CN111278561A - 用于整体图案化分子结构的方法和系统 - Google Patents

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Abstract

公开了用于核酸分子结构整体图案化的方法、系统和装置。该装置可以包括微通道和纳米狭缝。该微通道和纳米狭缝可以通过停泊腔室连接。该系统和方法可以利用与电压施加方案协调的装置的几何结构，以在停泊腔室内停泊核酸分子然后将核酸分子注入纳米狭缝。该方法可以用于以适合基因组分析的方式呈现核酸分子。该方法还可以用于提供核酸分子的尺寸选择。

Description

用于整体图案化分子结构的方法和系统
相关申请的交叉引用
本申请涉及2016年5月16日提交的美国临时专利申请号62/506,992，要求其优先权，并通过引用将其并入本文用于所有目的。
关于联邦资助研究的声明
本发明得到国家卫生研究院(National Institutes of Health)第HG000225号政府资助。政府对本发明拥有一定的权利。
背景技术
本发明的领域是分子操纵。更具体地，本发明涉及拉伸核酸分子，从而更好地呈现核酸分子的某些部分，供于通过多种技术进行观察研究或分离各种不同的核酸分子群。
精准医疗计划(Precision Medicine Initiative)迫切要求开发通过详细测量个体来了解疾病分子基础的新方法，这可能会增加到100万名参与者的庞大队伍。应对这一挑战意味着，基因组分析方法必须不断发展成将在整个人类基因组中提供更多信息，同时又要大幅降低成本。因此，已经出现了采用单分子分析物的系统，但是没有排除许多出牙般的疼痛。早期单分子测序系统已经指出了迎接这些挑战的前进方向，但是尽管太平洋生物科学公司(Pacific Biosciences)和牛津纳米孔公司(Oxford Nanopore)付出了昂贵的商业化努力，仍然需要解决将这些系统的工业化版本推向生物医学领域中广泛应用的问题。
人基因组映射(mapping)的单分子方法通过识别结构变异(SV)提供了测序工作的对应方式，以此无需进行序列分析。光学映射(Optical Mapping)的发明和其高级形式纳米编码(Nanocoding)现在由BioNanoGenomics公司销售，其提供对于正常人和癌症基因组中所呈现的结构变异的理解。这类变异难以通过测序完全表征，因为人基因组包含复杂重复分布区域的大量拉伸，这些区域包含被ENCODE项目全面功能化的SV。ENCODE提供的新见解证实了人类基因组中这些先前被忽略的部分的生物学重要性，并且这种新知识也促进了容易揭示复杂变异的新技术的发展。
因此，一个或多个本发明的发明人之前的成果通过开发一种健壮的DNA标记和呈现方法“纳米编码”处理这些问题，所述纳米编码使用缺口限制性酶条码化分子，然后其切割位点被使用荧光染料标记的核苷酸的缺口平移所标记。由此形成的点通过荧光共振能量转移(FRET)显微镜沿着拉伸的分子使用利用低离子强度(I)条件的纳米限域方案成像。因为DNA持续长度随着溶液离子强度的降低而增加，所以这些条件增强相对较大狭缝内的DNA拉伸。然后，基于这些研究建立其他组。更具体地，在这些努力中研发的第一个纳米狭缝(nanoslit)装置使用具有高纵横比狭缝(100nm x 1,000nm)特征的软光刻技术由PDMS制造。虽然拉伸DNA分子所需的狭缝尺寸要小得多，但是通过使用由非常低的离子强度条件(约0.2mM)介导的静电效应可以大大提高限域条件。后续研究改进了狭缝几何形状(250nmx 400nm)和离子强度条件，这进一步增强了DNA拉伸(
Figure BDA0002277696920000021
其中L是分子轮廓长度)，但是将分子加载到纳米狭缝中变得更加困难。这是影响大多数纳米流体装置的常见问题，因为相较于DNA持续长度，当使大量无规卷曲分子穿过狭缝几何结构时，熵成本很高。
早期研究揭示，低离子强度的条件下，大DNA分子有时会部分地加载到纳米狭缝(100nm x 1,000nm)中，但被形成“DNA哑铃”的无规卷曲部分排除在狭缝外。重要地是，处于哑铃构型的DNA显示出增强的拉伸(S＝S/L＝1.06)，这不可能是“分子裂片(molecularlobe)”所施加的逐渐消失的熵力的结果。相反，理论处理和模拟确定了静电和流体动力相互作用(HI)的组合效果是介导增强的拉伸的主要因素。
仍然需要以易于加载并呈现作为哑铃的非常大的DNA分子的方式进一步理解然后利用纳米流体系统内的静电效应和DNA聚合物动力学。这些都是重要的考虑因素，因为DNA哑铃，当由随机加载事件形成时，难以整体产生。
因此，需要一种能够克服前述缺陷的，同步形成核酸分子哑铃的方法。
发明概述
本发明通过提供用于整体图案化核酸分子的方法和系统克服了上述缺点。
本公开提供了本文所描述、陈述和要求保护的装置、系统和方法。
通过以下描述可以清楚地了解本发明的上述和其他方面和优势。在以下说明书中，参照构成说明书的一部分的附图，其中以说明性方式显示了本发明的优选实施方式。这类实施方式不必然代表本发明的全部范围，而是作为参考，由此对权利要求进行说明并在本文中解释本发明的范围。
附图说明
图1A是根据本公开一方面的装置示意图的俯视图。
图1B是根据本公开一方面的系统内跨装置的静电势图。
图1C是根据本公开一方面的装置示意图的显微图。
图1D是根据本公开一方面的装置的混合示意图和显微图，显示作用于感兴趣分子上的各种力。
图1E是根据本公开一方面的加载腔室的扫描电子显微镜图(顶部)以及显示加载的纳米狭缝的离子分布的装置的图示。
图1F是根据本公开一方面显示低和高离子强度条件下离子云的纳米狭缝的透视图。
图2A1是根据本公开一方面显示在低离子强度条件下加载腔室进行加载的图像。
图2A2是根据本公开一方面显示在高离子强度条件下加载腔室试图进行加载的图像。
图2B是根据本公开一方面加载效率对比离子强度的图。
图2C是根据本公开一方面显示加载停泊分子(parked molecule)(主图)和未停泊分子(插图)频率随时间变化的柱状图。
图3A是根据本公开一方面说明施加于图1B系统的示例性电力供应方案的图表。
图3B1是根据本公开一方面显示施加电力供应方案之前的图1B系统的部分的图示。
图3B2是根据本公开一方面图3B1中所示构型的图像。
图3C1是根据本公开一方面以感兴趣的颗粒或分子停泊构型示出的图3B1系统的部分的图示。
图3C2是根据本公开一方面图3C1中所示构型的图像。
图3D1是根据本公开一方面以感兴趣的颗粒或分子加载构型示出的图3B1系统的部分的图示。
图3D2是图3D1中所示构型的图像。
图3E1是根据本公开一方面以感兴趣的颗粒或分子哑铃构型示出的图3B1系统的部分的图示。
图3E2是图3E1中所示构型的图像。
图4是根据本公开一方面针对不同尺寸感兴趣的核酸分子加载效率对比电压(或者任选地，对比逐步升高电压的时间)的图。
图5是根据本公开一方面近似于本文描述的装置的电阻网络(左图)以及本文所述系统静电势的图(右图)。
图6是显示根据本发明一方面关于电极布置设计的数据和图示。
图7是根据本公开一方面在不同离子强度条件下分子转运中主导力量的总结以及“中间电极(middle electrode)”设置的图示。
图8A是根据本公开一方面显示荧光标记的羧基封端的聚苯乙烯微球的加载动力学的叠加图像。
图8B是根据本公开一方面显示荧光标记的天然聚苯乙烯微球的加载动力学的叠加图像。
图8C是根据本公开一方面显示中性罗丹明B染料迁移的一系列图像。
图9是根据本公开一方面显示用多种感兴趣的分子或颗粒的至少部分加载多个纳米狭缝的方法的流程图。
发明详述
本公开内容中引用的所有参考专利、申请和非专利文献均通过引用其全文纳入本文。如果参考文献和本公开内容不一致，以本公开内容为准。
本公开提供了如下陈述、权利要求和本说明书所述的装置、系统和方法。
每当本文提及分子、感兴趣的分子、核酸分子或感兴趣的核酸分子时，本公开还考虑可变形物体，如颗粒，带或不带有效电荷，无规卷曲蛋白质，合成聚电解质，染色质，合成聚合物等。对于不带电的物体，发汗力(diaphoretic force)可以提供本文所述运输，相对于带电物体或分子以及相应的力。
参照图1A，示出了根据本发明各方面的微流体装置10。微流体装置10包括由一级微通道壁14限定的一级微通道12，所述一级微通道壁14具有一级远端微通道表面16，所述一级远端微通道表面16具有第一一级远端微通道开口18，所述一级微通道12具有一级微通道高度(朝向页面的距离，如图1A所示)。微流体装置10还包括由二级微通道壁24限定的二级微通道22，所述二级微通道壁24具有二级近端微通道表面26，所述二级近端微通道表面26具有第一二级近端微通道开口28，所述二级微通道22具有二级微通道高度(朝向页面的距离，如图1A所示)。如本文所用，壁可以指在任何方向上界定空间或体积的表面(换言之，壁包括空间或体积的“天花板”和“地板”，因此封闭的立方空间可以描述为具有六个壁)。
微流体装置10还包括第一一级纳米狭缝32，其具有第一一级纳米狭缝高度(朝向页面，如图1A所示)，第一一级纳米狭缝宽度(与第二一级纳米狭缝宽度36相似，示于图1E中)和第一一级纳米狭缝长度(即，从一级远端微通道表面16到二级近端微通道表面26的第一一级纳米狭缝32的长度)。
微流体装置10还包括第一一级近端停泊腔室40，所述第一一级近端停泊腔室40具有第一一级近端停泊腔室高度(朝向页面的距离，如图1A所示)，第一一级近端停泊腔室宽度(沿一级微通道12纵轴44的轴向距离)和第一一级近端停泊腔室长度(相对于纵轴44的径向距离)。第一一级纳米狭缝32与第一一级近端停泊腔室40连接。第一一级近端停泊腔室40由第一一级远端微通道开口18与一级微通道12连接。第一一级纳米狭缝32由第一一级近端微通道开口28与二级微通道22流体连通。
在一些非限制性的示例中，第一一级近端停泊腔室40被设置成由整数数量感兴趣的分子或颗粒50占据(示于图3A-3E2)，其各自具有卷曲结构，并且排除其他感兴趣的分子或颗粒50进入。在一些情况下，整数数量感兴趣的分子或颗粒50是单个感兴趣的分子或颗粒。在一些情况下，整数数量感兴趣的分子或颗粒50和/或其他感兴趣的分子或颗粒50是核酸分子。
微流体装置10还包括第一一级远端停泊腔室48，所述第一一级远端停泊腔室40具有第一一级远端停泊腔室高度(朝向页面的距离，如图1A所示)，第一一级远端停泊腔室宽度(沿二级微通道22纵轴52的轴向距离)和第一一级远端停泊腔室长度(相对于纵轴52的径向距离)。第一一级纳米狭缝32与第一一级远端停泊腔室48连接。第一一级远端停泊腔室48由第一二级近端微通道开口28与二级微通道22连接。
在一些情况中，第一一级近端停泊腔室40具有1nm3-1mm3的第一一级近端停泊腔室体积。在一些情况中，第一一级近端停泊腔室体积是1μm3-250μm3。在一些情况中，第一一级远端停泊腔室48具有1nm3-1mm3的第一一级远端停泊腔室体积。仍然在一些情况中，第一一级远端停泊腔室体积是1μm3-250μm3。
在一些非限制性示例中，第一一级近端停泊腔室高度是一级微通道高度的1％-125％。在一些情况中，第一一级近端停泊腔室高度是一级微通道高度的75％-100％。在一些情况中，第一一级远端停泊腔室高度是二级微通道高度的1％-125％。在一些情况中，第一一级远端停泊腔室高度是二级微通道高度的75％-100％。在一些情况中，第一一级近端停泊腔室高度为10nm-10mm、100nm-50μm或1.0μm-5.0μm。在一些情况中，第一一级近端停泊腔室宽度为10nm-10mm、100nm-50μm或1.0μm-5.0μm。在一些情况中，第一一级近端停泊腔室长度为10nm-10mm、100nm-50μm或1.0μm-10.0μm。在一些情况中，第一一级远端停泊腔室高度为10nm-10mm、100nm-50μm或1.0μm-5.0μm。在一些情况中，第一一级远端停泊腔室宽度为10nm-10mm、100nm-50μm或1.0μm-5.0μm。在一些情况中，第一一级远端停泊腔室长度为10nm-10mm、100nm-50μm或1.0μm-10.0μm。在一些情况中，第一一级纳米狭缝高度34小于第一一级近端停泊腔室高度的50％、25％或10％。在一些情况中，第一一级纳米狭缝高度34低于或等于100nm。在一些情况中，第一一级纳米狭缝宽度小于第一一级近端停泊腔室宽度的50％、25％或10％。在一些情况中，第一一级纳米狭缝宽度小于或等于1μm。在一些情况中，第一一级纳米狭缝长度为1μm-10mm。在一些情况中，第一一级纳米狭缝长度为10μm-100μm。
在一些情况中，第一一级纳米狭缝32以相对于一级微通道12纵轴44介于1°和89°之间的角度取向。在一些情况中，第一一级纳米狭缝32以相对于一级微通道12纵轴44介于10°和80°之间的角度取向。在一些情况中，第一一级纳米狭缝32以相对于一级微通道12纵轴44介于40°和50°之间的角度取向。
在一些情况中，第一一级纳米狭缝32具有第一一级纳米狭缝横截面积，所述第一一级纳米狭缝横截面积小于第一一级近端停泊腔室40的第一一级近端停泊腔室横截面积的25％。在一些情况中，一级远端微通道表面16和二级近端微通道表面26通过介于1μm和10mm之间的一级微通道分隔60距离分隔。在一些情况中，一级微通道分隔60距离是5μm-1mm或10μm-100μm。
如所示，一级远端微通道表面16还包括第二一级远端微通道开口62。二级近端微通道表面26具有第二二级近端微通道开口64。
微流体装置10还包括第二一级纳米狭缝66，其具有第二一级纳米狭缝高度(朝向页面，如图1A所示)，第二一级纳米狭缝宽度36(示于图1E中)和第二一级纳米狭缝长度(即，从一级远端微通道表面16到二级近端微通道表面26的第二一级纳米狭缝66的长度)。
微流体装置10还包括第二一级近端停泊腔室74，所述第二一级停泊腔室74具有第二一级近端停泊腔室高度(朝向页面，如图1A所示)，第二一级近端停泊腔室宽度(沿一级微通道12纵轴44的轴向距离)和第二一级近端停泊腔室长度(相对于纵轴44的径向距离)。第二一级纳米狭缝66与第二一级近端停泊腔室74连接。第二一级近端停泊腔室74由第二一级远端微通道开口62与一级微通道12连接。第二一级纳米狭缝66由第二二级远端微通道开口64与二级微通道22流体连通。
在一些情况中，微流体装置10还包括第二一级远端停泊腔室82，所述第二一级停泊腔室82具有第二一级远端停泊腔室高度(朝向页面，如图1A所示)，第二一级远端停泊腔室宽度(沿二级微通道22纵轴52的轴向距离)和第二一级远端停泊腔室长度(相对于纵轴52的径向距离)。第二一级纳米狭缝66与第二一级远端停泊腔室82连接。第二一级远端停泊腔室82由第二二级近端微通道开口64与二级微通道22连接。
在一些情况中，一级远端微通道表面16还包括多个一级远端微通道开口，与第一和第二一级远端微通道开口18、62基本相似。二级近端微通道表面26还包括多个二级近端微通道开口，与第一和第二二级近端微通道开口28、64基本相似。
在一些非限制性示例中，微流体装置10还包括多个一级纳米狭缝，与第一和第二一级纳米狭缝32、66基本相似。微流体装置10还包括多个一级近端停泊腔室，与第一和第二一级近端停泊腔室40、74基本相似。多个一级近端纳米狭缝各自连接多个一级近端停泊腔室中相应的一个。多个一级近端纳米狭缝各自由多个一级远端微通道开口中相应的一个连接一级微通道12。多个一级纳米狭缝各自由多个二级近端微通道开口中相应的一个与二级微通道22流体连通。
在一些情况中，微流体装置10还包括多个一级远端停泊腔室，与第一和第二一级远端停泊腔室48、82基本相似。多个一级纳米狭缝各自连接多个一级远端停泊腔室中相应的一个。多个一级远端停泊腔室各自由多个二级近端微通道开口中相应的一个连接第二微通道22。
在一些情况中，第二一级近端停泊腔室74，第二一级远端停泊腔室82，多个一级近端停泊腔室中的一个或多个，或者多个一级远端停泊腔室中的一个或多个具有1nm3-1mm3或1μm3-250μm3的停泊腔室体积。
在一些情况中，多个一级近端停泊腔室中的每一个或者多个一级远端停泊腔室中的每一个被设置成由处于卷曲结构的整数数量的感兴趣的分子或颗粒50或单个感兴趣的分子或颗粒50占据，并且排除其他感兴趣的分子或颗粒50进入。
在一些情况中，多个一级近端停泊腔室各自具有1％-125％或75％-100％一级微通道高度的一级近端停泊腔室高度。
在一些情况中，多个一级远端停泊腔室各自具有1％-125％或75％-100％二级微通道高度的一级远端停泊腔室高度。
在一些情况中，多个一级近端停泊腔室各自具有10nm-10mm、100nm-50μm或1.0μm-5.0μm的一级近端停泊腔室高度。
在一些情况中，多个一级近端停泊腔室各自具有10nm-10mm、100nm-50μm或1.0μm-5.0μm的一级近端停泊腔室宽度。
在一些情况中，多个一级近端停泊腔室各自具有10nm-10mm、100nm-50μm或1.0μm-10.0μm的一级近端停泊腔室长度。
在一些情况中，多个一级远端停泊腔室各自具有10nm-10mm、100nm-50μm或1.0μm-5.0μm的一级远端停泊腔室高度。
在一些情况中，多个一级远端停泊腔室各自具有10nm-10mm、100nm-50μm或1.0μm-5.0μm的一级远端停泊腔室宽度。
在一些情况中，多个一级远端停泊腔室各自具有10nm-10mm、100nm-50μm或1.0μm-10.0μm的一级远端停泊腔室长度。
在一些情况中，多个一级纳米狭缝各自具有这样的一级纳米狭缝高度，所述一级纳米狭缝高度小于多个一级纳米狭缝各自连接的多个一级近端停泊腔室中相应的一个对应的一级近端停泊腔室高度的50％、25％或10％。
在一些情况中，一级纳米狭缝高度低于或等于100nm。
在一些情况中，多个一级纳米狭缝各自具有这样的一级纳米狭缝宽度，所述一级纳米狭缝宽度小于多个一级纳米狭缝各自连接的多个一级近端停泊腔室中相应的一个对应的一级近端停泊腔室宽度的50％、25％或10％。
在一些情况中，一级纳米狭缝宽度低于或等于1μm。
在一些情况中，多个一级纳米狭缝各自具有1μm-10mm或10μm-100μm的一级纳米狭缝长度。
在一些情况中，多个一级纳米狭缝各自以相对于一级微通道12的纵轴44介于1°和89°之间、10°和80°之间或40°和50°之间的角度取向。
在一些情况中，多个一级纳米狭缝各自具有这样的一级纳米狭缝横截面积，所述一级纳米狭缝横截面积小于多个一级纳米狭缝各自连接的多个一级近端停泊腔室中相应的一个的一级近端停泊腔室横截面积的25％。
在一些情况中，多个一级纳米狭缝彼此之间基本平行。在一些情况中，多个一级纳米狭缝的长度基本上相同。在一些情况中，多个一级纳米狭缝具有不同长度的统计学分布。在一些情况中，多个一级纳米狭缝包括至少100个一级纳米狭缝。在一些情况中，多个一级纳米狭缝包括至少500个纳米狭缝。在一些情况中，多个一级纳米狭缝包括至少1000个纳米狭缝。
在一些情况中，多个一级远端停泊腔室由一级远端停泊腔室分隔距离86分隔(示于图1E)。一级远端停泊腔室分隔距离86可以为1nm-1mm、100nm-100μm或1μm-25μm。多个一级近端停泊腔室由1nm-1mm、100nm-100μm或1μm-25μm的一级停泊腔室分隔距离(与一级远端停泊腔室分隔距离86基本相似)所分隔。
在一些非限制性示例中，二级微通道壁24具有二级远端微通道表面88，所述二级远端微通道表面88具有第一二级远端微通道开口90。微流体装置10还包括由三级微通道壁94限定的三级微通道92，所述三级微通道壁具有三级近端微通道表面96，所述三级近端微通道表面96具有第一三级近端微通道开口98。三级微通道92具有三级微通道高度(朝向页面，如图1A所示)。
微流体装置10还包括第一二级纳米狭缝102，其具有第一二级纳米狭缝高度(朝向页面，如图1A所示)，第一二级纳米狭缝宽度(与第二一级纳米狭缝宽度36相似)和第一二级纳米狭缝长度(即，从二级远端微通道表面88到三级近端微通道表面96的第一二级纳米狭缝102的长度)。
微流体装置10还包括第一二级近端停泊腔室110，所述第一二级近端停泊腔室110具有第一二级近端停泊腔室高度(朝向页面，如图1A所示)，第一二级近端停泊腔室宽度(与各种其他停泊腔室宽度相似)和第一二级近端停泊腔室长度(与各种其他停泊腔室长度相似)。第一二级纳米狭缝102与第一二级近端停泊腔室110连接。第一二级近端停泊腔室110由第一二级远端微通道开口90与二级微通道22连接。第一二级纳米狭缝102由第一三级近端微通道开口98与三级微通道92流体连通。
在一些情况中，微流体装置10还包括第一二级远端停泊腔室118，所述第一二级远端停泊腔室118具有第一二级远端停泊腔室高度(与各种其他停泊腔室高度相似)，第一二级远端停泊腔室宽度(与各种其他停泊腔室宽度相似)和第一二级远端停泊腔室长度(与各种其他停泊腔室长度相似)。第一二级纳米狭缝102与第一二级远端停泊腔室118连接。第一二级远端停泊腔室118由第一三级近端微通道开口98与三级微通道92连接。
在一些情况中，二级远端微通道表面88还包括多个二级远端微通道开口，与二级远端微通道开口90基本相似。三级近端微通道表面96具有多个三级近端微通道开口，与第一三级近端微通道开口98基本相似。微流体装置10还包括多个二级纳米狭缝，与第一二级纳米狭缝102基本相似。微流体装置10还包括多个二级近端停泊腔室，与第一二级近端停泊腔室110基本相似。多个二级近端纳米狭缝各自连接多个二级近端停泊腔室中相应的一个。多个二级近端停泊腔室各自由多个二级远端微通道开口中相应的一个连接二级微通道22，多个一级纳米狭缝各自由多个三级近端微通道开口中相应的一个与三级微通道92流体连通。
在一些情况中，微流体装置10还包括多个二级远端停泊腔室，其可以与第一二级远端停泊腔室118基本相似。多个二级纳米狭缝各自连接多个二级远端停泊腔室中相应的一个。多个二级远端停泊腔室各自由多个三级近端微通道开口中相应的一个连接三级微通道92。
在一些情况中，微流体装置10还包括多个微通道，与一级、二级和三级微通道12、22、92基本相似。多个微通道各自由微通道壁限定，所述微通道壁具有远端微通道表面，所述远端微通道表面具有多个远端微通道开口。微通道壁各自具有近端微通道表面，所述近端微通道表面具有多个近端微通道开口。
微流体装置10还包括一系列多个纳米狭缝和一系列多个近端停泊腔室。一系列多个纳米狭缝中的各纳米狭缝连接一系列多个近端停泊腔室中相应近端停泊腔室。一系列多个近端停泊腔室中的各近端停泊腔室由多个近端微通道开口相应的近端微通道开口连接多个微通道相应的近端微通道。一系列多个纳米狭缝中的各纳米狭缝由多个远端微通道开口相应的远端微通道开口与相应的远端微通道流体连通。相应的微通道邻近相应的近端微通道。
在一些非限制性示例，微流体装置10还包括一系列多个远端停泊腔室。一系列多个纳米狭缝中的各纳米狭缝连接一系列多个远端停泊腔室中相应的远端停泊腔室。一系列多个远端停泊腔室中的各远端停泊腔室连接多个微通道中相应的远端微通道。
在一些情况中，多个微通道是开放式的。在一些情况中，多个微通道是均匀分布的。在一些情况中，多个微通道通过不同距离的统计学分布间隔。
在一些非限制性示例中，微流体装置10还包括由最后(terminal)微通道壁128限定的最后微通道126，所述最后微通道壁128具有最后近端微通道表面130，所述最后近端微通道表面130具有多个最后近端微通道开口，与近端微通道开口28、64、98基本相似。一级微通道12和最后微通道126位于多个微通道的相对端。多个微通道包括与最后微通道126最接近的倒数第二微通道132，所述倒数第二微通道132由具有倒数第二远端微通道表面136的倒数第二微通道壁134限定，所述倒数第二远端微通道表面136具有多个倒数第二远端微通道开口，与远端微通道开口18、62、90基本相似。
微流体装置10还包括多个最后纳米狭缝，多个最后近端停泊腔室和多个最后远端停泊腔室，与纳米狭缝32、66、102，近端停泊腔室40、74、110，和远端停泊腔室48、82、118基本相似。多个最后纳米狭缝各自连接多个最后近端停泊腔室中相应的最后近端停泊腔室。多个最后纳米狭缝各自连接多个最后远端停泊腔室中相应的最后远端停泊腔室。多个最后近端停泊腔室各自由多个倒数第二远端微通道开口中相应的一个连接倒数第二微通道132。多个最后远端停泊腔室各自由多个最后近端微通道开口中相应的一个连接最后微通道126。
在一些情况中，一级微通道12和最后微通道126流体连通。
在一种情况中，微流体装置10内至少50％、至少75％或至少90％的纳米狭缝被一种且仅一种感兴趣的分子或颗粒或感兴趣的核酸分子占据。
参照图1B，在一些非限制性示例中，上述微流体装置10可以通过系统200实施。系统200包括微流体装置10、装置接收腔室202、电力供应器204和电力供应控制器206。
装置接收腔室202包括装置定向部分208和至少两个电极210，该装置定向部分208设置成接收微流体装置10并相对于至少两个电极210可再生产地定向微流体装置。电力供应器204与至少两个电极210电连通。电力供应控制器206设置成执行电力供应方案。
系统200还包括加热器或冷却器212，其被设置成加热或冷却微流体装置10和/或装置接收腔室202内的液体。
系统200还包括温度测量装置214，其被设置成测量微流体装置和/或装置接收腔室202内的流体温度。
系统200还包括分光仪216，其被设置成光学问询位于微流体装置中的分子。分光仪216具有足以区分位于邻近纳米狭缝中分子之间的空间分辨率。分光仪216设置成监测一个或多个停泊腔室和/或一个或多个纳米狭缝的占据状态。分光仪216可以是荧光显微镜。系统200可以还包括用户输入218，诸如本领域普通技术人员已知的计算机装置输入(例如，键盘和鼠标，麦克风和语音识别软件，触屏等)。
在一些情况中，电力供应控制器206被编程或设置成接收关于感兴趣的分子或颗粒50的核酸静电或流体动力学信息，关于微流体装置10的微流体装置静电或流体动力学信息，关于感兴趣的缓冲液的缓冲液离子强度信息，或其组合。
参照图3A-3E2，示出了操作系统200内微流体装置10的示例性模式。在操作的示例性模式中，显示出感兴趣的分子或颗粒50被停泊于或加载于微流体装置10的第一二级纳米狭缝102以及多个二级纳米狭缝。应当理解的是，这种操作模式适用于加载本文所述微流体装置10的各一级、二级、三级和所有其他纳米狭缝。
如图3A所示，电力供应方案被设置成提供第一电压VP持续第一时间长度(点1和2之间)，第二电压VL持续第二时间长度(点3和4之间)，和第三电压V0持续第三时间长度(从点5到预定时间点)。第一电压VP和第一时间长度设置成将感兴趣的分子或颗粒50加载到微流体装置10中相关联的停泊腔室。第二电压VL和第二时间长度设置成将来自相关联的停泊腔室的感兴趣的分子或颗粒50加载到各自与相关联的停泊腔室连接的相关联的纳米狭缝。第三电压V0和第三时间长度设置成允许感兴趣的分子或颗粒50，诸如核酸分子，加载到相关联的纳米狭缝中以具有哑铃构型。
因此，如图3B1和3B2所示，施加第一电压VP之前，感兴趣的分子或颗粒50可以置于二级微通道22，悬浮于充满装置接收腔室202的缓冲液内。然后，如图3C1和3C2所示，施加第一电压VP持续第一时间长度以将感兴趣的分子或颗粒50加载到装置10的各种停泊腔室。然后，如图3D1和3D2所示，施加第二电压VL持续第二时间长度以将来自相关联的停泊腔室的感兴趣的分子或颗粒50加载到各自与相关联的停泊腔室连接的相关联的纳米狭缝。最终，如图3E1和3E2所示，施加第三电压V0持续第三时间长度以允许感兴趣的分子或颗粒50(其可以是核酸分子)加载到相关联的纳米狭缝中以具有哑铃构型。
在一些情况中，电力供应方案被设置成在电渗透力支配分子运动的条件下将分子加载到停泊腔室。
在一些情况中，电力供应方案被设置成施加这样的电压方案，所述电压方案施加第一电压以将多种感兴趣的分子或颗粒50加载到对应的停泊腔室并施加第二电压，所述第二电压对第一尺寸分子的加载效率大于50％并且对第二尺寸分子的加载效率小于50％，从而令具有尺寸分布的部分所述多种感兴趣的分子或颗粒50选择性加载于多个纳米狭缝，所述尺寸分布相较于多种感兴趣的分子或颗粒50偏重于第一尺寸。
相应地，在一些非限制示例中，系统200包括微流体装置100，将其设置成用于分离多种感兴趣的分子或颗粒50。微流体装置10包括多个停泊腔室和多个纳米狭缝。多个一级纳米狭缝各自连接多个停泊腔室中相关联的停泊腔室。多个停泊腔室各自连接多个纳米狭缝中的相关纳米狭缝。
系统200包括至少两个电极210，其中至少两个电极210相对于微流体装置定位以致施加电压到至少两个电极210时提供横跨多个纳米狭缝的至少部分所述电压。系统200还包括与至少两个电极210电连通的电力供应器204。系统200还包括电力供应控制器206，其被设置成执行电力供应方案，所述电力供应方案被设置成在这样的条件下将多种感兴趣的分子或颗粒50中的一种且仅一种选择性地加载于多个停泊腔室的至少部分，在所述条件中选择性加载的感兴趣的分子或颗粒50的运动与电渗透力的方向至少部分对齐。电力供应方案利用(a)微流体装置相对于至少两个电极210的几何结构，(b)微流体装置10内离子缓冲液的离子强度，和(c)微流体装置的静电或流体动力学性质和多种感兴趣的分子或颗粒50的静电或流体动力学性质。
相应地，在一些其他非限制示例中，系统200包括微流体装置100，将其设置成用于分离多种感兴趣的分子或颗粒50。微流体装置10包括多个停泊腔室和多个纳米狭缝。多个纳米狭缝各自连接多个停泊腔室中相关联的停泊腔室。多个停泊腔室各自连接多个纳米狭缝中相关联的纳米狭缝。系统200还包括至少两个电极210。至少两个电极210相对于微流体装置定位以致施加电压到至少两个电极210时提供横跨多个纳米狭缝的至少部分所述电压。系统200还包括与至少两个电极210电连通的电力供应器。电力供应控制器206被设置成执行电力供应方案，所述电力供应方案被设置成施加这样的电压方案，所述电压方案施加第一电压以将多种感兴趣的分子或颗粒50加载到对应的停泊腔室并施加第二电压，所述第二电压对第一尺寸分子的加载效率大于50％并且对第二尺寸分子的加载效率小于50％，从而令具有尺寸分布的部分所述多种感兴趣的分子或颗粒50选择性加载于多个纳米狭缝，所述尺寸分布相较于多种感兴趣的分子或颗粒50偏重于第一尺寸。
现在参照图9，如下提供了使用系统200将多种感兴趣的分子或颗粒50的至少部分加载于微流体装置10的多个纳米狭缝的方法。
该方法在步骤1000包括，将多种感兴趣的分子或颗粒导入与多个停泊腔室连通的微通道，所述多个停泊腔室连接对应的多个纳米狭缝，所述微通道、所述多个停泊腔室和所述对应的多个纳米狭缝各自包含具有离子强度的离子缓冲液。
该方法在步骤1002还包括施加第一电压持续第一时间长度，第一电压大于第一电压阈值并小于第二电压阈值，从而导致多个停泊腔室的至少部分被一种且仅一种感兴趣的分子或颗粒占据。
该方法在步骤1004还包括施加第二电压持续第二时间长度，第二电压大于第二电压阈值，从而导致一种且仅一种感兴趣的分子或颗粒被加载于多个纳米狭缝的至少部分。
该方法在步骤1006还包括施加第三电压持续第三时间长度，所述第三电压小于第一电压阈值或者零电压，从而导致加载于多个纳米狭缝的至少部分的感兴趣的分子或颗粒50具有哑铃构型。
在一些情况中，该方法在步骤1008可以还包括光学问询具有哑铃构型的分子。
在一些情况中，该方法在步骤1010可以还包括对感兴趣的分子或颗粒50的序列进行映射。相应地，步骤1010包括对多种核酸分子的部分进行映射。
在一些情况中，选择第一电压以提供这样的条件，所述条件中电渗透力导致至少50％的分子运动。在一些情况中，选择第一电压以提供这样的条件，所述条件中分子由微通道移动到多个停泊腔室的部分的运动与电渗透力的方向至少部分对齐。
在一些情况中，选择第二电压和第二时间长度以为第一尺寸分子提供大于50％的加载效率并为第二尺寸分子提供小于50％的加载效率，从而令具有尺寸分布的部分多种感兴趣的分子或颗粒50加载于多个纳米狭缝，所述尺寸分布相较于全体多种感兴趣的分子或颗粒50偏重于第一尺寸。
在一些情况中，以相对于至少部分多个纳米狭缝+45°至-45°之间的角度施用第一电压、第二电压、第三电压或其组合。
在一些情况中，利用单分散样品(siz)。在一些情况中，具有复杂几何形状的装置可以用于同步加载分子尺寸的分散群体。在一些情况中，进行本文所述方法之前，装置可以将混合物分成几部分。
图1显示了DNA：装置考虑因素的静电限域和操作。(A)微通道/纳米狭缝装置示意图(俯视图)：1.6μm高x 20μm宽微通道(分子总线(molecule bus))，其连接100nm H x 1μmW x 28.3μm L纳米狭缝。整个装置0.5cm x 0.5cm平方，其包括126个微通道，各自具有由分子门(molecular gate)界定的1,100个纳米狭缝。(B)静电势通过缓冲室内整个装置的有限元模拟确定。这样的模拟指导了电极位置以在微通道/纳米狭缝装置内产生适当的场线。(C)微通道/纳米狭缝装置(通过DIC显微镜成像)与箭头重叠，这些箭头显示了装置微通道和纳米狭缝特征(施加70V)内场线的方向和大小。(D)卡通图(俯视图)显示了低离子强度和高离子强度条件下电动力(electrokinetic force)的方向和大小。插图是图案化的硅主盘的SEM显微图(顶视图)，其详细描述了纳米狭缝和和分子门。具有纳米编码的标记物(红色点)的DNA哑铃的显微图显示在装置中。处于低I时，电渗(EO，蓝色箭头)引导分子沿着微通道移动，而电泳(EP，黄色箭头)将分子推向分子门。在高I时，两个方向均由电泳控制。还绘制了分子轨迹(虚线)。(E)杯状分子门特征的SEM(扫描电子显微镜)图像和硅主板的尺寸(俯视图)。下图显示了微通道(1.6μm高)内的DNA分子(绿色)。示出了这样的多个分子门，所述分子们具有穿入纳米狭缝(100nm高)的DNA，他们穿过纳米狭缝至另一侧以形成哑铃。注意位于分子门底部的小1μm x 100nm狭缝开口。横截面图(插图)描绘了围绕DNA和纳米狭缝壁(红色)的相交离子分布(绿色)。(F)透视图显示了微通道内的DNA分子(绿色球/线)；插图显示了围绕DNA和装置壁的离子云。纳米狭缝内的侧向横截面图，[参见(E)；AA部分]，显示了在低和高离子强度下围绕DNA分子(绿色)和纳米狭缝(红色)的离子云。低I值下，由于离子云重叠形成了一个“静电瓶”，从而静电限制了现在硬化的(增加的持续长度)DNA分子。相反，高I导致短德拜(Debye)长度，从而使分子在纳米狭缝整个高度上更自由地扩散。此外，离子强度条件共同影响电渗流场的概况，如箭头所示，其中最大速度直接取决于限域尺寸和德拜长度之间的比例。
图2显示了DNA停泊如何同步由离子强度条件控制的纳米狭缝加载。(A1和A2)绿色轨迹显示了腺DNA分子通过微通道(不停泊)加载到纳米狭缝的轨迹，通过叠加174个图像帧(间隔为0.03s)捕获；装置在图1中详述。(A1)黄色箭头表示电渗和电泳力作用下DNA迁移的总体方向(低离子强度：0.51mM)。沿“分子门”/微通道界面积累强荧光(A2)，表明没有通过纳米狭缝。除了蓝色箭头指示高离子强度(8.5mM)下电泳力主导的DNA迁移外，其他条件相同。(B)图像显示了经成像存在于分子门处腺DNA分子的加载效率Le,nP或产量如何随离子强度和施加的电压而变化，所述分子然后继续加载于纳米狭缝中，不进行停泊步骤(方波信号：0V-70V或0V-50V；0.1Hz)。误差线是平均值的标准偏差；实验的样品大小为18-94个分子。颜色突出了DNA加载方案：[黄色]急性加载(EO-EP)、[绿色]转换，和[蓝色]钝性(EP)。(C)直方图显示了停泊后三种DNA尺寸上随时间的加载效率fL,P：腺(35.9kb)、λ(48.5kb)和T4(165.6kb)。插图：不进行停泊步骤的分子的加载频率fL,nP；线代表各DNA样品的累积频率(23-67个测量)。显微照片显示停泊并加载的λDNA分子(绿色)的示例；白色轮廓定义了分子门和纳米狭缝壁。
图3B1-3E2显示了T4 DNA哑铃的停泊、加载和同步形成。触发停泊的DNA分子在纳米狭缝中同步加载和哑铃形成的电信号示意图。显微图以及卡通图显示了T4(165.6kb)DNA分子：(1)数个微通道内，向分子门迁移(Vp＝20V；t＝0s)进行停泊。(2)这些DNA分子的部分现在驻留在分子门内(Vp＝20V；t＝70.10s)，并且现在是停泊的。(3-4).停泊的分子经触发(t＝70.32s)以将其通过短的较高电压脉冲(1.0s；VL＝70V)同步加载到相邻的狭缝中以形成哑铃阵列(5)(t＝74.01s)。
图4是显示停泊后DNA加载动力学受尺寸和施加电压支配的图。测量各DNA样品的103-123个分子并将I固定为0.62mM；分子在10V稳定停泊20s，然后以5s间隔(5V)将施加的电压从10V逐步提升到70V(较低x轴)。图表显示了LE,P对比VL(V)；VL是观察到50％停泊的分子加载于纳米狭缝中的电压(水平红线)；红色虚线表示pXba(22.6kb)、腺(35.9kb)和λ(48.5kb)DNA分子处于LE,P＝50％时相应的VL值。
图5显示了如何在本公开的装置内建模电场。左侧：纳米狭缝-微通道网络的电阻网络近似。单格由代表微通道电阻的一个电阻和代表纳米狭缝的一个电阻组成。电阻值可由一维狭窄电解质通道模型获得，所述模型涉及泊松-玻尔兹曼(Poisson-Boltzmann)和纳维叶-斯托克斯(Navier-Stokes)方程组。右侧：施加20V的电势差时，装置和储罐内的电位和电场线。
图6显示了两个级别的FE模拟以协助装置设计。装置域经过离散化用于二维和三维分析，包括完整的静电细节(电势、场、力)以及纳维叶-斯托克斯/能斯特-普朗克(Nernst-Planck)分子模拟。包括两个研究的代表性网格。设计的主要组成部分是电场相对于微通道轴向的角度。该角度控制电泳和电渗力的方向。根据该角度选择电极的位置，该角度针对电极的位置1和5中显示。
图7显示了受离子强度–“中间电极”影响的DNA加载动力学的总结。使用中间电极构象，当通过微通道装置(MC，无纳米狭缝；100μm宽x3.3μm高)或微通道-纳米狭缝装置(MC/NS)在不同的离子强度条件下驱动时，腺DNA分子(39.5kb)的迁移受电泳或电渗力的控制，所述不同的离子强度条件是：0.05X TE(I＝0.51mM)或1X TE(I＝8.5mM)。取决于离子强度，电渗或电泳力将占主导。对于侧电极构型，低或高离子强度溶液的加载方式分别是急性或钝性加载。急性加载以电渗流为主，而电泳力则主导钝性加载。黄色和蓝色箭头分别表示电渗流和电泳流。白色箭头指示分子加载到纳米狭缝中的方向(N＝30个测量)。
图8显示了若丹明B染料、天然和羧基封端的聚苯乙烯微球的加载动力学。(a和b)，使用侧电极构型(“+”；“-”；显示电极方向和极性)，荧光标记的羧基封端(a)或天然(b)聚苯乙烯微球电渗驱动通过微通道-纳米狭缝装置。a和b中的图像是将多个图像叠加到一个图像中以记录微通道中珠的进程。各图之间的时间对于a为0.5s，而对于b为0.6s。(c)中性若丹明B染料在微通道-纳米狭缝装置的微通道中电渗迁移。微通道-纳米狭缝装置的DIC(微分干涉对比)图像叠加在荧光显微照片的顶部。颜色查找表显示在图像的右侧。黄色箭头表示电渗流。
装置设计和功能的多尺度理论方法。进行了全面的理论研究，使用了多个长度尺度，从而为具有微通道和纳米狭缝几何形状特征的纳米流体装置的设计和功能提供了信息(图1A)。由装置特征和离子强度条件引起的静电条件会影响电渗(电驱动的流体流动)和电泳力，从而控制DNA迁移。使用布朗动力学(BD)、连续体有限元(FE)模拟和高分子物理学的论据研究了这些力，从而工程改造利用分子限域和静电效应的装置特征(材料和方法)。在两个层面上进行FE计算：详细的静电研究，辅之以全动量和质量平衡模拟(能斯特-普朗克/斯托克斯流体(Stokes flow))，其研究了微通道/杯/纳米狭缝的几何形状(图1E)。静电模拟通过计算浸入周围缓冲介质中的装置内所得电场线和静电势来指导电极的位置。BD模拟提供了对于在装置内部实现移动、停泊和加载DNA分子的电动效应的研究。
电效应：电泳对比电渗。我们采用静电考虑因素来控制装置特征和DNA分子的德拜长度，以高效地将电动加载到纳米狭缝中。德拜长度定义为：
Figure BDA0002277696920000191
(其中κB是玻尔兹曼常数，T是温度，NA是阿伏加德罗数，e是元电荷，ε0是真空介电常数，εr是介电常数，I是离子强度)，其确定带电壁和DNA分子附近的双电层(离子云)的长度。这里不寻常的设计主题是促进而不是阻止电渗流。但是，我们的想法是，单纯的电泳力可能不足以高效地将分子加载到微米柱装饰的纳米狭缝中，这些微米柱将发生纠缠并且不适合处理非常大的DNA分子。图1A-1D显示了微流体/纳米流体装置的整体布局。图1D详细说明了使用引起电渗流的离子强度机制进行DNA操纵的装置的设计和功能。该装置使用一系列平行的微通道(分子总线)将DNA分子传输到分子门特征(杯状结构)，其邻接各对角线取向的纳米狭缝。我们预期由于低离子强度(I<0.75mM)缓冲条件以及存在带负电的装置壁(PDMS壁经过O2等离子体处理)而导致的DNA迁移的电渗扰动。通过增加离子强度(I>2mM)，我们看到了迁移的DNA分子反转相对于电极极性的净方向，这表明主导力从电渗转换为电泳。
FE计算告知了装置几何设计以及在安装显微镜的缓冲液罐内电极的位置；模拟了多个系统，用于优化将增强分子操纵的有效电场(停泊和加载；请参阅下一节)。电极位置控制微通道内的场大小和方向，从而根据离子强度I将分子引导至门(如下所述)。图1C显示了在70V下施加于电极的情况下，由FE计算的图1B中电极构造的电场大小和方向。在微通道内，电场具有约5°的角度，而在纳米狭缝中，其遵循45°的几何方向。重要的是，相较于微通道，纳米狭缝的小横截面面积增加了电阻，其增加了该装置特征内的电场强度(18-20V/cm对比8-9V/cm)。
然后，我们将低离子强度(I＝0.44-0.89mM)或高离子强度(I＝9.0和17mM)条件下相对于纳米狭缝特征和微通道的DNA迁移方向定义为“急性”(电渗流)或“钝性”(电泳)。图2A显示了以一个合成图像呈现的延时成像，该图像揭示了低离子强度和高离子强度条件下装置内腺DNA分子(35.9kb)的迁移轨迹。值得注意的是，低离子强度条件可使腺DNA分子轻松地加载到装置的纳米狭缝特征中，然后退出，如所有装置特征中稀疏的占据所证明的那样。相反，高离子强度条件下，分子通过沿“分子门”/微通道界面的边缘迁移，因此不会加载或穿过纳米狭缝。图2B通过在两个施加的电压(50V和70V)下评估并通过进入纳米狭缝的加载效率(Le,np)测量的一系列离子强度条件回应了这些发现。在极低的离子强度(I＝0.44-0.89mM)下，腺DNA分子在50V和70V下定量加载到纳米狭缝中，但是随后加载急剧下降，在最高离子强度条件下(I＝9.0和17mM；50V)时降至几乎为零。
电渗产生流体驱动力，其将带电荷的分子转移到带有相似电荷的电极上；此处，流场拖动DNA分子，因此，电渗力取决于“齐姆(Zimm)”摩擦系数(ζZ～RG～L3/5(ωlp)1/5～L3/5(I-3/10)；其中，RG、ω和lp分别是分子回转半径、有效宽度和持续长度)，电渗流动性(μEO～I-1/2)和施加的电场E)：fEO～(ζZμEO)E～(I-4/5)E。相反，DNA电泳过程中，分子向相反电荷的电极移动。因为聚电解质(即DNA)在电泳过程中自由排空，这意味着流体动力学屏蔽，电泳力现在是“劳斯(Rouse)”摩擦系数的函数(ζR～1)。因此，电泳迁移率(μEP～ln I-1/2)和施加的电场的比例为(E)：fEP～(ζRμEP)E～(ln I-1/2)E。
似乎很直观的是DNA分子的钝性迁移应该会增加加载，但是我们观察到低离子强度条件和高离子强度条件之间的加载率存在明显差异。我们将这种差异归因于纳米狭缝内的电渗流；在高离子强度条件下将分子“推”离分子门。在纳米狭缝内，电渗速度场可以作为斯托克斯方程的一阶近似值进行计算，所述斯托克斯方程提供了特征速度的估值
Figure BDA0002277696920000201
其中，uE0是电渗速度的大小，H是狭缝高度，而λD是德拜长度。在高离子强度下，相较于纳米狭缝高度，德拜长度较小，允许在纳米狭缝内充分产生电渗流。但是，低离子强度条件下，流场将被可与纳米狭的高度相当的增大的德拜长度所衰减(图1E)，从而消除了这种流动，而其防止了加载。
分子门：停泊、加载和同步哑铃形成。相较于DNA卷曲的Rg，分子门的尺寸(图1E)被设计成用于在各纳米狭缝的入口放置并保持单个分子。因此，这些装置特征在规模上相差很大，当前支持受控且同步加载DNA分子到纳米狭缝中。我们认为，施加低电压(VP)的分子将在分子门内“停泊”，然后可以在高电压(VL)下被触发以同步“加载”于纳米狭缝内。我们通过测量分子大小为35.9kb、48.5kb和165.6kb的单个分子群的加载时间测量了这一概念(图2C)。该图显示了在大约80ms时完成的纳米狭缝中相对较紧的加载分布(80％-90％)。相比之下(图2C插图)，未停泊的分子表现出相当宽的加载时间分布，现在跨越数秒，因为分子在没有停泊的情况下通过穿过分子门直接从微通道进入纳米狭缝。虽然这些加载时间(无停泊)不会促进跨越多个纳米狭缝的同步加载，但该实验表明，即使没有停泊步骤，分子门支持将大型DNA分子高效地加载到纳米狭缝中。
考虑到停泊的分子在短时间内加载(图2C)，我们随后评估了在多个狭缝内同步形成哑铃的效果。图3B1-3E2显示了T4 DNA分子，其以VP＝20V通过微通道移动，在分子门内稳定停泊。施加短脉冲(VL＝70V)将停泊的分子同步加载到纳米狭缝中并当V＝0时候将其捕获为哑铃。停泊期间，精心选择VP以便目测判断分子门内的分子被压缩，但是并不加载到相邻的纳米狭缝中。停泊后，加载电压VL通过非扩散和快速易位触发进入纳米狭缝的通道，促进同步加载。由停泊到加载的转换对于分子群非常明显，这表明该过程中存在动能势垒(图2C)。加载到纳米狭缝中的详细动力学过程是复杂的并且将通过另一出版物中的模拟进行开发。因此，我们开发了用于装置设计和操作的缩放参数。
考虑具有W×H×L尺寸的杯状物(分子门)，此处我们假设该杯状物的宽(W)和高(H)相等并且L是长度。由于电场EP(由停泊电压VP驱动)，DNA分子将在杯状物中停泊，占据体积W×H×LP，其中LP是停泊的分子的表观长度(DNA分子不跨越整个杯状物长度)。对于约束/停泊的分子的自由能有两个主要贡献：由分子片段和壁之间相互作用提供的熵贡献fκBT以及静电贡献fE,cup。可以估计熵贡献，计算“德热纳(de Gennes)”团块的数量并假设各团块的惩罚，即
Figure BDA0002277696920000221
而静电贡献由fE,杯状物～NqEPLP给出。此处，N是形成自由连接链的bk片段的数量，v是弗洛里指数(Flory exponent)且q是分子片段电荷。总自由能最小值将确定停泊长度LP的值，并且获得各团块分子片段数量的表达式：
Figure BDA0002277696920000222
因此，杯状物内的总自由能是f杯装物～kBT/g。将分子停泊后，施加驱动n个分子片段进入高度H的纳米狭缝内的加载电压VL(带有电场EL)。这些片段自由能的熵贡献的形式为fin～kBT/gin，其中gin～(H/bk)1/v是纳米狭缝中片段的数量。片段内的静电贡献是
Figure BDA0002277696920000223
纳米狭缝中片段和杯状物中分子能量之间的自由能差将提供自由能势垒ΔEL的估值。作为第一个近似值，加载的能量势垒ΔEL～1/qELH与总分子电荷q(与DNA分子量)、限域或装置高度H和加载电场EL成反比。因此，较长的DNA分子在停泊期间在分子门内存在较高的电荷密度，并且应当以比短DNA分子低的电压加载。随之而来的是，随着加载电压的增加，能量势垒减小，这有助于进一步实现加载。
施加的电压根据大小差异性地加载DNA分子。我们的缩放参数表明，停泊后在给定的施加电压下，纳米狭缝中的加载应显示出对DNA卷曲大小的显著依赖性，较大的分子在较小的之前被触发加载。我们通过逐步增加施加的电压(10V–70V；5V/5s间隔)来探索这个概念，并评估了不同DNA分子大小：pXba(22.6kb)，腺(35.9kb)和λ(48.5kb)的加载效率LE,P。我们将LE,P定义为停泊后加载的分子的数量(NL,P/NP)并将VL定义为50％的停泊的分子加载到纳米狭缝中的电压。图4描绘了LE,P对比VL(V)，其显示了较大分子λ和腺从停泊到加载状态的急剧转换；对于pXba则较少。在该电压步进方案下不同的加载效应是显而易见的：考虑到相较于仅5％的腺DNA分子，66％停泊的λDNA在30V加载。对该图的分析还揭示了大小依赖性加载的反线性关系LE,P(0.5)＝-0.77Mw+67.5；(Mw以kbp计)，从而确认较大的分子先于较小的分子加载。虽然没有确定直接分离分子的方法，但是该图表明可能存在极佳的尺寸依赖性分离。
经由DNA哑铃的基因组映射：花中间原体(Mesoplasma florum)。我们使用针对纳米编码标记的花中间原体(M.florum)(793kb)基因组DNA评价了用于映射基因组的停泊和加载方法的有效性[(10)；方法]。简言之，缺口平移将荧光标记的核苷酸放置于Nt.BspQI产生的缺口位点，其被成像为通过YOYO-1(绿色供体)染色和共价整合的Alexa fluor-647(红色受体)部分形成的FRET对。该标记步骤通过使用图像处理后续测量点间距来对各DNA分子进行有效地条形码化，从而为各分子创建一个限制性图谱，称为“Nmap”。这种距离测量值(像素，nm)通过使用DNA拉伸估值转化成片段尺寸(千碱基对)，通过使用SOMA软件对齐确定[(6)；(7)；(8)；和方法]，其通过由离子强度和与DNA分子结合的YOYO-1的量介导(8)。因此，整个Nmap数据集(906个Nmap)针对花中间原体参照图谱的成对对齐率使用0.85的拉伸在86％(781个对齐/906个总数)最大化；图5显示了跨越整个基因组的这些对齐。简而言之，SOMA使用了一系列错误模型，反映了标记率(错误和缺失)并确定了错误的大小以对Nmap进行评分，然后将其最佳地置于参照基因组上。参照基因组仅仅是在计算机上根据可用序列创建的有序的限制性图谱。我们使用与Waterman和Vingron进行序列比对所用方法相似的方法来生成置信度评分(p值)。参见，Vingron M和Waterman MS(1994)序列比对和罚分选择的概念分析、案例研究和影响(Sequence alignment and penalty choice.Review ofconcepts,case studies and implications).J Mol Biol 235(1):1-12。
讨论
我们通过设计包含DNA分子和装置本身展现的一系列协同功能的纳米流体装置创造了一种静电激发的基因组分析方法。本文中，非常低的离子强度条件增加拉伸并有策略地组合用于有效地运输和暂时控制加载到纳米狭缝中的分子。这些进步使得通过停泊和加载(这大大增强了DNA的拉伸)的DNA哑铃可以同步形成和分析，用于使用基因组DNA分子映射花中间原体。我们通过阐明和利用两个主要的静电效应实现了这一目标：(1)相对较大且易于制造的纳米狭缝内DNA分子增强的限域；(2)利用电渗力和电泳力的电动作用，这极大地促进并同步了DNA分子通过分子门加载到纳米狭缝中。
这些装置的效果和功能取决于通过改变缓冲液离子强度条件控制与DNA分子(高分子电解质)相关联的德拜长度(λD)以及带电荷的装置特征。本文中，高离子强度溶液(～8mM)产生致密的离子云(～1nm)，而低离子强度溶液(～0.1mM)生产膨胀的离子云(～30nm)。因此，在低离子强度下，装置纳米狭缝(100nm高)和DNA(60nm德拜直径)德拜层相交(图1F)，以增强DNA限域和随之而来的拉伸。低离子强度条件也会增加DNA分子的“刚性”或持续长度，这是进一步增强装置内DNA拉伸的另一种作用。该刚性按照奥代克-什科尔尼克-菲克斯曼(Odijk-Skolnik-fixman)理论(lp～lp，0+I-1)，其中lp，0是排除通过回转半径
Figure BDA0002277696920000241
明确描述的静电考虑因素(支配DNA无规卷曲的平均尺寸)的持续长度。因此，增加的离子强度减小了卷曲尺寸；例如，我们看到随着I增加(0.1对比8.5mM)，lp缩小(358对比53nm)，从而减小了RG(1.9对比0.7μm)。重要的是，我们以前的工作表明，纳米限域下增加DNA持续长度大大增加其拉伸：X/L＝1-0.085[(A/lp)2/3+(B/lp)2/3]；其中X是测量的分子长度，L是聚合物轮廓长度，并且A和B是狭缝的高度和宽度。
静电考虑因素使我们能够工程改造装置形态，以预示其广泛应用的方式将DNA分子同步加载到纳米狭缝几何结构中。分子门几何结构的整体效用，辅以低离子强度条件，经由纳米狭缝停泊/加载中的同步形成哑铃显示了基因组分析的有效性，以及近乎“数字式”的分离能力(图4)，其中在某些条件下，尺寸相近的DNA分子展现出强移动性，或实际上无(effectively none)。此外，即使不使用停泊和加载程序，我们也显示出大DNA分子易于进入纳米狭缝(图2C)。
当用于基因组分析的新生系统展示出高通量操作的潜力时，它们将获得信任。虽然仅对我们装置有限的部分进行了取样，用于完整映射花中间原体基因组图谱，但是该装置包含138,600个纳米狭缝，每个长28μm。该装置的总长度接近4米，可以容纳相当于约4个单倍体人类基因组当量的DNA分子。考虑到这种容量，很容易预想到自动数据采集方案，其中对装置被占据部分进行连续哑铃形成和协同成像将使高通量操作成为可能。
方法
装置设计和制造。装置制造是经由标准光刻和电子束光刻技术的多个步骤：(1)基准标记(Fiduciary mark)，将UVIII旋转涂覆(约600nm)到硅片上，然后使用JBX5DII电子束光刻系统(JEOL；CNTech；UW-Madison)进行暴露。氧气除渣过程在蒸发金属之前去除有机沉积物或残留的抗蚀剂。通过电子束蒸发(CNTech；UW-Madison)放置约20nm的铂层，以促进硅片之间的粘附；然后沉积金层(约60nm厚)以获得高对比度标记，用于在多个层之间对齐。超声处理(丙酮)促进了去除多余的金属，然后进行异丙醇(IPA)冲洗、水冲洗和风干。(2)施加SU8 2000.5光致抗蚀剂(约250nm；MicroChem，马萨诸塞州牛顿镇)并以盒(box)暴露于对齐标记上，保护标记免于后续蚀刻步骤。(3)将SU8 2000.5旋转涂覆(约250nm)到晶片上并暴露纳米狭缝，使用SU8去除剂和IPA显影。将SU8纳米狭缝用CF4(8分钟，10mTorr；Unaxis790，Unaxis Wafer Processing，佛罗里达州圣彼得斯堡)蚀刻到硅片中，置于食人鱼蚀刻液浴(piranha bath)(80％H2SO4和20％H2O2)5分钟以去除残留的SU8，然后用水冲洗以除去酸。最终，通过电子束光刻暴露具有分子门的微通道，该微通道通过整体和芯片基准标记与狭缝对齐。SI方法详述了有机硅复制品创建。
装置设置、停泊和加载。使用石蜡将附着有PDMS装置的酸洗玻璃盖玻片固定在
Figure BDA0002277696920000251
固定器上。毛细管作用使用3μl溶液加载装置微通道，该溶液包含DNA(0.615ng/μl)、YOYO-1(水中；0.38μM)、B-巯基乙醇(3.65％)和POP6(0.091％；赛默飞世尔科学公司(ThermoFisher Scientific))的最终浓度。然后，将装置浸入2ml的0.05X TE缓冲液(10mMTris-HCl、1mM EDTA；pH＝7.9；通过电导性检查溶液稀释度)中20分钟，然后使用插入储库(reservoir)的铂电极将DNA分子电动加载到纳米狭缝中。DNA经由停泊和加载使用电信号[约20s：方波(20V-70V；0.025Hz)]被加载到纳米狭缝中，电极间隔2.5cm。然后将如此停泊的分子同步加载到相邻的纳米狭缝中(70V，使用方波信号；约1s持续时间)。
SI方法
主板装置的PDMS复制。通过以预聚物与铂催化剂10：1比例(wt/wt)倾倒PDMS并在65℃固化24小时，形成PDMS[聚(二甲基硅氧烷)，Sylgard 184，道康宁公司(Dow Corning)，密歇根州米德兰市]复制品。用O2(100W，约0.67mbar，36s，Technics Plasma GMBH 440，肯塔基州佛罗伦萨)对PDMS装置进行等离子体处理，以产生亲水性通道并在超纯水中储存24小时。此外，将处理过的装置在0.5M EDTA(乙二胺四乙酸)pH 8.5中超声处理30分钟，以提取Pt+离子(存在于PDMS催化剂中)，因为Pt+离子通过用Pt+置换嵌入的YOYO-1减弱了YOYO-1/DNA荧光(1)。将装置在超纯水中冲洗五次，每次冲洗在室温下摇动。最终，PDMS装置如之前所述安装到清洁的玻璃表面上(2)。
花中间原体制备、标记和映射。花中间原体基因组DNA在凝胶插入物中制备(3)，在Nt.BspQI限制酶位点被切割，然后使用荧光染料标记的核苷酸(Alexa fluor 647)通过大肠杆菌聚合酶I缺口平移标记，按照我们之前所报道的纳米编码方案(4)。(DNA样品还经SmaI和ApaI限制性酶切消化，以创建线性分子群，其也将支持花中间原体基因组的完整映射)。因此，标记的分子经YOYO-1染色，并经由纳米流体装置(图1)内的停泊(20V)和加载(70V；图3A)以哑铃(11)存在。针对绿色DNA骨架以红色点成像的限制性位点通过FRET(荧光共振能量转移)揭示，所述FRET使用嵌入的YOYO-1染料(供体)的激光激发，该染料以非辐射方式将能量转移至共价纳入DNA分子内的Alexa 647荧光(受体)。通过仅要求一个激发源，FRET成像有利地简化了图像采集同时还使来自未纳入的荧光的背景荧光最小化(4)。通过质心(centroid)之间使用Image J软件的距离测量(像素)(5)来构建单个DNA分子的图谱的限制或“Nmap”，所述质心在标记了限制性位点的点处确定。然后，片段大小(kb)通过将像素长度乘以转换因子(kb/像素)来估算，其在优化Nmap数据集(906个Nmap)成对对齐率后还可以提供明显的DNA拉伸(X/L＝0.85；全长，X/L＝1)，对计算自序列的花中间原体Nt.BspQI限制性图谱使用SOMA软件(6-8)。SOMA对齐参数纳入预期实验误差，诸如大小，和缺失，或假点，并且将781/906(86％)的Nmap与花中间原体参照图谱进行了比对(图5)。
延长的DNA与纳米狭缝的显微镜和数据采集。将与进行激发的氩激光(488nm，Spectra Physics)偶联的Zeiss 135M(63X物镜)用于对YOYO-1染色的DNA分子进行成像。手动收集，实验室软件(1)，控制Hamamatsu Orca-M(日本滨松市)相机拍摄静止图像，或将Andor iXon EMCCD(Andor技术股份有限公司(Andor Technology Ltd.))相机用于在停泊和加载期间获取影像。为了收集具有经历FRET的点的分子，过滤器支架在两个不同位置具有过滤器：在位置1，YOYO-1激发(XF3086)和在位置2，Alexa fluor 647(XF3076；欧米茄光学公司(Omega Optical,Inc.))的FRET激发(1)。
静电和布朗动力学模拟
为了指导我们用于纳米狭缝微-通道网络内DNA停泊和加载的装置的设计，我们使用以下方法和近似方法模拟了其电特性。通过二维静电泊松(electrostatic Poisson)方程考虑装置上的电势分布，其中微通道-纳米裂缝网络通过各向异性电导性张量建模，而PDMS外部的域具有各向同性的本体缓冲液电导性。假定缓冲液-PDMS边界上的电流连续性以及浴槽(bath)/储罐(tank)壁上的电流绝缘。位于浴槽对角的电极彼此之间具有一定的电势差，停泊步骤时约为20V而加载步骤时约为70V。网络内产生的电势分布代表了网络中许多阶段的平均电势增长并且没有捕获到微通道通过杯状物到纳米狭缝转换的复杂细节，其涉及德拜层和电渗现象。为了推导纳米狭缝-微通道网络的各向异性电导性张量，我们将其近似为一个周期性电阻器网络，其中的单格(unit cell)仅由两个“电阻器”组成：一个代表微通道的电阻，另一个代表纳米狭缝的电阻(图5)。电阻值使用一维狭窄电解质通道模型的分析处理获得，所述模型涉及泊松-玻尔兹曼(Poisson-Boltzmann)和纳维叶-斯托克斯(Navier-Stokes)方程组(9-10)。
网络电导性张量由下式给出：
Figure BDA0002277696920000281
其中，Px、Py分别是x和y方向的网络的阶段，Ln是纳米狭缝通道的长度，Rn、Rm是纳米狭缝和微通道区段的电阻，而α是与正向x方向的纳米狭缝角度。电阻Rn、Rm的一维问题使用COMSOL多物理包(COMSOL Multi-physics package)的有限元方法(FEM)解决。典型的电势和电流分布示于图5右侧。例如，对于装有0.5mM缓冲液的20mm x 20mm储罐中的10mm x10mm装置(产生近似于30nm量级的德拜层长度)，并且预期70V的电极电势差跨PDMS时降低约4V。微通道内的相应电场约为8V/cm。
为了进行详细的静电研究，以指导电极的位置以及了解静电力的值和方向，进行了FEM方案，其中在整个装置上对麦克斯韦(Maxwell)方程进行数值求解。COMSOL多物理包也用于此任务。域离散化产生具有1250万自由度的模拟，其使用二阶三角形元并包括126个微通道和138,600个纳米狭缝。进行了三组模拟，其中正电极和负电极的位置相对于彼此发生了变化，以探索最佳条件，即确保分子停泊和加载的电场方向和静电力。
图6显示了用于二维和三维FE分析的代表性网格。在图中，我们包括静电(2D)和纳维叶-斯托克斯/能斯特-普朗克(3D)模拟的代表性网格。理论设计的主要组成部分是能够在每个微通道中控制相对于微通道轴向的电场角。这种考虑对于控制电泳或电渗力作用下的DNA分子方向至关重要。在该图中，当电极位于位置1和5时，电场角是x坐标的函数。值的注意的是对于位置1，微通道内的电场方向在25°和30°之间，甚至可以控制整个装置中DNA的迁移。然而，如果电极位于位置5，电场角从底部到顶部会有急剧变化；并且在某些区域中，角度甚至大于90°。位置1允许在整个装置中进行受控的迁移以及同步的停泊和加载。这一优势确保了装置区域的完整使用，预示着高通量操作。例如，用于该工作的装置包括：128个微通道x 1100个纳米狭缝x 28微米长的纳米狭缝，其可以以2.28kb/μm的速率容纳的DNA分子(YOYO-1染色的DNA)＝8.84Gb，这相当于装置加载前2.8个人类基因组。
用DNA、珠和若丹明染料的电渗流实验
离子强度影响微通道/纳米狭缝装置内的DNA迁移。使用不同离子强度条件(IS＝0.5mM(0.05X TE)或8.5mM(1X TE)；pH＝7.9)的DNA分子测试离子强度条件如何影响微通道中的电渗流(图2A1、2A2和2B)通过毛细管流将DNA分子加载到微通道中，将装置浸入缓冲液中，然后施加电场。在该实验中使用了两种不同的装置(图7)：此处所述的装置以及仅有微通道的装置(100μm宽x 3.3μm高；(2))。离子强度沿DNA迁移的方向变化，以告知微通道内电渗和电泳流的贡献。向该装置施加20V电压，并使用连接Pinnacle Studio软件的SIT相机对分子进行成像。使用Image J软件分析分子以追踪分子的质心位置。在较低离子强度的环境下，微通道中的迁移是急性的——电渗流占主导地位。在高离子强度条件下，电泳力占主导。
羧基封端的或天然聚苯乙烯珠。将羧基封端的珠(0.11μm直径；分子探针，俄勒冈州尤金)和天然聚苯乙烯珠(0.11μm直径；聚合科学公司(Polyscience)，宾夕法尼亚州沃林顿)在0.5mM NaCl pH＝6.4中稀释用于在微通道中后续分析电渗流。通过毛细管加载将珠加载到微通道中，然后将整个装置浸入缓冲液(0.5mM NaCl pH＝6.4)中，将有机玻璃支架安装到显微镜支架上，并将电源连接到电极上。将珠在微通道内电动移动(20V)以检查加载方向：钝性(以电泳为主)；或急性(以电渗为主)。羧基封端的(图8A)和天然的聚苯乙烯珠(图8B)这两组珠在低离子强度下以急性加载(通过电渗流)在微通道中迁移，其与DNA分子的方向相同；这表明电渗流在微通道中占主导地位。使用Andor iXon相机以约15帧/秒的帧速率在微通道中对稀释的珠(羧基封端的或天然的聚苯乙烯)进行成像，并使用ImageJ随时跟踪(5)。
若丹明B染料。在微通道内形成0.9mM若丹明B(赛默飞世尔科技公司，马萨诸塞州沃尔瑟姆)染料(pH 4.7)的塞来说明电渗流。为了形成塞，将水引入装置，然后除去多余的水(装置外的水)，将若丹明B样品添加到装置另一侧的入口；使用抽吸器除去一些水，最后将装置浸入水中。将电压(50V)施加到该装置上，导致染料在微通道中迁移，使用与计算机控制的Pinnacle Studio视频数字化仪相连的SIT 68相机对其进行成像。手动分析所得的视频以追踪染料迁移模式(图4A-4C)。若丹明朝阳极的运动表明电渗力。
羧基封端的或天然的聚苯乙烯珠的ζ电势测量。天然的或羧基封端的聚苯乙烯珠(0.11μm)分别购自聚合科学公司和英杰公司(Invitrogen)。使用Zetasizer Nano ZS仪器(马尔文仪器公司(Malvern Instruments)，英国乌斯特郡)测量天然的聚苯乙烯珠以及羧化聚苯乙烯珠的ζ电势并参考标准溶液(68+6.8mV；马尔文仪器公司，英国乌斯特郡)。使用蒸馏、高压灭菌并过滤的水稀释天然的和羧基封端的聚苯乙烯珠(0.2μm过滤器)，然后调至0.5mM NaCl。
已通过一个或多个优选的实施方式描述了本发明，但应理解，除了明确描述的那些方案之外，许多等同方案、替代方案、变化方案和修改方案是可能实现的并在本发明范围内。
参照图1A-9，本公开还包括下述陈述：
1.一种微流体装置，其包括：
由一级微通道壁限定的一级微通道，所述一级微通道壁具有一级远端微通道表面，所述一级远端微通道表面具有第一一级远端微通道开口，所述一级微通道具有一级微通道高度；
由二级微通道壁限定的二级微通道，所述二级微通道壁具有二级近端微通道表面，所述二级近端微通道表面具有第一二级近端微通道开口，所述二级微通道具有二级微通道高度；
第一一级纳米狭缝，所述第一一级纳米狭缝具有第一一级纳米狭缝高度、第一一级纳米狭缝宽度和第一一级纳米狭缝长度；和
具有第一一级近端停泊腔室高度、第一一级近端停泊腔室宽度和第一一级近端停泊腔室长度的第一一级近端停泊腔室，所述第一一级纳米狭缝连接所述第一一级近端停泊腔室，所述第一一级近端停泊腔室由所述第一一级远端微通道开口连接所述一级微通道，所述第一一级纳米狭缝由所述第一二级近端微通道开口与所述二级微通道流体连通。
2.如陈述1所述的微流体装置，所述微流体装置还包括具有第一一级远端停泊腔室高度、第一一级远端停泊腔室宽度和第一一级远端腔室长度的第一一级远端停泊腔室，所述第一一级纳米狭缝连接所述第一一级远端停泊腔室，所述第一一级远端停泊腔室由所述第一二级近端微通道开口连接所述二级微通道。
3.如陈述1或2所述的微流体装置，其中，所述第一一级近端停泊腔室具有1nm3-1mm3的第一一级近端停泊腔室体积。
4.如陈述3所述的微流体装置，其中，所述第一一级近端停泊腔室体积是1μm3-250μm3。
5.如陈述2-4中任一项所述的微流体装置，其中，所述第一一级远端停泊腔室具有1nm3-1mm3的第一一级远端停泊腔室体积。
6.如陈述5所述的微流体装置，其中，所述第一一级远端停泊腔室体积是1μm3-250μm3。
7.如前述陈述中任一项所述的微流体装置，其中，所述第一一级近端停泊腔室被设置成由整数数量感兴趣的分子或颗粒占据，其各自具有卷曲结构，并且排除其他感兴趣的分子或颗粒进入。
8.如陈述7所述的微流体装置，其中，所述整数数量感兴趣的分子或颗粒是单个感兴趣的分子或颗粒。
9.如陈述7或8所述的微流体装置，其中，所述整数数量感兴趣的分子或颗粒和/或其他感兴趣的分子或颗粒是核酸分子。
10.如前述陈述中任一项所述的微流体装置，其中，所述第一一级近端停泊腔室高度是所述一级微通道高度的1％-125％。
11.如前述陈述中任一项所述的微流体装置，其中，所述第一一级近端停泊腔室高度是所述一级微通道高度的75％-100％。
12.如陈述2-11中任一项所述的微流体装置，其中，所述第一一级远端停泊腔室高度是所述二级微通道高度的1％-125％。
13.如陈述2-12中任一项所述的微流体装置，其中，所述第一一级远端停泊腔室高度是所述二级微通道高度的75％-100％。
14.如前述陈述中任一项所述的微流体装置，其中，所述第一一级近端停泊腔室高度为10nm-10mm、100nm-50μm或1.0μm-5.0μm。
15.如前述陈述中任一项所述的微流体装置，其中，所述第一一级近端停泊腔室宽度为10nm-10mm、100nm-50μm或1.0μm-5.0μm。
16.如前述陈述中任一项所述的微流体装置，其中，所述第一一级近端停泊腔室长度为10nm-10mm、100nm-50μm或1.0μm-10.0μm。
17.如陈述2-16中任一项所述的微流体装置，其中，所述第一一级远端停泊腔室高度为10nm-10mm、100nm-50μm或1.0μm-5.0μm。
18.如陈述2-17中任一项所述的微流体装置，其中，所述第一一级远端停泊腔室宽度为10nm-10mm、100nm-50μm或1.0μm-5.0μm。
19.如陈述2-18中任一项所述的微流体装置，其中，所述第一一级远端停泊腔室长度为10nm-10mm、100nm-50μm或1.0μm-10.0μm。
20.如前述陈述中任一项所述的微流体装置，其中，所述第一一级纳米狭缝高度小于所述第一一级近端停泊腔室高度的50％、25％或10％。
21.如前述陈述中任一项所述的微流体装置，其中，所述第一一级纳米狭缝高度小于或等于100nm。
22.如前述陈述中任一项所述的微流体装置，其中，所述第一一级纳米狭缝宽度小于所述第一一级近端停泊腔室宽度的50％、25％或10％。
23.如前述陈述中任一项所述的微流体装置，其中，所述第一一级纳米狭缝宽度小于或等于1μm。
24.如前述陈述中任一项所述的微流体装置，其中，所述第一一级纳米狭缝长度为1μm-10mm。
25.如前述陈述中任一项所述的微流体装置，其中，所述第一一级纳米狭缝长度为10μm-100μm。
26.如前述陈述中任一项所述的微流体装置，其中，所述第一一级纳米狭缝以相对于所述一级微通道纵轴1°-89°的角度取向。
27.如陈述26所述的微流体装置，其中，所述第一一级纳米狭缝以相对于所述一级微通道纵轴10°-80°的角度取向。
28.如陈述27所述的微流体装置，其中，所述第一一级纳米狭缝以相对于所述一级微通道纵轴40°-50°的角度取向。
29.如前述陈述中任一项所述的微流体装置，其中，所述第一一级纳米狭缝具有第一一级纳米狭缝横截面积，所述第一一级纳米狭缝横截面积小于所述第一一级近端停泊腔室的第一一级近端停泊腔室横截面积的25％。
30.如前述陈述中任一项所述的微流体装置，其中，所述一级远端微通道表面和所述二级近端微通道表面通过1μm-10mm的一级微通道分隔距离分隔。
31.如陈述30所述的微流体装置，其中，所述一级微通道分隔距离是5μm-1mm或10μm-100μm。
32.如前述陈述中任一项所述的微流体装置，其中，所述一级远端微通道表面还具有第二一级远端微通道开口，所述二级近端微通道表面具有第二二级近端微通道开口，所述微流体装置还包括：
第二一级纳米狭缝，所述第二一级纳米狭缝具有第二一级纳米狭缝高度、第二一级纳米狭缝宽度和第二一级纳米狭缝长度；和
具有第二一级近端停泊腔室高度、第二一级近端停泊腔室宽度和第二一级近端停泊腔室长度的第二一级近端停泊腔室，所述第二一级近端纳米狭缝连接所述第二一级近端停泊腔室，所述第二一级近端停泊腔室由所述第二一级远端微通道开口连接所述一级微通道，所述第二一级纳米狭缝由所述第二二级近端微通道开口与所述二级微通道流体连通。
33.如陈述32所述的微流体装置，所述微流体装置还包括具有第二一级远端停泊腔室高度、第二一级远端停泊腔室宽度和第二一级远端腔室长度的第二一级远端停泊腔室，所述第二一级纳米狭缝连接所述第二一级远端停泊腔室，所述第二一级远端停泊腔室由所述第二二级近端微通道开口连接所述二级微通道。
34.如前述陈述中任一项所述的微流体装置，其中，所述一级远端微通道表面还具有多个一级远端微通道开口，所述二级近端微通道表面具有多个二级近端微通道开口，所述微流体装置还包括：
多个一级纳米狭缝；和
多个一级近端停泊腔室，所述多个一级近端纳米狭缝各自连接所述多个一级近端停泊腔室中相应的一个，所述多个一级近端停泊腔室各自由所述多个一级远端微通道开口中相应的一个连接所述一级微通道，所述多个一级纳米狭缝各自由所述多个二级近端微通道开口中相应的一个与所述二级微通道流体连通。
35.如陈述34所述的微流体装置，所述微流体装置还包括多个一级远端停泊腔室，所述多个一级纳米狭缝各自连接所述多个一级远端停泊腔室中相应的一个，所述多个一级远端停泊腔室各自由所述多个二级近端微通道开口中相应的一个连接所述第二微通道。
36.如陈述34或35所述的微流体装置，其中，所述第二一级近端停泊腔室，所述第二一级远端停泊腔室，所述多个一级近端停泊腔室中的一个或多个，或者所述多个一级远端停泊腔室中的一个或多个具有1nm3-1mm3或1μm3-250μm3的停泊腔室体积。
37.如陈述34-36中任一项所述的微流体装置，其中，所述多个一级近端停泊腔室中的每一个或者所述多个一级远端停泊腔室中的每一个被设置成由处于卷曲结构的整数数量的感兴趣的单分子或颗粒或感兴趣的分子或颗粒占据，并且排除其他感兴趣的分子或颗粒进入。
38.如陈述34-37中任一项所述的微流体装置，其中，所述多个一级近端停泊腔室各自具有1％-125％或75％-100％所述一级微通道高度的一级近端停泊腔室高度。
39.如陈述35-38中任一项所述的微流体装置，其中，所述多个一级远端停泊腔室具有1％-125％或75％-100％所述二级微通道高度的一级远端停泊腔室高度。
40.如陈述34-39中任一项所述的微流体装置，其中，所述多个一级近端停泊腔室各自具有10nm-10mm、100nm-50μm或1.0μm-5.0μm的一级近端停泊腔室高度。
41.如陈述34-40中任一项所述的微流体装置，其中，所述多个一级近端停泊腔室各自具有10nm-10mm、100nm-50μm或1.0μm-5.0μm的一级近端停泊腔室宽度。
42.如陈述34-41中任一项所述的微流体装置，其中，所述多个一级近端停泊腔室各自具有10nm-10mm、100nm-50μm或1.0μm-10.0μm的一级近端停泊腔室长度。
43.如陈述35-42中任一项所述的微流体装置，其中，所述多个一级远端停泊腔室各自具有10nm-10mm、100nm-50μm或1.0μm-5.0μm的一级远端停泊腔室高度。
44.如陈述35-43中任一项所述的微流体装置，其中，所述多个一级远端停泊腔室各自具有10nm-10mm、100nm-50μm或1.0μm-5.0μm的一级远端停泊腔室宽度。
45.如陈述35-44中任一项所述的微流体装置，其中，所述多个一级远端停泊腔室各自具有10nm-10mm、100nm-50μm或1.0μm-10.0μm的一级远端停泊腔室长度。
46.如陈述34-45中任一项所述的微流体装置，其中，所述多个一级纳米狭缝各自具有一级纳米狭缝高度，所述一级纳米狭缝高度小于所述多个一级纳米狭缝各自连接的多个一级近端停泊腔室中相应的一个对应的一级近端停泊腔室高度的50％、25％或10％。
47.如陈述46所述的微流体装置，其中，所述一级纳米狭缝高度小于或等于100nm。
48.如陈述34-47中任一项所述的微流体装置，其中，所述多个一级纳米狭缝各自具有一级纳米狭缝宽度，所述一级纳米狭缝宽度小于所述多个一级纳米狭缝各自连接的多个一级近端停泊腔室中相应的一个对应的一级近端停泊腔室宽度的50％、25％或10％。
49.如陈述48所述的微流体装置，其中，所述一级纳米狭缝宽度小于或等于1μm。
50.如陈述34-49中任一项所述的微流体装置，其中，所述多个一级纳米狭缝各自具有1μm-10mm或10μm-100μm的一级纳米狭缝长度。
51.如陈述34-50中任一项所述的微流体装置，其中，所述多个一级纳米狭缝各自以相对于所述一级微通道纵轴1°-89°、10°-80°或40°-50°的角度取向。
52.如陈述34-51中任一项所述的微流体装置，其中，所述多个一级纳米狭缝各自具有一级纳米狭缝横截面积，所述一级纳米狭缝横截面积小于所述多个一级纳米狭缝各自连接的多个一级近端停泊腔室中相应的一个对应的一级近端停泊腔室横截面积的25％。
53.如陈述34-52中任一项所述的微流体装置，其中，所述多个一级纳米狭缝彼此之间基本平行。
54.如陈述34-53中任一项所述的微流体装置，其中，所述多个一级纳米狭缝的长度基本相同。
55.如陈述34-57中任一项所述的微流体装置，其中，所述多个一级纳米狭缝具有不同长度的统计学分布。
56.如陈述34-58中任一项所述的微流体装置，其中，所述多个一级近端停泊腔室由1nm-1mm、100nm-100μm或1μm-25μm的一级停泊腔室分隔距离所分隔。
57.如陈述34-56中任一项所述的微流体装置，其中，所述多个一级纳米狭缝包括至少100个一级纳米狭缝。
58.如陈述34-57中任一项所述的微流体装置，其中，所述多个一级纳米狭缝包括至少500个纳米狭缝。
59.如陈述34-58中任一项所述的微流体装置，其中，所述多个一级纳米狭缝包括至少1000个纳米狭缝。
60.如前述陈述中任一项所述的微流体装置，其中，所述二级微通道壁具有二级远端微通道表面，所述二级远端微通道表面具有第一二级远端微通道开口，所述微流体装置还包括：
由三级微通道壁限定的三级微通道，所述三级微通道壁具有三级近端微通道表面，所述三级近端微通道表面具有第一三级近端微通道开口，所述三级微通道具有三级微通道高度；
第一二级纳米狭缝，所述第一二级纳米狭缝具有第一二级纳米狭缝高度、第一二级纳米狭缝宽度和第一二级纳米狭缝长度；和
具有第一二级近端停泊腔室高度、第一二级近端停泊腔室宽度和第一二级近端停泊腔室长度的第一二级近端停泊腔室，所述第一二级纳米狭缝连接所述第一二级近端停泊腔室，所述第一二级近端停泊腔室由所述第一二级远端微通道开口连接所述一级微通道，所述第一二级纳米狭缝由所述第一三级近端微通道开口与所述第三微通道流体连通。
61.如陈述60所述的微流体装置，所述微流体装置还包括具有第一二级远端停泊腔室高度、第一二级远端停泊腔室宽度和第一二级远端腔室长度的第一二级远端停泊腔室，所述第一二级纳米狭缝连接所述第一二级远端停泊腔室，所述第一一级远端停泊腔室由所述第一三级近端微通道开口连接所述三级微通道。
62.如陈述60或61所述的微流体装置，其中，所述二级远端微通道表面还具有多个二级远端微通道开口，所述三级近端微通道表面具有多个三级近端微通道开口，所述微流体装置还包括：
多个二级纳米狭缝；和
多个二级近端停泊腔室，所述多个二级近端纳米狭缝各自连接所述多个二级近端停泊腔室中相应的一个，所述多个二级近端停泊腔室各自由所述多个二级远端微通道开口中相应的一个连接所述二级微通道，所述多个一级纳米狭缝各自由所述多个三级近端微通道开口中相应的一个与所述三级微通道流体连通。
63.如陈述62所述的微流体装置，所述微流体装置还包括多个二级远端停泊腔室，所述多个二级纳米狭缝各自连接所述多个二级远端停泊腔室中相应的一个，所述多个二级远端停泊腔室各自由所述多个三级近端微通道开口中相应的一个连接所述三级微通道。
64.如前述陈述中任一项所述的微流体装置，所述微流体装置还包括：
多个微通道，所述多个微通道各自由微通道壁限定，所述微通道壁具有远端微通道表面，所述远端微通道表面具有多个远端微通道开口，所述微通道壁具有近端微通道表面，所述近端微通道表面具有多个近端微通道开口；
一系列多个纳米狭缝；
一系列多个近端停泊腔室；和
其中所述一系列多个纳米狭缝中的各纳米狭缝连接所述一系列多个近端停泊腔室中相应近端停泊腔室，
其中所述一系列多个近端停泊腔室中的各近端停泊腔室由所述多个近端微通道开口相应的近端微通道开口连接所述多个微通道相应的近端微通道，
其中所述一系列多个纳米狭缝中的各纳米狭缝由所述多个远端微通道开口相应的远端微通道开口与相应的远端微通道流体连通，和
其中，所述相应的远端微通道邻近所述相应的近端微通道。
65.如陈述64所述的微流体装置，所述微流体装置还包括：
一系列多个远端停泊腔室，
其中所述一系列多个纳米狭缝中的各纳米狭缝连接所述一系列多个远端停泊腔室中相应的远端停泊腔室，
其中所述一系列多个远端停泊腔室中的各远端停泊腔室连接所述多个微通道相应的远端微通道。
66.如陈述64或65所述的微流体装置，其中，所述多个微通道是开放式的。
67.如陈述64-66中任一项所述的微流体装置，其中，所述多个微通道各自是均匀分布的。
68.如陈述64-67中任一项所述的微流体装置，其中，所述多个微通道各自通过不同距离的统计学分布间隔。
69.如陈述64-68中任一项所述的微流体装置，所述微流体装置还包括：
由最后微通道壁限定的最后微通道，所述最后微通道壁具有最后近端微通道表面，所述最后近端微通道表面具有多个最后近端微通道开口，其中所述第一微通道和最后微通道位于所述多个微通道的相对端，所述多个微通道包括与所述最后微通道最接近的倒数第二微通道，所述倒数第二微通道由倒数第二微通道壁限定，所述倒数第二微通道壁具有倒数第二远端微通道表面，所述倒数第二远端微通道表面具有多个倒数第二微通道开口；
多个最后纳米狭缝；
多个最后近端停泊腔室；和
多个最后远端停泊腔室，
其中，所述多个最后纳米狭缝各自连接所述多个最后近端停泊腔室中相应的最后近端停泊腔室，
其中，所述多个最后纳米狭缝各自连接多个最后远端停泊腔室中相应的最后远端停泊腔室，
其中，所述多个最后近端停泊腔室各自由所述多个倒数第二远端微通道开口中相应的一个连接所述倒数第二微通道，和
其中，所述多个最后远端停泊腔室各自由所述多个最后近端微通道开口中相应的一个连接所述最后微通道。
70.如陈述69所述的微流体装置，其中，所述第一微通道和所述最后微通道流体连通。
如前述陈述中任一项所述的微通流体装置，其中，所述微流体装置内至少50％、至少75％或至少90％的纳米狭缝被一种且仅一种感兴趣的分子或颗粒或感兴趣的核酸分子占据。
71.一种系统，其包括：
如前述陈述中任一项所述的微流体装置；
装置接收腔室，所述装置接收腔室包括装置定向部分和至少两个电极，所述装置定向部分设置成接收所述微流体装置并相对于所述至少两个电极可再生产地定向微流体装置；
与所述至少两个电极电连通的电力供应器；和
设置成执行电力供应方案的电力供应控制器。
72.如陈述71所述的系统，所述系统还包括加热器或冷却器，其被设置成加热或冷却所述微流体装置和/或所述装置接收腔室内的液体。
73.如陈述71或72所述的系统，所述系统还包括温度测量装置，其被设置成测量所述微流体装置和/或所述装置接收腔室内的流体温度。
74.如陈述71-73中任一项所述的系统，所述系统还包括分光仪，其被设置成光学问询位于所述微流体装置中的分子。
75.如陈述74所述的系统，其中，所述分光仪具有足以区分位于邻近纳米狭缝中分子之间的空间分辨率。
76.如陈述74或75所述的系统，其中，所述分光仪设置成监测一个或多个停泊腔室和/或一个或多个纳米狭缝的占据状态。
77.如陈述74-76中任一项所述的系统，其中，所述分光仪是荧光显微镜。
78.如陈述71-77中任一项所述的系统，所述系统还包括用户输入。
79.如陈述71-78中任一项所述的系统，其中，所述电力供应控制器被编程或设置成接收关于感兴趣的分子或颗粒的核酸静电或流体动力学信息，关于所述微流体装置的微流体装置静电或流体动力学信息，关于感兴趣的缓冲液的缓冲液离子强度信息，或其组合。
80.如陈述71-79中任一项所述的系统，其中，所述电力供应方案被设置成提供第一电压持续第一时间长度、第二电压持续第二时间长度和第三电压持续第三时间长度，其中所述第一电压和所述第一时间长度被设置成将分子加载到相关联的停泊腔室中，其中所述第二电压和所述第二时间长度被设置成将分子从所述相关联的停泊腔室加载到相关纳米狭缝，所述纳米狭缝各自连接所述相关停泊腔室之一，并且其中所述第三电压和所述第三时间长度被设置成允许所述核酸分子加载到所述相关纳米狭缝中以具有哑铃构型。
81.如陈述71-80中任一项所述的系统，其中，所述电力供应方案被设置成在电渗力支配分子运动的条件下将分子加载到停泊腔室。
82.如陈述71-80中任一项所述的系统，其中，所述电力供应方案被设置成施电压方案，所述电压方案施加第一电压以将多种感兴趣的分子或颗粒加载到对应的停泊腔室并施加第二电压，所述第二电压对第一尺寸分子的加载效率大于50％并且对第二尺寸分子的加载效率小于50％，从而令具有尺寸分布的部分多种感兴趣的分子或颗粒选择性加载于多个纳米狭缝，所述尺寸分布相较于多种感兴趣的分子或颗粒偏重于第一尺寸。
83.一种系统，其包括：
设置成用于分离多种感兴趣的分子或颗粒的微流体装置，所述微流体装置包括多个停泊腔室和多个纳米狭缝，所述多个纳米狭缝各自连接所述多个停泊腔室中相关联的停泊腔室，所述多个停泊腔室各自连接所述多个纳米狭缝中相关联的纳米狭缝；
至少两个电极，其中所述至少两个电极相对于微流体装置定位以致施加电压到所述至少两个电极时提供横跨所述多个纳米狭缝的至少部分所述电压；
与所述至少两个电极电连通的电力供应器；和
设置成执行电力供应方案的电力供应控制器，所述电压供应方案被设置成在令选择性加载的感兴趣的分子或颗粒的运动与电渗力的方向至少部分对齐的条件下将所述多种感兴趣的分子或颗粒中的一种且仅一种选择性地加载到所述多个停泊腔室的至少部分，所述电力供应方案利用(a)所述微流体装置相对于所述至少两个电极的几何结构，(b)所述微流体装置内离子缓冲液的离子强度，和(c)所述微流体装置的静电或流体动力学性质和所述多种感兴趣的分子或颗粒的静电或流体动力学性质。
84.一种系统，其包括：
设置成用于分离多种感兴趣的分子或颗粒的微流体装置，所述微流体装置包括多个停泊腔室和多个纳米狭缝，所述多个纳米狭缝各自连接所述多个停泊腔室中相关联的停泊腔室，所述多个停泊腔室各自连接所述多个纳米狭缝中相关联的纳米狭缝；
至少两个电极，其中所述至少两个电极相对于微流体装置定位以致施加电压到所述至少两个电极时提供横跨所述多个纳米狭缝的至少部分所述电压；
与所述至少两个电极电连通的电力供应器；和
设置成执行电力供应方案的电力供应控制器，所述电力供应方案被设置成施行电压方案，所述电压方案施加第一电压以将所述多种感兴趣的分子或颗粒加载到对应的停泊腔室并施加第二电压，所述第二电压对第一尺寸分子的加载效率大于50％并且对第二尺寸分子的加载效率小于50％，从而令具有尺寸分布的部分所述多种感兴趣的分子或颗粒选择性加载于多个纳米狭缝，所述尺寸分布相较于所述多种感兴趣的分子或颗粒偏重于第一尺寸。
85.一种将多种感兴趣的分子或颗粒的至少部分加载到多个纳米狭缝的方法，所述方法包括：
将所述多种感兴趣的分子或颗粒导入与多个停泊腔室连通的微通道，所述多个停泊腔室连接对应的多个纳米狭缝，所述微通道、所述多个停泊腔室和所述对应的多个纳米狭缝各自包含具有离子强度的离子缓冲液；
施加第一电压持续第一时间长度，所述第一电压大于第一电压阈值并小于第二电压阈值，从而导致所述多个停泊腔室的至少部分被一种且仅一种感兴趣的分子或颗粒占据；
施加第二电压持续第二时间长度，所述第二电压大于第二电压阈值，从而导致一种且仅一种感兴趣的分子或颗粒被加载于所述多个纳米狭缝的至少部分；和
施加第三电压持续第三时间长度，所述第三电压小于第一电压阈值或者零电压，从而导致所述感兴趣的分子或颗粒被加载于所述多个纳米狭缝的至少部分以具有哑铃构型。
86.如陈述85所述的方法，所述方法还包括光学问询具有哑铃构型的分子。
87.如陈述85或86所述的方法，所述方法还包括对所述分子的序列进行映射。
88.如陈述85-87中任一项所述的方法，其中，选择所述第一电压以提供条件致使所述条件中电渗力导致至少50％的分子运动。
89.如陈述85-88中任一项所述的方法，其中，选择所述第二电压和所述第二时间长度以为第一尺寸分子提供大于50％的加载效率并为第二尺寸分子提供小于50％的加载效率，从而令具有尺寸分布的部分所述多种感兴趣的分子或颗粒加载于所述多个纳米狭缝，所述尺寸分布多种感兴趣的分子或颗粒的部分相较于所述多种感兴趣的分子或颗粒的整体偏重于第一尺寸。
90.如陈述85-89中任一项所述的方法，其中，以相对于所述至少部分多个纳米狭缝+45°至-45°之间的角度施加第一电压、第二电压、第三电压或其组合。
91.如陈述85-90中任一项所述的方法，所述方法使用陈述1-10中任一项所述的装置或陈述71-84中任一项所述的系统进行。

Claims (20)

1.一种将多种感兴趣的分子或颗粒的至少部分加载到多个纳米狭缝的方法，所述方法包括：
a)将所述多种感兴趣的分子或颗粒导入与多个停泊腔室连通的微通道，所述多个停泊腔室连接对应的多个纳米狭缝,所述微通道、所述多个停泊腔室和所述对应的多个纳米狭缝各自包含具有离子强度的离子缓冲液；
b)施加第一电压持续第一时间间隔，所述第一电压大于第一电压阈值并小于第二电压阈值，从而导致所述多个停泊腔室的至少部分被一种且仅一种感兴趣的分子或颗粒占据；
c)施加第二电压持续第二时间间隔，所述第二电压大于第二电压阈值，从而导致来自所述多个停泊腔室的至少部分的一种且仅一种感兴趣的分子或颗粒被加载于所述多个纳米狭缝的至少部分；和
d)施加小于第一电压阈值或者零电压的第三电压持续第三时间间隔，从而导致所述感兴趣的分子或颗粒被加载于所述多个纳米狭缝的至少部分以呈现哑铃构型。
2.如权利要求1所述的方法，其中，选择所述第一电压、第一时间间隔、第二电压、第二时间间隔、第三电压、第三时间间隔或其组合，从而将导入所述微通道的至少50％所述多种感兴趣的分子或颗粒加载于所述纳米狭缝并呈现哑铃构型。
3.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括：
e)光学问询所述多种感兴趣的分子或颗粒的至少部分。
4.如权利要求1所述的方法，其中，所述感兴趣的分子或颗粒是核酸分子。
5.如权利要求4所述的方法，所述方法还包括对所述多种核酸分子的部分进行映射。
6.如权利要求1所述的方法，其中，选择所述第一电压以提供条件致使所述条件中分子由所述微通道移动到所述多个停泊腔室的部分的运动与电渗力的方向至少部分对齐。
7.如权利要求1项所述的方法，其中，选择所述第二电压和所述第二时间间隔以为第一尺寸分子提供大于50％的加载效率并为第二尺寸分子提供小于50％的加载效率，从而令具有尺寸分布的部分所述多种感兴趣的分子或颗粒加载于所述多个纳米狭缝，所述尺寸分布相较于全体所述多种感兴趣的分子或颗粒偏重于第一尺寸。
8.如权利要求1所述的方法，其中，以相对于至少部分所述多个纳米狭缝+45°至-45°之间的角度施加第一电压、第二电压、第三电压或其组合。
9.一种系统，其包括：
设置成用于分离多种感兴趣的分子或颗粒的微流体装置，所述微流体装置包括多个停泊腔室和多个纳米狭缝，所述多个纳米狭缝各自连接所述多个停泊腔室中相关联的停泊腔室，所述多个停泊腔室各自连接所述多个纳米狭缝中相关联的纳米狭缝；
至少两个电极，其中所述至少两个电极相对于微流体装置定位以致施加电压到所述至少两个电极时提供横跨所述多个纳米狭缝的至少部分所述电压；
与所述至少两个电极电连通的电力供应器；和
设置成执行电力供应方案的电力供应控制器，其中，所述电力供应方案设置成进行下述一项或多项：
施加第一电压持续第一时间间隔、第二电压持续第二时间间隔和第三电压持续第三时间间隔，其中所述第一电压和所述第一时间间隔被设置成导致所述多个停泊腔室的至少部分被一种且仅一种感兴趣的分子或颗粒占据，其中所述第二电压和所述第二时间间隔被设置成导致来自所述多个停泊腔室的至少部分的一种且仅一种感兴趣的分子或颗粒被加载于所述多个纳米狭缝的至少部分，并且其中所述第三电压和所述第三时间间隔被设置成允许所述感兴趣的分子或颗粒被加载于所述多个纳米狭缝的至少部分以呈现哑铃构型，
在令选择性加载的感兴趣的分子或颗粒的运动与电渗力的方向至少部分对齐的条件下将所述多种感兴趣的分子或颗粒中的一种且仅一种选择性地加载到所述多个停泊腔室的至少部分，所述电力供应方案利用(a)所述微流体装置相对于所述至少两个电极的几何结构，(b)所述微流体装置内离子缓冲液的离子强度，和(c)所述微流体装置的静电或流体动力学性质和所述多种感兴趣的分子或颗粒的静电或流体动力学性质，或
施行电压方案，所述电压方案施加一级电压以将所述多种感兴趣的分子或颗粒的至少第二部分加载到对应的停泊腔室并施加二级电压，所述二级电压对第一尺寸分子的加载效率大于50％并且对第二尺寸分子的加载效率小于50％，从而令具有尺寸分布的部分所述多种感兴趣的分子或颗粒选择性加载于所述多个纳米狭缝，所述尺寸分布相较于所述多种感兴趣的分子或颗粒偏重于第一尺寸。
10.如权利要求9所述的系统，所述系统还包括加热器或冷却器，其被设置成加热或冷却所述微流体装置内的液体。
11.如实施方式9所述的系统，所述系统还包括温度测量装置，其被设置成测量所述微流体装置内的流体温度。
12.如权利要求9所述的系统，所述系统还包括分光仪，其被设置成光学问询位于所述微流体装置中的感兴趣的分子或颗粒。
13.如权利要求12所述的系统，其中，所述分光仪具有足以区分加载于邻近纳米狭缝中的感兴趣的分子或颗粒材料之间的空间分辨率。
14.如权利要求12所述的系统，其中，所述分光仪设置成监测所述多个停泊腔室中的一个或多个或所述多个纳米狭缝中的一个或多个的占据状态。
15.如权利要求12所述的系统，其中，所述分光仪是荧光显微镜。
16.如权利要求9所述的系统，其中，所述电力供应控制器被编程或设置成接收所述多种感兴趣的分子或颗粒的静电或流体动力学信息，所述微流体装置的静电或流体动力学信息，关于所述微流体装置内离子缓冲液的缓冲液离子强度信息，或其组合。
17.如权利要求9所述的系统，其中，所述电力供应方案被设置成施加第一电压持续第一时间间隔、第二电压持续第二时间间隔和第三电压持续第三时间间隔，其中所述第一电压和所述第一时间间隔被设置成导致所述多个停泊腔室的至少部分被一种且仅一种感兴趣的分子或颗粒占据，其中所述第二电压和所述第二时间间隔被设置成导致来自所述多个停泊腔室的至少部分的一种且仅一种感兴趣的分子或颗粒被加载于所述多个纳米狭缝的至少部分，并且其中所述第三电压和所述第三时间间隔被设置成允许所述感兴趣的分子或颗粒被加载于所述多个纳米狭缝的至少部分以呈现哑铃构型。
18.如权利要求9所述的系统，其中，所述电力供应方案被设置成在令选择性加载的感兴趣的分子或颗粒的运动与电渗力的方向至少部分对齐的条件下将所述多种感兴趣的分子或颗粒中的一种且仅一种选择性地加载到所述多个停泊腔室的至少部分，所述电力供应方案利用(a)所述微流体装置相对于所述至少两个电极的几何结构，(b)所述微流体装置内离子缓冲液的离子强度，和(c)所述微流体装置的静电或流体动力学性质和所述多种感兴趣的分子或颗粒的静电或流体动力学性质。
19.如权利要求9所述的系统，其中，所述电力供应方案被设置成施行电压方案，所述电压方案施加一级电压以将所述多种感兴趣的分子或颗粒的至少第二部分加载到对应的停泊腔室并施加二级电压，所述二级电压对第一尺寸分子的加载效率大于50％并且对第二尺寸分子的加载效率小于50％，从而令具有尺寸分布的部分所述多种感兴趣的分子或颗粒选择性加载于所述多个纳米狭缝，所述尺寸分布相较于所述多种感兴趣的分子或颗粒偏重于第一尺寸。
20.一种微流体装置，其包括：
由一级微通道壁限定的一级微通道，所述一级微通道壁具有一级远端微通道表面，所述一级远端微通道表面具有第一一级远端微通道开口，所述一级微通道具有一级微通道高度；
由二级微通道壁限定的二级微通道，所述二级微通道壁具有二级近端微通道表面，所述二级近端微通道表面具有第一二级近端微通道开口，所述二级微通道具有二级微通道高度；
第一一级纳米狭缝，所述第一一级纳米狭缝具有第一一级纳米狭缝高度、第一一级纳米狭缝宽度和第一一级纳米狭缝长度；和
具有第一一级近端停泊腔室高度、第一一级近端停泊腔室宽度和第一一级近端停泊腔室长度的第一一级近端停泊腔室，所述第一一级纳米狭缝连接所述第一一级近端停泊腔室，所述第一一级近端停泊腔室由所述第一一级远端微通道开口连接所述一级微通道，所述第一一级纳米狭缝由所述第一二级近端微通道开口与所述二级微通道流体连通。
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