CN111264517A - 一种c型肉毒梭菌毒素饵剂及其制备方法 - Google Patents

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CN111264517A CN202010126682.6A CN202010126682A CN111264517A CN 111264517 A CN111264517 A CN 111264517A CN 202010126682 A CN202010126682 A CN 202010126682A CN 111264517 A CN111264517 A CN 111264517A
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Abstract

本发明公开了一种C型肉毒梭菌毒素饵剂及其制备方法，所述每50千克C型肉毒梭菌毒素饵剂中包括C型肉毒梭菌毒素水剂1500～1650ml、胡萝卜5～7.5千克、碎小麦25～37.5千克、玉米粉10～12.5千克、保护剂60～75克、VC5～7.5克、蕃红2～2.5克、水3000～4000ml、清油1～5克。其制备方法包括以下步骤：S1、制备C型肉毒梭菌毒素水剂备用；S2、分别称取胡萝卜、碎小麦、玉米粉、保护剂、VC、蕃红、水、清油备用；S3、将C型肉毒梭菌毒素水剂与胡萝卜、碎小麦、玉米粉、保护剂、VC、蕃红、水、清油按比例混合并放置在饵料搅拌机；S4、饵料搅拌机搅拌均匀后，将混合物料压制成颗粒，分装后即得C型肉毒梭菌毒素饵剂。

Description

一种C型肉毒梭菌毒素饵剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及害虫防治领域，尤其涉及一种C型肉毒梭菌毒素饵剂及其制备方法。
背景技术
鼠害是严重威胁草原畜牧业生产发展的重要因素之一，高原鼠兔、高原鼢鼠终年营地下生活，挖掘洞道，觅食植物根、茎等部位，其不仅与家畜争夺优良牧草，降低草原载畜量，而且打洞造穴，挖掘草根、推出鼠丘，导致地表土裸露，植被盖度降低，引起草原退化、生产力降低等生态学问题。青海省河南蒙古族自治县是全国面积最大的有机畜牧业生产基地，现阶段对高原鼠兔、高原鼢鼠的防治主要依靠人工弓箭捕杀。但依靠弓箭捕捉存在费工、安全性低、成本高、投资大等缺点。因此，在草地应用肉毒素进行防治已成为当前的一种趋势，但是现在市面上没有防治高原鼠害的特效毒素，有必要提供一种针对高原鼠害的毒素来辅助高原鼠害的防治工作。
发明内容
本发明目的是针对上述问题，提供一种提高高原鼠害防治效果的C型肉毒梭菌毒素饵剂及其制备方法。
为了实现上述目的，本发明的技术方案是：
一种C型肉毒梭菌毒素饵剂，所述C型肉毒梭菌毒素饵剂的制备原料包括C型肉毒梭菌毒素水剂、胡萝卜、碎小麦、玉米粉、保护剂、VC、蕃红、水、清油；所述每50千克C型肉毒梭菌毒素饵剂中包括C型肉毒梭菌毒素水剂1500～1650ml、胡萝卜5～7.5千克、碎小麦25～37.5千克、玉米粉10～12.5千克、保护剂60～75克、VC5～7.5克、蕃红2～2.5克、水3000～4000ml、清油1～5克。
进一步的，所述每50千克C型肉毒梭菌毒素饵剂中包括C型肉毒梭菌毒素水剂1650ml、胡萝卜7.5千克、碎小麦37.5千克、玉米粉12.5千克、保护剂75克、VC7.5克、蕃红2.5克、水4000ml、清油5克。
一种C型肉毒梭菌毒素饵剂的制备方法，包括以下步骤：
S1、制备C型肉毒梭菌毒素水剂，备用；
S2、分别称取胡萝卜、碎小麦、玉米粉、保护剂、VC、蕃红、水、清油备用；
S3、将C型肉毒梭菌毒素水剂与胡萝卜、碎小麦、玉米粉、保护剂、VC、蕃红、水、清油按比例混合并放置在饵料搅拌机；
S4、饵料搅拌机搅拌均匀后，将混合物料压制成颗粒，分装后即得C型肉毒梭菌毒素饵剂。
进一步的，所述步骤S1中制备C型肉毒梭菌毒素水剂包括以下步骤：
S11、将C型肉毒梭菌C62-4菌株和C型肉毒梭菌C62-6菌株接种于厌气肝汤或肉肝胃酶消化汤半固体培养基中，在37℃温度条件下培养3日后作为一级种子；
S12、将一级种子1～2株接种于肉肝胃酶消化汤半固体培养基中，置于37℃温度条件下培养3～5日作为二级种子；
S13、将肉肝胃酶消化汤半固体培养基和生理盐水溶液一同灌入透析器的的细菌培养室；
S14、将透析器置于118℃的温度条件下灭菌40分钟，待冷却至室温后，接入二级种子；
S15、将透析器置于34～36℃的温度条件下静置培养6～8日，然后从细菌培养室放出菌液；
S16、调整菌液的PH值为4.5～6.0并用除菌滤器在4～8℃的温度条件下过滤除菌，即得无菌毒素，将无菌毒素分装后即得C型肉毒梭菌毒素水剂。
进一步的，所述步骤S13中，透析器的的细菌培养室中肉肝胃酶消化汤半固体培养基与生理盐水溶液的体积比为10﹕1。
进一步的，所述步骤S14中接入二级种子的体积为生理盐水溶液体积的1％。
与现有技术相比，本发明具有的优点和积极效果是：
通过使用C型肉毒梭菌毒素饵剂对高原鼠兔、高原鼢鼠进行防治，可以大量减少高原鼠兔、高原鼢鼠的数量，使得人们可以长时期的控制害鼠数量，从而使得被破坏的天然草原得以恢复，牧草高度、植被盖度得以增加，提高草原水分涵养能力，提高草原生产力，给生态环境的保护工作带来了便利；并且通过对高原鼠兔的防治，在保护了生态环境的同时降低了畜牧业经济的损失程度，从而提高了畜牧业的经济效益。
具体实施方式
下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
实施例1、一种C型肉毒梭菌毒素饵剂，所述C型肉毒梭菌毒素饵剂的制备原料包括C型肉毒梭菌毒素水剂、胡萝卜、碎小麦、玉米粉、羧甲基纤维素纳、VC、蕃红、水、清油；所述每50千克C型肉毒梭菌毒素饵剂中包括C型肉毒梭菌毒素水剂1500ml、胡萝卜5千克、碎小麦30千克、玉米粉10千克、羧甲基纤维素纳60克、VC5克、蕃红2克、水3000ml、清油1克。保护剂选用羧甲基纤维素纳(CMC)，其可以粘合及隔离毒素，减少失毒；
上述C型肉毒梭菌毒素饵剂的制备方法包括以下步骤：
S1、制备C型肉毒梭菌毒素水剂备用；
S11、将C型肉毒梭菌C62-4菌株和C型肉毒梭菌C62-6菌株接种于厌气肝汤或肉肝胃酶消化汤半固体培养基中，在37℃温度条件下培养3日后作为一级种子；
S12、将一级种子1株接种于肉肝胃酶消化汤半固体培养基中，置于37℃温度条件下培养3日作为二级种子；
S13、将肉肝胃酶消化汤半固体培养基和生理盐水溶液一同灌入透析器的的细菌培养室，肉肝胃酶消化汤半固体培养基与生理盐水溶液的体积比为10﹕1；
S14、将透析器置于118℃的温度条件下灭菌40分钟，待冷却至室温后，接入二级种子；二级种子的体积为生理盐水溶液体积的1％；
S15、将透析器置于34℃的温度条件下静置培养6日，然后从细菌培养室放出菌液；
S16、调整菌液的PH值为4.5并用除菌滤器在4℃的温度条件下过滤除菌，即得无菌毒素，将无菌毒素分装后即得C型肉毒梭菌毒素水剂；
S2、分别称取胡萝卜、碎小麦、玉米粉、保护剂、VC、蕃红、水、清油备用；
S3、将C型肉毒梭菌毒素水剂与胡萝卜、碎小麦、玉米粉、保护剂、VC、蕃红、水、清油按比例混合并放置在饵料搅拌机；
S4、饵料搅拌机搅拌均匀后，将混合物料压制成颗粒，分装后即得C型肉毒梭菌毒素饵剂。
实施例2、一种C型肉毒梭菌毒素饵剂，所述C型肉毒梭菌毒素饵剂的制备原料包括C型肉毒梭菌毒素水剂、胡萝卜、碎小麦、玉米粉、羧甲基纤维素纳、VC、蕃红、水、清油；所述每50千克C型肉毒梭菌毒素饵剂中包括C型肉毒梭菌毒素水剂1600ml、胡萝卜6千克、碎小麦29千克、玉米粉10千克、羧甲基纤维素纳65克、VC6克、蕃红2克、水3100ml、清油2克。保护剂选用羧甲基纤维素纳(CMC)，其可以粘合及隔离毒素，减少失毒；
上述C型肉毒梭菌毒素饵剂的制备方法包括以下步骤：
S1、制备C型肉毒梭菌毒素水剂备用；
S11、将C型肉毒梭菌C62-4菌株和C型肉毒梭菌C62-6菌株接种于厌气肝汤或肉肝胃酶消化汤半固体培养基中，在37℃温度条件下培养3日后作为一级种子；
S12、将一级种子1株接种于肉肝胃酶消化汤半固体培养基中，置于37℃温度条件下培养4日作为二级种子；
S13、将肉肝胃酶消化汤半固体培养基和生理盐水溶液一同灌入透析器的细菌培养室，肉肝胃酶消化汤半固体培养基与生理盐水溶液的体积比为10﹕1；
S14、将透析器置于118℃的温度条件下灭菌40分钟，待冷却至室温后，接入二级种子；二级种子的体积为生理盐水溶液体积的1％；
S15、将透析器置于35℃的温度条件下静置培养7日，然后从细菌培养室放出菌液；
S16、调整菌液的PH值为5.0并用除菌滤器在7℃的温度条件下过滤除菌，即得无菌毒素，将无菌毒素分装后即得C型肉毒梭菌毒素水剂；
S2、分别称取胡萝卜、碎小麦、玉米粉、保护剂、VC、蕃红、水、清油备用；
S3、将C型肉毒梭菌毒素水剂与胡萝卜、碎小麦、玉米粉、保护剂、VC、蕃红、水、清油按比例混合并放置在饵料搅拌机；
S4、饵料搅拌机搅拌均匀后，将混合物料压制成颗粒，分装后即得C型肉毒梭菌毒素饵剂。
实施例3、一种C型肉毒梭菌毒素饵剂，所述C型肉毒梭菌毒素饵剂的制备原料包括C型肉毒梭菌毒素水剂、胡萝卜、碎小麦、玉米粉、羧甲基纤维素纳、VC、蕃红、水、清油；所述每50千克C型肉毒梭菌毒素饵剂中包括C型肉毒梭菌毒素水剂1650ml、胡萝卜7.5千克、碎小麦25千克、玉米粉12.5千克、羧甲基纤维素纳75克、VC7.5克、蕃红2.5克、水4000ml、清油5克。保护剂选用羧甲基纤维素纳(CMC)，其可以粘合及隔离毒素，减少失毒；
上述C型肉毒梭菌毒素饵剂的制备方法包括以下步骤：
S1、制备C型肉毒梭菌毒素水剂备用；
S11、将C型肉毒梭菌C62-4菌株和C型肉毒梭菌C62-6菌株接种于厌气肝汤或肉肝胃酶消化汤半固体培养基中，在37℃温度条件下培养3日后作为一级种子；
S12、将一级种子2株接种于肉肝胃酶消化汤半固体培养基中，置于37℃温度条件下培养5日作为二级种子；
S13、将肉肝胃酶消化汤半固体培养基和生理盐水溶液一同灌入透析器的的细菌培养室，肉肝胃酶消化汤半固体培养基与生理盐水溶液的体积比为10﹕1；
S14、将透析器置于118℃的温度条件下灭菌40分钟，待冷却至室温后，接入二级种子；二级种子的体积为生理盐水溶液体积的1％；
S15、将透析器置于36℃的温度条件下静置培养8日，然后从细菌培养室放出菌液；
S16、调整菌液的PH值为6.0并用除菌滤器在8℃的温度条件下过滤除菌，即得无菌毒素，将无菌毒素分装后即得C型肉毒梭菌毒素水剂；
S2、分别称取胡萝卜、碎小麦、玉米粉、保护剂、VC、蕃红、水、清油备用；
S3、将C型肉毒梭菌毒素水剂与胡萝卜、碎小麦、玉米粉、保护剂、VC、蕃红、水、清油按比例混合并放置在饵料搅拌机；
S4、饵料搅拌机搅拌均匀后，将混合物料压制成颗粒，分装后即得C型肉毒梭菌毒素饵剂。
为了验证C型肉毒梭菌毒素饵剂的效果，作出以下实验：
实验一、
防治所用药品
防治所需药物全部由青海生物药品厂有限公司提供，厂家另行添加葱、韭菜加工拌制引3000毒价/C型肉毒梭菌毒素饵料剂195kg。20000kg饵料剂在防治前由防治人员自行添加葱粉精拌制后投放(如表1所示)。下述实验中，将添加有引诱剂葱、韭菜的C型肉毒毒素饵料剂作为C型毒素饵料Ⅰ(全引诱剂型)，将添加有引诱剂葱粉精的C型肉毒毒素饵料剂作为C型毒素饵料Ⅱ(单引诱剂型)，
表1不同引诱剂拌制配置方法
Figure BDA0002394603290000071
投药量
考虑到地下投放会出现损耗情况，将投药量定为3000毒价/C型肉毒梭菌毒素饵料剂112.5kg/hm2。
防治方法
采用插洞投饵法，将原厂拌制引诱剂的药物(C型毒素饵料Ⅰ)及自行拌制的药物(C型毒素饵料Ⅱ)分别在1.73hm2及10000hm2草地中进行投放。
防治效果
应用3000毒价/C型肉毒梭菌毒素饵料剂进行防治具有很好的防治效果。根据表2可知，防治前防治区内的土丘数为296个/hm2，应用3000毒价/C型肉毒梭菌毒素饵料剂防治后三个月后鼢鼠土丘数降为55个/hm2及41个/hm2，防效达到81％及86％。
表2两种处理下的灭治效果
Figure BDA0002394603290000081
结果分析
结合上述两项所述：C型肉毒素饵料剂在大面积防治高原鼢鼠上更为安全、且不因温度原因影响其药效，更加方便；
在使用两种因引诱剂拌制方法后结果表明：引诱剂具有特殊气味，可以吸引高原鼢鼠采食，两种引诱剂所起作用在效果上略微有些差异，加大引诱剂的用量更能吸引高原鼢鼠的采食。
通过表3可以看出高原鼢鼠危害不仅对生态破坏严重，也对经济发展有很严重的影响，在防治高原鼢鼠后，不仅保护了生态，对经济损失的挽回也很可观，经济效益十分显著。
表3高原鼢鼠危害造成牧草损失及经济损失统计表
Figure BDA0002394603290000091
实验二、
害鼠种类：高原鼠兔(ochotonacurzoniae)。
试验材料：C型毒素饵料Ⅰ(全引诱剂型)，由青海省生物药品厂有限公司生产；C型毒素饵料Ⅱ(单引诱剂型)，由青海省生物药品厂有限公司生产。
试验方法
C型毒素饵料使用剂量试验研究
在海西州德令哈市蓄集乡选择高原鼠兔危害中、重度，面积约为12hm2的草地作为试验区，利用C型毒素饵料Ⅰ，施饵量为3g/洞、2g/洞、1g/洞进行小区试验，同时设CK处理，共计四个处理，每一处理重复3次，小区面积1hm2，随机区组排列。对角线取样，取样数量3个，样方面积1/15hm2。采用堵洞开洞法调查有效洞口数，施饵前先将样方内所有洞口堵住，经24h检查防前有效洞口数，施饵后第七天采用施饵前相同的方法进行残留有效洞口数的检查，计算出洞口减退率和校正洞口减退率，并运用数理统计的方法分析比较不同防治剂量对高原鼠兔防治效果。
计算公式：
Figure BDA0002394603290000092
Figure BDA0002394603290000093
C型毒素饵料不同引诱剂试验研究
在海西州德令哈市蓄集乡选择高原鼠兔危害中、重度，面积约为9hm2的草地作为试验区进行小区试验，小区设置分别为：A：C型毒素饵料Ⅰ，施饵量3g/洞；B：C型毒素饵料Ⅱ，施饵量3g/洞；同时设CK处理，共计三个处理，每一处理重复3次，小区面积1hm2，随机区组排列。防治前、后采用与试验3.1相同的调查方法，调查有效洞口数计算出有效洞口减退率和校正洞口减退率，并用生物统计的方法予以分析比较不同引诱剂的防治效果。
C型毒素饵料氧化失毒试验研究
选择中、重密度高原鼠兔危害草地9hm2，将C型毒素饵料Ⅰ置于20℃～31℃常温库房中，在自然状态下保存40d后进行防治高原鼠兔药效小区试验，小区设置为：F：40dC型毒素饵料Ⅰ；G：C型毒素饵料Ⅰ，投饵量均为3g/洞。同时设CK处理，共三个处理，每一处理小区面积为1hm2，重复3次，随机区组排列。采用与试验3.1相同的调查方法进行取样调查，分析比较C型肉毒毒素饵料Ⅰ经常温40d氧化时间对高原鼠兔的防治效果。
结果与分析
C型毒素饵料使用剂量试验研究
试验区主要害鼠种类为高原鼠兔，防前经54个样方的调查，平均有效洞口数为44.42个/亩，最高达144个/亩。通过对C型毒素饵料Ⅰ不同使用剂量防治小区药效试验，其结果见表4。
表4 C型毒素饵料使用剂量药效试验结果(1/15hm2)
Figure BDA0002394603290000101
Figure BDA0002394603290000111
从表4可以看出，施饵量为3g/洞，平均校正防治效果为88.35％、2g/洞平均校正防治效果为90.12％、1g/洞平均校正防治效果为89.19％，将表4数据进行方差分析其结果见表5。
表5方差分析
差异源 SS df MS F P-value Fcrit
组间 4.7181562 2 2.359078 0.025776 0.974661 5.143253
组内 549.14416 6 91.52403
总计 553.86232 8
从表5可以看出F＝0.025<F0.05＝5.143，既P>0.05，差异不显著。表明施饵量3g/洞、2g/洞、1g/洞在0.05水平上校正防治效果间无显著差异，对高原鼠兔具有相同的防治效果。
C型毒素饵料不同引诱剂试验研究
通过对添加不同引诱剂的C型毒素饵料Ⅰ和C型毒素饵料Ⅱ，以相同施饵量3g/洞进行防治高原鼠兔药效对比试验，其结果见表6。
表6 C型毒素饵料不同引诱剂药效试验结果(1/15hm2)
Figure BDA0002394603290000121
从表6可以看出，采用C型毒素饵料Ⅰ(A)进行防治，平均校正防治效果为90.09％，C型毒素饵料Ⅱ(B)进行防治，平均校正防治效果为90.22％。比较两种不同引诱剂的C型毒素饵料防治效果，C型毒素饵料Ⅱ较C型毒素饵料Ⅰ增加0.13％。将表6数据进一步做t检验，结果见表7。
表7 t-检验:双样本等方差假设
Figure BDA0002394603290000132
从表7可以看出│T│＝0.027<t0.05＝2.119，即差异性不显著，说明C型毒素饵料Ⅰ和C型毒素饵料Ⅱ进行高原鼠兔防治，在0.05水平上校正防治效果间无显著差异，两种不同引诱剂对高原鼠兔具有相同的诱鼠效果。
C型毒素饵料氧化失毒试验研究
经在海西州德令哈市蓄集乡春秋草场对常温库房中保存期40d的C型毒素饵料Ⅰ进行防治高原鼠兔的药效小区试验，其结果见表8。
表8 C型毒素饵料氧化失毒药效试验结果(1/15hm2)
Figure BDA0002394603290000131
Figure BDA0002394603290000141
从表8可以得出，常温保存40d的C型毒素饵料Ⅰ毒饵对高原鼠兔的平均防治效果为73.02％，平均校正防治效果为81.49％；正常低温保存的C型毒素饵料Ⅰ毒饵对高原鼠兔的平均防治效果为85.55％，平均校正防治效果为90.09％，将表8数据进行t检验，其结果见表9。
表9 t-检验:双样本等方差假设
变量1 变量2
平均 90.086667 81.48635
方差 123.39055 22.68574
观测值 9 9
合并方差 73.038146
假设平均差 0
df 16
tStat 2.1347436
P(T<＝t)单尾 0.0242985
t单尾临界 1.7458837
P(T<＝t)双尾 0.0485969
t双尾临界 2.1199053
从表9可以看出│T│＝2.134＞t0.05＝2.119，即差异性显著，说明C型毒素饵料Ⅰ在常温库房保存40d与正常低温保存条件下，在0.05水平上校正防治效果间存在显著差异，即两种不同保存条件下对高原鼠兔具有不同的防治效果，正常低温保存的C型毒素饵料Ⅰ防治效果要高于常温库房保存40d的防治效果。
结论与讨论
田间试验证明，C型毒素饵料施饵量为3g/洞、2g/洞、1g/洞时，平均校正防治效果为88.35％、90.12％和89.19％。三种剂量间经方差分析，差异不显著(F＝0.025<F0.05＝5.143，既P>0.05)，对高原鼠兔具有相同的防治效果。试验组认为以1g/洞的施饵量为宜，可在大面积防治中推广使用。
添加不同引诱剂的C型毒素饵料Ⅰ和C型毒素饵料Ⅱ，在相同施饵量(3g/洞)的条件下，平均校正防治效果为90.09％和90.22％，经t检验，差异不显著(│T│＝0.027<t0.05＝2.119)，两种不同引诱剂对高原鼠兔具有相同的诱鼠效果。
实验三、
害鼠种类：高原鼠兔(ochotonacurzoniae)。
试验材料：C型毒素饵料Ⅰ(全引诱剂型)，由青海省生物药品厂有限公司生产；C型毒素饵料Ⅱ(单引诱剂型)，由青海省生物药品厂有限公司生产。
试验方法
C型毒素饵料使用剂量试验研究
在果洛州玛沁县选择高原鼠兔危害中、重度，面积为12hm2的草地作为试验区。使用C型毒素饵料Ⅰ，采用洞口投饵法，施饵量为3g/洞、5g/洞、7g/洞进行小区试验，同时设CK处理，共计四个处理，每一处理重复3次，小区面积1hm2，随机区组排列。对角线取样，取样数量3个，样方面积1/15hm2。用堵洞开洞法调查有效洞口数，施饵前先将样方内所有洞口堵住，经24h检查防前有效洞口数，施饵后第七天采用施饵前相同的方法进行残留有效洞口数的检查，计算出洞口减退率和校正洞口减退率，并运用数理统计的方法分析比较不同防治剂量对高原鼠兔防治效果。
计算公式：
Figure BDA0002394603290000161
Figure BDA0002394603290000162
C型毒素饵料不同引诱剂试验研究
在果洛州玛沁县选择高原鼠兔危害中、重度，面积为9hm2的草地作为试验区进行小区试验，小区设置分别为：A：C型毒素饵料Ⅰ，施饵量3g/洞；B：C型毒素饵料Ⅱ，施饵量3g/洞；同时设CK处理，共计三个处理，每一处理重复3次，小区面积1hm2，随机区组排列。防治前、后采用与试验3.1相同的调查方法，调查有效洞口数计算出有效洞口减退率及校正洞口减退率，并用生物统计的方法予以分析比较不同引诱剂的防治效果。
结果与分析
C型毒素饵料使用剂量试验研究
试验区主要害鼠种类为高原鼠兔，防前经45个样方的调查，平均有效洞口数为69.47个/亩，最高达124个/亩。通过对C型毒素饵料Ⅰ不同使用剂量防治小区药效试验，其结果见表10。
表10 C型毒素饵料使用剂量药效试验结果(1/15hm2)
Figure BDA0002394603290000163
Figure BDA0002394603290000171
从表10可以看出，施饵量7g/洞平均校正防治效果为93.76％、5g/洞平均校正防治效果为89.31％、3g/洞平均校正防治效果为90.00％，将表10数据进行方差分析其结果见表11。
表11方差分析
差异源 SS df MS F P-value Fcrit
组间 34.428334 2 17.21417 1.14939 0.37793 5.143253
组内 89.860703 6 14.97678
总计 124.28904 8
从表11可以看出F＝1.149<F0.05＝5.143，既P>0.05，差异不显著。表明施饵量7g/洞、5g/洞、3g/洞在0.05水平上校正防治效果间无显著差异，对高原鼠兔具有相同的防治效果。
C型毒素饵料不同引诱剂试验研究
通过对添加不同引诱剂的C型毒素饵料Ⅰ和C型毒素饵料Ⅱ，以相同施饵量3g/洞进行防治高原鼠兔药效对比试验，其结果见表12。
表12 C型毒素饵料不同引诱剂药效试验结果(1/15hm2)
Figure BDA0002394603290000181
Figure BDA0002394603290000191
从表12可以看出，采用C型毒素饵料Ⅰ(A)进行防治，平均校正防治效果为90.79％，C型毒素饵料Ⅱ(B)进行防治，平均校正防治效果为88.01％，两种添加不同引诱剂的C型毒素饵料防治比较，C型毒素饵料Ⅱ较C型毒素饵料Ⅰ平均校正效果减少2.78％。将表12数据进一步做t检验，结果见表13。
表13 t-检验:双样本等方差假设
Figure BDA0002394603290000192
Figure BDA0002394603290000201
从表13可以看出│T│＝1.024<t0.05＝2.119，即差异性不显著，说明C型毒素饵料Ⅰ和C型毒素饵料Ⅱ进行高原鼠兔防治，在0.05水平上校正防治效果间无显著差异，对高原鼠兔具有相同的防治效果，表明添加两种不同的诱鼠剂，引诱效果是相同的。
结论与讨论
田间试验证明，C型毒素饵料施饵量为7g/洞、5g/洞、3g/洞时，平均校正防治效果为93.76％、89.31％和90.00％。三种剂量间经方差分析，差异不显著(F＝1.149<F0.05＝5.143，既P>0.05)，对高原鼠兔具有相同的防治效果，试验组认为以3g/洞的施饵量为宜，可在大面积防治中推广使用。从防治成本考虑，建议进一步做更小投饵量的剂量筛选试验，在保证防治质量的基础上，以寻更加经济、有效的最佳使用剂量。
添加不同引诱剂的C型毒素饵料Ⅰ和C型毒素饵料Ⅱ，在相同施饵量(3g/洞)的条件下，平均校正防治效果为90.79％和88.01％，经t检验，差异不显著(│T│＝1.024<t0.05＝2.119)，两种引诱剂对高原鼠兔具有相同的诱鼠效果。
53000毒价/C型毒素饵料，使用时无需现场加工配制，简化了大面积防治时的工作程序，保证了毒饵质量，避免和减少了因配制过程造成的粮食浪费和可能存在的安全隐患。因采用新型诱鼠技术，具有较好的适口性，在青南牧区的夏季使用，防治效果达到《青海省鼠虫灾害防治实施办法》验收标准，具备任何季节使用的优点，突破了生物毒素制剂仅在寒冷的冬春季使用局限，对改善工作环境，实现安全、有效控制鼠害，修复草原生态，开辟了新途径。

Claims (6)

1.一种C型肉毒梭菌毒素饵剂，其特征在于：所述C型肉毒梭菌毒素饵剂的制备原料包括C型肉毒梭菌毒素水剂、胡萝卜、碎小麦、玉米粉、保护剂、VC、蕃红、水、清油；所述每50千克C型肉毒梭菌毒素饵剂中包括C型肉毒梭菌毒素水剂1500～1650ml、胡萝卜5～7.5千克、碎小麦25～37.5千克、玉米粉10～12.5千克、保护剂60～75克、VC5～7.5克、蕃红2～2.5克、水3000～4000ml、清油1～5克。
2.如权利要求1所述的C型肉毒梭菌毒素饵剂，其特征在于：所述每50千克C型肉毒梭菌毒素饵剂中包括C型肉毒梭菌毒素水剂1650ml、胡萝卜7.5千克、碎小麦37.5千克、玉米粉12.5千克、保护剂75克、VC7.5克、蕃红2.5克、水4000ml、清油5克。
3.一种如权利要求1所述的C型肉毒梭菌毒素饵剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1、制备C型肉毒梭菌毒素水剂，备用；
S2、分别称取胡萝卜、碎小麦、玉米粉、保护剂、VC、蕃红、水、清油备用；
S3、将C型肉毒梭菌毒素水剂与胡萝卜、碎小麦、玉米粉、保护剂、VC、蕃红、水、清油按比例混合并放置在饵料搅拌机；
S4、饵料搅拌机搅拌均匀后，将混合物料压制成颗粒，分装后即得C型肉毒梭菌毒素饵剂。
4.如权利要求3所述的C型肉毒梭菌毒素饵剂的制备方法，其特征在于：所述步骤S1中制备C型肉毒梭菌毒素水剂包括以下步骤：
S11、将C型肉毒梭菌C62-4菌株和C型肉毒梭菌C62-6菌株接种于厌气肝汤或肉肝胃酶消化汤半固体培养基中，在37℃温度条件下培养3日后作为一级种子；
S12、将一级种子1～2株接种于肉肝胃酶消化汤半固体培养基中，置于37℃温度条件下培养3～5日作为二级种子；
S13、将肉肝胃酶消化汤半固体培养基和生理盐水溶液一同灌入透析器的的细菌培养室；
S14、将透析器置于118℃的温度条件下灭菌40分钟，待冷却至室温后，接入二级种子；
S15、将透析器置于34～36℃的温度条件下静置培养6～8日，然后从细菌培养室放出菌液；
S16、调整菌液的PH值为4.5～6.0并用除菌滤器在4～8℃的温度条件下过滤除菌，即得无菌毒素，将无菌毒素分装后即得C型肉毒梭菌毒素水剂。
5.如权利要求4所述的C型肉毒梭菌毒素饵剂的制备方法，其特征在于：所述步骤S13中，透析器的的细菌培养室中肉肝胃酶消化汤半固体培养基与生理盐水溶液的体积比为10﹕1。
6.如权利要求5所述的C型肉毒梭菌毒素饵剂的制备方法，其特征在于：所述步骤S14中接入二级种子的体积为生理盐水溶液体积的1％。
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