CN111269964B - 一种利用蛋白抗体进行rna免疫沉淀的试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用蛋白抗体进行RNA免疫沉淀的试剂盒，属于免疫沉淀技术领域。该试剂盒主要是利用目的蛋白质进行免疫沉淀，以分离与该蛋白结合的RNA。与现有的millipore公司的试剂盒相比，该试剂盒具有特异性高、效率高、耗时短、成本低、操作简便等优点，且不需要特别的仪器即可进行实验，所用试剂也皆为实验室常用试剂，大部分无毒无害；先使用福尔马林溶液使各种蛋白质结构固定，确保蛋白‑RNA复合物结构遭受破坏，降低RNA得率，同时使各种核酸酶失活，减少了其对RNA的降解。

Description

一种利用蛋白抗体进行RNA免疫沉淀的试剂盒
技术领域
本发明涉及一种利用蛋白抗体进行RNA免疫沉淀的试剂盒，属于免疫沉淀技术领域。
背景技术
在机体内有很多的RNA结合蛋白，这些蛋白结合RNA之后会对RNA进行切割或者剪切或者运送到特定的部位转录成蛋白质后发挥特定的功能，在病理条件下，特定蛋白质结合的RNA会发生质和量的变化，将RNA分离出来进行后续检测如实时定量PCR或者测序，可深入了解疾病的发病原理，有利于开发新的治疗药物。
目前国内尚未有开发RNA免疫沉淀试剂盒的公司，如果按照文献自己摸索需要花费大量的时间进行实验条件的优化，而国外公司如millipore公司的试剂盒价格昂贵且到货周期长，操作繁琐，millipore的试剂盒到货周期一般为3-4周，且需要2-3天甚至更久才能完成整个实验，且实验过程中需要用到大量的有机溶剂，对人体及环境有害，除此之外，millipore的试剂盒中提供有近20种试剂，对操作人员的技术及耐心是极大考验，且实验过程需要用到-80℃超低温冰箱，RNA由于容易降解，长时间的操作会降低其得率，实验过程中试剂太多容易出错，造成实验结果的不准确，所以开发一款经济实惠、操作简单、耗时较短又稳定的试剂盒迫在眉睫。
发明内容
本发明提供了一种利用蛋白进行RNA免疫沉淀的方法，该方法主要是利用目的蛋白质进行免疫沉淀，以分离与该蛋白结合的RNA。在机体内有很多的RNA结合蛋白，这些蛋白结合RNA之后会对RNA进行切割或者剪切或者运送到特定的部位转录成蛋白质后发挥特定的功能，在病理条件下，特定蛋白质结合的RNA会发生质和量的变化，将RNA分离出来进行后续检测如实时定量PCR或者测序，可深入了解疾病的发病原理，有利于开发新的治疗药物。
本发明的目的是提供一种利用蛋白抗体进行RNA免疫沉淀的试剂盒，包括：
(1)用于和蛋白抗体结合的protein A/G磁珠；
(2)含有RNA酶抑制剂的裂解细胞或者组织的裂解液；
(3)用于固定蛋白质结构的福尔马林溶液；
(4)用于吸附掉多余福尔马林溶液的甘氨酸溶液；
(5)用于抑制蛋白质或者RNA降解的抑制剂；
(6)用于进行蛋白RNA免疫沉淀的缓冲液RIP buffer。
本发明的一种实施方式中，所述的磁珠是同时含有蛋白A及蛋白G的IgG结合区的重组融合蛋白。
本发明的一种实施方式中，所述的裂解液包含45-55mM Hepes，0.3-0.5M NaCl，0.5-1.5mM EDTA-Na2，0.5-1.5mM DTT，0.25％-0.75％Triton-X100，5％-15％Glycerol，调节pH至7.5
本发明的一种实施方式中，所述的福尔马林溶液初始浓度是36-40％。
本发明的一种实施方式中，所述的甘氨酸溶液的浓度是1-3M。
本发明的一种实施方式中，所述的RIP buffer包含45-55mM Hepes，0.05-0.15MNaCl，4.5-5.5mM EDTA-Na2，5-15mM DTT，0.25％-0.75％Triton-X100，5％-15％Glycerol，0.5％-1.5％SDS，调节pH至7.5。
本发明的一种实施方式中，所述试剂盒还包括HBSS和/或PMSF。
本发明的一种实施方式中，所述试剂盒的实验使用过程中所用的水都是RNase-free的DEPC-treated处理后并灭菌的水。
本发明的目的还在于提供一种提取RNA的方法，是将待提取的组织或细胞使用上述试剂盒纯化出目的蛋白-RNA复合物，再从目的蛋白-RNA复合物中提取RNA。
在本发明的一种实施方式中，从目的蛋白-RNA复合物中提取RNA的方法包括trizol法。
本发明的有益效果：与现有的millipore公司的试剂盒相比，本发明提供的试剂盒具有以下优点：
(1)本发明提供的RNA免疫沉淀试剂盒特异性高，效率高，可得到更高浓度的RNA；
(2)本发明提供的RNA免疫沉淀试剂盒实验过程耗费时间短，第一天一般只要2-3个小时即可完成，第二天一般在1个小时左右即可得到所需的RNA；
(3)本发明提供的RNA免疫沉淀试剂盒成本低，总成本在3000元以内，而millipore公司的试剂盒成本在6000元以上；
(4)本发明提供的RNA免疫沉淀试剂盒成本所需试剂较少，操作简便，而millipore公司的试剂盒需要用到近20种试剂，操作复杂，更易造成RNA降解；
(5)本发明提供的RNA免疫沉淀试剂盒不需要特别的仪器即可进行实验，所用试剂也皆为实验室常用试剂，大部分无毒无害；先使用福尔马林溶液使各种酶类变性，减少了其对RNA的降解。
附图说明
图1为未加入FMRP抗体，利用本发明提供的试剂盒提取得到的RNA。
图2为利用本发明提供的试剂盒提取得到的RNA。
图3为利用millipore的试剂盒提取得到的RNA。
(注：附图1-3均为原始数据，主要用于观测峰值和片段长度集中位置，存在的字符重叠问题不影响对本专利内容的理解。)
具体实施方式
本发明提供的试剂盒的工作原理：Protein A/G可以结合常见的小鼠、大鼠、兔或者山羊等来源的抗体，利用和磁珠结合的Protein A/G可以通过磁力架将抗体从溶液中纯化出来；由于在机体内有很多的RNA结合蛋白，利用抗原抗体的特异性结合原理，可以运用带磁珠的Protein A/G-抗体复合物进一步纯化出与抗体特异性结合的目的蛋白-RNA复合物，最后利用trizol分离纯化所需的RNA并对其进行分析。
实施例1 试剂盒的使用方法
一：磁珠的准备
①:磁珠用前混匀；
②:取需求量的1.5mL RNase-free的离心管，按50μL/管加入磁珠；放磁力架上等待1-3min，用RNase-free的枪头吸弃液体，留磁珠；
③:从磁力架上取下离心管，按200μL/管加入含2U/μL RNA酶抑制剂的裂解液，轻轻涡旋振荡；
④:放磁力架上，等待1-3min，用RNase-free的枪头吸弃上清；
⑤:重复上述清洗一次；取下离心管；
⑥:按100μL/管加入含2U/μL RNA酶抑制剂的裂解液及5μg/管的目的抗体，此抗体应该是可以做免疫沉淀的抗体；
⑦:室温于360°摇床上轻轻摇30min；在此过程中进行下述步骤二的实验；
⑧:瞬时离心，放磁力架上，等待1-3min，用RNase-free的枪头吸弃上清。
二：组织或细胞样本的准备
⑴:快速取目的组织或者细胞，用冰浴的HBSS洗三遍；
⑵:若是组织，将每5mg组织尽可能地切成小块，若是细胞，需要量至少是汇合度80％以上3.5cm培养皿的细胞量，每个样本加200μL HBSS和2μL RNA酶抑制剂，轻轻摇匀；
⑶:在尽可能短的时间内，所有样本各加入6μL福尔马林溶液；
⑷:室温在摇床上摇10min；
⑸:在尽可能短的时间内，所有样本都加入28μL 2M甘氨酸溶液吸附多余的福尔马林；
⑹:室温在摇床上摇5min；
⑺:室温100g离心2min，用RNase-free的枪头吸弃上清；
⑻:每管中加入500μL裂解液、10μL PMSF、5μL蛋白酶抑制剂、2.5μL RNA酶抑制剂；
⑼:利用匀浆器或者超声匀浆细胞或者组织，匀浆器的速度不超过3000rpm；
⑽:室温14000g离心3min，取上清，弃沉淀；
⑾:采用BCA法对蛋白进行定量，等待过程中用裂解液清洗步骤一中的磁珠三遍；
⑿:取等量的样本作为input control，即以没有经过免疫沉淀下来的所有RNA原液作为对照，以便后续对提取出来的RNA进行定量分析，使其终体积为50μL。
三：RIP
⑴:取等量样本200μg加入到步骤一中的含有磁珠的管中，4℃轻轻摇晃4hr至过夜；
⑵:离心管瞬时离心后，放磁力架上等待1-3min，弃上清或者上清可留着他用；
⑶:取下离心管，磁珠用含2U/μL RNA酶抑制剂的裂解液清洗三遍；
⑷:每管中各加100μL RIP buffer、1μL RNA酶抑制剂，input中各加50μL RIPbuffer、1μL RNA酶抑制剂；
⑸:所有样品均放70℃水浴或金属浴，加热变性分离1hr；
⑹:离心管瞬时离心后，放磁力架上，取上清用trizol法等常规方法提取RNA(trizol法可参考Rio,Donald C.,et al."Purification of RNA using TRIzol(TRIreagent)."Cold Spring Harbor Protocols 2010.6(2010):pdb-prot5439)；提取的RNA可进行测序分析或者实时定量PCR等。
实施例2 试剂盒的检验测试
利用FMRP蛋白抗体(武汉三鹰生物技术有限公司，货号66548-1-Ig)按照上述步骤进行RNA免疫沉淀，同时利用millipore公司的RNA免疫沉淀试剂盒(EZ-Magna RIPTMRNA-Binding Protein Immunoprecipitation Kit，货号17-701)进行对比试验，得到的RNA利用安捷伦2100RNA检测仪进行质量检测，结果如图1-3所示。
图1为未加入FMRP抗体，利用本发明提供的试剂盒提取得到的RNA，可见基本没有RNA被检测到，说明本发明提供的试剂盒不会出现假阳性。
图2为利用本发明提供的试剂盒提取得到的RNA，得到的RNA浓度为86pg/μL，且RNA主要集中在1000-2000bp。
图3为利用millipore的试剂盒提取得到的RNA，得到的RNA浓度为69pg/μL，RNA也主要集中在1000-2000bp，但是浓度略低。
实验结果表明本发明提供的RNA免疫沉淀试剂盒特异性高，效率高，可得到更高浓度的RNA，成本较millipore的有较大降低，说明本试剂盒是一款经济实惠，操作简单，耗时较短又稳定的试剂盒。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (6)

1.一种利用蛋白抗体进行RNA免疫沉淀的试剂盒，其特征在于，包括：
(1)用于和蛋白抗体结合的protein A/G磁珠；
(2)含有RNA酶抑制剂的裂解细胞或者组织的裂解液；
(3)用于固定蛋白质结构的福尔马林溶液；
(4)用于吸附掉多余福尔马林溶液的甘氨酸溶液；
(5)用于抑制蛋白质或者RNA降解的抑制剂；
(6)用于进行蛋白RNA免疫沉淀的缓冲液RIP buffer；
所述的磁珠是同时含有蛋白A及蛋白G的IgG结合区的重组融合蛋白；
所述的裂解液包含45-55mM Hepes，0.3-0.5M NaCl，0.5-1.5mM EDTA-Na2，0.5-1.5mMDTT，0.25％-0.75％Triton-X100，5％-15％Glycerol，调节pH至7.0-7.5；
所述的RIP buffer包含45-55mM Hepes，0.05-0.15M NaCl，4.5-5.5mM EDTA-Na2，5-15mM DTT，0.25％-0.75％Triton-X100，5％-15％Glycerol，0.5％-1.5％SDS，调节pH至7.0-7.5；所述的福尔马林溶液初始浓度是36-40％。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的甘氨酸溶液的浓度是1-3M。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括HBSS和/或PMSF。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的使用过程中所用的水都是RNase-free的DEPC处理后并灭菌的水。
5.一种提取RNA的方法，其特征在于，将待提取的组织或细胞使用权利要求1-4任一所述的试剂盒纯化出目的蛋白-RNA复合物，再从目的蛋白-RNA复合物中提取RNA。
6.如权利要求5所述的方法，从目的蛋白-RNA复合物中提取RNA的方法包括trizol法。
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