图像拖影不严重，通过MATLAB软件(由美国MathWorks公司出品的商业数学软件)绘制出反应动物内皮细胞的本征特性随空间变化的参数图像，从而得到反应细胞分布的图像，该图像与“可视化”图像不同，不仅能分辨出形貌特征，而且因为记录的参数包括透射近场微波信号和反射近场微波信号，参数携带了样品厚度、样品其他电磁本征特性(如介电常数等)的信息。
(7)由品质因数Q绘制出的参数图像即可反应细胞分布的图像，扫描区域300*300um，扫描空间分辨率为5um。

Claims (4)

1.一种利用近场微波显微装置对细胞成像的方法；其步骤包括：
步骤1：由微波发生器产生小功率微波信号，经过参数测试装置分成两路信号，一路作为参考信号直接输入信号处理器，另一路通过四分之一波长同轴谐振腔把微波信号耦合到金属探针尖端处；
步骤2：通过所述金属探针发射微波信号照射待成像细胞样品，所述金属探针尖端距离待成像细胞样品的距离小于或等于一个波长，通过金属探针发射的微波信号频率范围为2.45-20GHz；
步骤3：通过所述金属探针接收待成像细胞样品近场回波信号，该信号包括反射信号和透射信号，采用四分之一波长同轴谐振腔对接收到的近场回波信号进行放大处理，得到携带待成像细胞样品信息的扫描信号；
步骤4：通过滤波装置把部分回波信号的噪声滤除，采用信号处理器对去噪后的扫描信号和参考信号进行计算处理，得到待成像细胞样品的散射参数，包括四分之一波长同轴谐振腔的谐振频率、品质因数和金属探针的反射系数；在信号处理器中，由于接收到的信号是电场和磁场信号，由方程
Figure FDA0001740344650000011
和
Figure FDA0001740344650000012
求得一些列的K系数，采用Kr表示，其中
Figure FDA0001740344650000013
表示求二阶偏导数，
Figure FDA0001740344650000014
分别为电场矢量和磁场矢量,再通过
Figure FDA0001740344650000015
求得谐振频率；在四分之一波长同轴谐振腔中，由于固有品质因数
Figure FDA0001740344650000016
如果探针加载样品后，有载品质因数
Figure FDA0001740344650000017
其中δ为同轴谐振腔金属材料的趋肤深度，a为内导体半径，b为外导体半径，λr为谐振波长，k定义为腔体和外界负载之间的耦合程度，Qc为同轴谐振腔与负载样品的耦合品质因数；反射系数为反射信号与参考信号的幅度相位之比值，透射系数为透射信号与参考信号的幅度相位之比值；
步骤5：移动所述金属探针，采用步骤1到步骤4的方法逐点扫描，获取待成像细胞样品不同位置的散射参数，扫描的方式采用轻敲模式扫描，即在采集信号时，每个扫描点探针近距离与样品发生相互作用，在探针移动时，探针与样品的距离足够远(探针与样品相互作用足够小)，这样的方式能减少线性扫描中探针与样品作用速度不及扫描速度导致图像中形成的扫描线伪影；
步骤6：采用步骤5获得随细胞样品分布的谐振频率品质因数或反射系数或透射系数对待成像细胞样品进行成像。
2.如权利要求1所述的一种利用近场微波显微装置对细胞成像的方法，其特征在于所述步骤5中逐点扫描的步长为4-5um。
3.如权利要求1所述的一种利用近场微波显微装置对细胞成像的方法，其特征在于所述采用局部加权回归的方法对所述步骤5中得到的细胞样品不同位置散射参数进行处理。
4.一种利用如权利要求1所述的近场微波显微装置对活体细胞成像方法的成像装置，其中包括：带针尖修饰的柔性金属探针、四分之一波长同轴谐振腔、滤波装置、数据采集单元组、三维位移台、成像分析单元、活体维持装置；所述金属探针为尖端处依次包裹有导电黏性材料和柔性材料的探针，探针用银胶耦合到下述四分之一波长同轴谐振腔，并且针尖靠近样品的近场中，被配置为将微波信号施加到细胞样品和接收来自细胞样品的近场回波信号；所述探针倒置于被测样品的下方；所述数据采集单元组作用为产生微波信号和根据探测到的微扰近场回波信号提供参数输出；所述数据采集单元组包括：微波发生器、参数测试装置、信号处理器，所述微波发生器输出信号端与所述参数测试装置连接，所述参数测试装置一端与滤波装置双通道连通，用作输出和接收信号；所述参数测试装置输出端与信号处理器连通，用于传输参考信号、反射信号、透射信号；所述三维位移台分别可以作X、Y、Z移动，用于控制耦合有所述探针的四分之一波长同轴谐振腔移动；所述成像分析单元作用为发出控制指令和对探测到的参数进行反演计算绘制图像；所述活体维持装置作用为维持活体细胞活性的装置。
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