CN111264431A - 一种拟穴青蟹与锯缘青蟹人工定向杂交方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种拟穴青蟹与锯缘青蟹人工定向杂交方法，主要包括：(1)分别将挑选出来的拟穴青蟹与锯缘青蟹的父本及母本消毒后放置室内循环水立体养殖设备中进行培育；(2)当发现母本即将或正在生殖蜕壳时移入杂交箱内，并放入异种父本，抱对交配；(3)将母本移入室内循环水立体养殖设备继续培育，直至卵巢发育饱满；将父本移入室内循环水立体养殖设备继续培育；(4)母本强化培育及促排卵；(5)人工育苗方法培育出子一代苗种。本发明具有可操作性强、成功率高、易掌握等优点，既适合开展种间杂交的基础理论研究，又适合进行产业推广和应用，从而促进海洋经济蟹类种间杂交理论研究和杂交育种研究，为青蟹产业发展提供了新的增长点。
Description
技术领域
本发明属于水产养殖技术领域，特别涉及一种拟穴青蟹与锯缘青蟹人工定向杂交方法。
背景技术
种间杂交(Interspecific hybridization)可以显著的扩大动植物的基因库，促进种间交流，引入异种有利基因，创造出前所未有的变异类型，甚至会合成新的物种，是动植物基本的育种手段，在作物及其陆生动物育种上比较常见，而且取得了非常好的经济效益，推动了相关产业的发展。
对水产动物而言，种间杂交主要集中在鱼类及贝类育种上，比如剑尾鱼(施振宁和杨国梁，2010)、罗非鱼(贾敬德，1983)、牡蛎(Gaffney&Allen,1993；Xu et al.,2009；Zhanget al.,2012)、扇贝(杨爱国等，2003；Wang et al.,2011；Zhang et al.,2011)、鲍(柯才焕等，2000；Luo et al.,2010)等，且均发现杂交种具有很好的生长优势。而有关青蟹的种间杂交还未见报道。
拟穴青蟹(Scylla paramamosain)，属于节肢动物门、甲壳动物纲、十足目、梭子蟹科、青蟹属，在我国主要分布于长江口及以南沿海海域，是我国重要的海洋渔业资源和海水养殖品种。拟穴青蟹具有营养丰富和肉质鲜美等特点，深受人们喜爱。近年来，我国拟穴青蟹人工养殖规模和产量不断增加，保持良好的发展势头，具有很大的发展空间和养殖潜力。
锯缘青蟹(Scylla serrata)与拟穴青蟹同属青蟹属，其体型大，生长快，成蟹甲宽可达28公分，体重达3公斤。针对我国拟穴青蟹产业发展现状，如果能将种间杂交技术运用到拟穴青蟹和锯缘青蟹，则可引入锯缘青蟹的优势基因，创造出具有口感好、生长快等杂交优势的新品种。该技术将为青蟹产业发展和遗传改良奠定基础，并推动海水蟹类养殖产业的发展。由于种间杂交需突破物种间的生殖隔离，故难度较大，同时对技术的要求也较高。而海洋蟹类的交配不像鱼类一样可以人工获取雌雄鱼的卵子和精液，从而进行人工体外受精。海洋蟹类只能进行个体自主交配，因此，这对开展人工配种提出了非常高的要求。目前，还未见有关海洋经济蟹类种间杂交技术的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种拟穴青蟹与锯缘青蟹人工定向杂交方法，已解决青蟹种间杂交的技术问题。
一种拟穴青蟹与锯缘青蟹人工定向杂交方法，主要包括：
(1)分别将挑选出来的拟穴青蟹与锯缘青蟹的父本及母本消毒后放置室内循环水立体养殖设备(“蟹公寓”)中进行培育；
(2)当发现母本即将或正在生殖蜕壳时，将即将或正在生殖蜕壳的母本移入杂交箱内，并放入一只健康的异种拟穴青蟹或锯缘青蟹父本，二者可抱对交配；
(3)将完成交配的母本移入室内循环水立体养殖设备继续培育，直至卵巢发育饱满(对光观测，可见卵巢充满至头胸甲侧齿边缘)；将完成交配的父本同样移入室内循环水立体养殖设备继续培育，以用于再次交配，培育方法同步骤(2)；
(4)母本强化培育及促排卵；
(5)人工育苗方法培育出子一代苗种(杂交子一代)。
生殖蜕壳是雌蟹必经的生物学现象，只有在完成生殖蜕壳后的短暂时间段内，雌、雄蟹才能进行交配。完成交配后，雌蟹最显著的变化是腹部由白色、狭长、近三角形转变为深色、宽状、近半圆形，并伴随着大量绒毛伸出。
定期巡查母本生长状态，当发现母本即将或正在生殖蜕壳时，小心将其移入杂交箱内(50L左右)，并放入一只健康的异种父本(若母本为锯缘青蟹，则父本为拟穴青蟹；反之，亦然)，二者可抱对交配。
进一步的，杂交箱内水体为20～30L，连续充气，不投饵，盐度10～16ppt，pH值7.8～8.5，氨氮低于0.5毫克/升，亚硝态氮低于0.1毫克/升。
进一步的，步骤(3)所述母本强化培育及促排卵为将卵巢发育饱满的母本置于20ppm高锰酸钾溶液药浴消毒30分钟，然后移入盐度在25～29‰的母本强化培育池中培育，培育密度为每平方米1只；以鲜活的螠蛏作为饵料，每天投喂一次，投喂量以第二天剩余1～2个为准；每天上午换水一次，换水量为总水量的4/5。经过若干天强化培育后，母本会将受精卵排出体外并粘附于腹部，此时的母本被称为抱卵蟹。继续抱卵蟹培育10～12天，直至腹部卵的颜色变为灰黑色或黑色时便孵化出幼体。
进一步的，所述母本强化培育池为室内半埋式水泥池，底面积20～30m3，每个培育池中4/5面积铺置10～15cm厚度的沙子，1/5面积作为饵料区，饵料区和沙子之间设置一个堤坝，在沙子上为母本设置隐蔽物，在沙子内部埋设充气头；注入新鲜海水，水位高度为60cm，在培育池上方悬挂遮阳网，保持培育池中较暗的光线。
进一步的，步骤(1)挑选出来的拟穴青蟹与锯缘青蟹的父本及母本时应挑选未完成生殖蜕壳、体肢完整、活力强且无寄生虫的雌蟹作为母本；挑选体型大、体肢完整、精巢发育饱满、活力强且无寄生虫的雄蟹作为父本。
(1)父本及母本的挑选
拟穴青蟹及锯缘青蟹物种判别标准：拟穴青蟹应头胸甲光滑，无小突起及白色斑点，螯足及步足上网格状斑纹较少，斑纹颜色淡；锯缘青蟹应头胸甲横卵圆形，甲壳背面基本上光滑，有一些粒状小突起及白色斑点，同时螯足及步足上有明显的网状斑纹。
母本(雌蟹)和父本(雄蟹)判别标准：雌蟹腹面应呈半圆形，成团脐；雄蟹腹部应呈狭长三角形，成尖脐。雌蟹腹肢共有4对，着生于2～5腹节上，每个腹肢呈双肢型，分别叫内肢和外肢；雄性腹肢特化为交接器，有2对，第一对交接器竹质化，管状，顶端着生粗短刚毛。
进一步的，每个室内循环水立体养殖设备只养殖一只蟹。
进一步的，步骤(1)中拟穴青蟹与锯缘青蟹的母本培育的条件为使用20ppm高锰酸钾溶液对父、母本进行药浴消毒15分钟；然后，将蟹移入室内循环水立体养殖设备中养殖。养殖盒内的循环水经过沉淀池、生化反应池及紫外消毒池处理，有效去除饵料残渣、粪便、氨氮、亚硝酸氮以及病原菌、病毒等致病微生物，确保水质稳定，适宜青蟹生殖蜕壳和卵巢快速发育：盐度10～15ppt，pH值7.4～8.1，氨氮低于0.5毫克/升，亚硝态氮低于0.1毫克/升。室内温度控制在22～27℃。以红肉蓝蛤为饵料饲喂亲本，每天清除饵料残渣和粪便一次。
本发明采用室内循环水立体养殖设备(“蟹公寓”)中进行培育，蟹公寓的特点是能实现一对一单独养殖，可追踪，能有效及时发现蜕壳的蟹。
与现有技术相比，本发明实现了海洋经济蟹类拟穴青蟹和锯缘青蟹人工定向种间杂交，并通过人工育苗技术获得了杂交子一代苗种。本发明具有可操作性强、成功率高、易掌握等优点，既适合开展种间杂交的基础理论研究，又适合进行产业推广和应用，从而促进海洋经济蟹类种间杂交理论研究和杂交育种研究，为青蟹产业发展提供了新的增长点。
附图说明
图1是拟穴青蟹(左边)与锯缘青蟹(右边)的外部形态特征；
图2是雌性青蟹(左边)与雄性青蟹(右边)的腹部形态特征；
图3是雌蟹生殖蜕壳前(未交配)及生殖蜕壳后(已交配)的腹部形态特征；
图4是室内循环水立体养殖设备，左边为蟹公寓，右边为养殖盒；
图5是母本生殖蜕壳及父、母本抱对交配(杂交)，左边为生殖脱壳，右边为杂交-拟穴青蟹雄(上)与锯缘青蟹雌(下)；
图6是即将孵化的受精卵(颜色已变黑)；
图7是杂交子苗种(拟穴青蟹雄×锯缘青蟹雌)的I、III、V期蚤状幼体、大眼幼体及III期仔蟹。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。
在该实验之前开展了大量的探索性实验，例如：50L杂交箱内放置多对青蟹、未进行生殖蜕壳青蟹放置一起、生殖蜕壳后在放置一起等。结果发现：母本即将或正在生殖蜕壳时，小心将其移入杂交箱内(50L左右)，并放入一只健康的异种父本(若母本为锯缘青蟹，则父本为拟穴青蟹；反之，亦然)，二者可抱对交配，成功率100％(10对)。多对、不发生生殖蜕壳蟹在一起均有相互残杀现象。
实施例1
实施时间为2018年10月10日至2019年7月5日，实施地点在饶平县红树林生态渔业有限公司和饶平县西海岸生物科技有限公司。
(1)父本及母本的挑选
拟穴青蟹及锯缘青蟹物种判别标准：拟穴青蟹应头胸甲光滑，无小突起及白色斑点，螯足及步足上网格状斑纹较少，斑纹颜色淡，如图1左边；锯缘青蟹应头胸甲横卵圆形，甲壳背面基本上光滑，有一些粒状小突起及白色斑点，同时螯足及步足上有明显的网状斑纹，如图1右边。
母本(雌蟹)和父本(雄蟹)判别标准：雌蟹腹面应呈半圆形，成团脐，如图2左边；雄蟹腹部应呈狭长三角形，成尖脐如图2右边。雌蟹腹肢共有4对，着生于2～5腹节上，每个腹肢呈双肢型，分别叫内肢和外肢；雄性腹肢特化为交接器，有2对，第一对交接器竹质化，管状，顶端着生粗短刚毛。
应挑选未完成生殖蜕壳，如图3左边、体肢完整、活力强且无寄生虫的雌蟹作为母本；挑选体型大、体肢完整、精巢发育饱满、活力强且无寄生虫的雄蟹作为父本。
(2)父本及母本的培育
父本及母本的培育工作在室内循环水立体养殖设备(俗称“蟹公寓”)中进行，如图4。首先，使用20ppm高锰酸钾溶液对父、母本进行药浴消毒15分钟；然后，将蟹移入“蟹公寓”中养殖。养殖盒内的循环水经过沉淀池、生化反应池及紫外消毒池处理，有效去除饵料残渣、粪便、氨氮、亚硝酸氮以及病原菌、病毒等致病微生物，确保水质稳定，适宜青蟹生殖蜕壳和卵巢快速发育：盐度10～15ppt，pH值7.4～8.1，氨氮低于0.5毫克/升，亚硝态氮低于0.1毫克/升。室内温度控制在22～27℃。以红肉蓝蛤为饵料饲喂亲本，每天清除饵料残渣和粪便一次。
(3)母本生殖蜕壳及种间杂交
生殖蜕壳是雌蟹必经的生物学现象，只有在完成生殖蜕壳后的短暂时间段内，雌、雄蟹才能进行交配。完成交配后，雌蟹最显著的变化是腹部由如图3左边所示的白色、狭长、近三角形，转变为如图3右边所示的深色、宽状、近半圆形，并伴随着大量绒毛伸出。
定期巡查母本生长状态，当发现母本即将或正在生殖蜕壳时，如图5左边，小心将其移入杂交箱内(50L左右)，并放入一只健康的异种父本(若母本为锯缘青蟹，则父本为拟穴青蟹；反之，亦然)，二者可抱对交配，如图5右边。杂交箱内水体为20～30L，连续充气，不投饵，盐度10～16ppt，pH值7.8～8.5，氨氮低于0.5毫克/升，亚硝态氮低于0.1毫克/升。
(4)杂交后的亲本培育
将完成交配的母本小心移入“蟹公寓”继续培育，直至卵巢发育饱满(对光观测，可见卵巢充满至头胸甲侧齿边缘)。将完成交配的父本同样移入“蟹公寓”继续培育，以用于再次交配。培育方法同步骤(2)。
(5)母本强化培育及促排卵
以室内半埋式水泥池(底面积20～30m3)作为母本强化培育池，每个培育池中4/5面积铺置10～15cm厚度的沙子，1/5面积作为饵料区，饵料区和沙子之间设置一个堤坝，在沙子上为母本设置隐蔽物，在沙子内部埋设充气头。注入新鲜海水，水位高度为60cm，保持盐度在25～29‰。在培育池上方悬挂遮阳网，保持培育池中较暗的光线。
将卵巢发育饱满的母本置于20ppm高锰酸钾溶液药浴消毒30分钟，然后移入母本强化培育池中培育，培育密度为每平方米1只。以鲜活的螠蛏作为饵料，每天投喂一次，投喂量以第二天剩余1～2个为准。每天上午换水一次，换水量为总水量的4/5。经过若干天强化培育后，母本会将受精卵排出体外并粘附于腹部，此时的母本被称为抱卵蟹。继续抱卵蟹培育10～12天，直至腹部卵的颜色变为灰黑色或黑色时便孵化出幼体，如图6。
(6)按照常规的青蟹人工育苗方法可培育出子一代苗种(杂交子一代)。图7为杂交子一代的I、III、V期蚤状幼体、大眼幼体以及III期仔蟹。得到的杂交蟹苗(III期仔蟹)平均甲宽：8.102±0.321mm、平均甲长：5.495±0.289mm、平均体重：0.066±0.007g。与正常蟹苗(III期仔蟹)无论形态和规格没有显著差异。
Claims (8)
1.一种拟穴青蟹与锯缘青蟹人工定向杂交方法，其特征在于，主要包括：
(1)分别将挑选出来的拟穴青蟹与锯缘青蟹的父本及母本消毒后放置室内循环水立体养殖设备中进行培育；
(2)当发现母本即将或正在生殖蜕壳时，将即将或正在生殖蜕壳的母本移入杂交箱内，并放入一只健康的异种拟穴青蟹或锯缘青蟹父本，二者可抱对交配；
(3)将完成交配的母本移入室内循环水立体养殖设备继续培育，直至卵巢发育饱满；将完成交配的父本同样移入室内循环水立体养殖设备继续培育，以用于再次交配；
(4)母本强化培育及促排卵；
(5)人工育苗方法培育出子一代苗种。
2.根据权利要求1所述拟穴青蟹与锯缘青蟹人工定向杂交方法，其特征在于，步骤(2)所述杂交箱内连续充气，不投饵，盐度10～16ppt，pH值7.8～8.5，氨氮低于0.5毫克/升，亚硝态氮低于0.1毫克/升。
3.根据权利要求1所述拟穴青蟹与锯缘青蟹人工定向杂交方法，其特征在于，步骤(3)所述母本强化培育及促排卵为将卵巢发育饱满的母本置于20ppm高锰酸钾溶液药浴消毒30分钟，然后移入盐度在25～29‰的母本强化培育池中培育，培育密度为每平方米1只；以鲜活的螠蛏作为饵料，每天投喂一次，投喂量以第二天剩余1～2个为准；每天上午换水一次，换水量为总水量的4/5。
4.根据权利要求3所述拟穴青蟹与锯缘青蟹人工定向杂交方法，其特征在于，所述母本强化培育池为室内半埋式水泥池，底面积20～30m3，每个培育池中4/5面积铺置10～15cm厚度的沙子，1/5面积作为饵料区，饵料区和沙子之间设置一个堤坝，在沙子上为母本设置隐蔽物，在沙子内部埋设充气头；注入新鲜海水，水位高度为60cm，在培育池上方悬挂遮阳网，保持培育池中较暗的光线。
5.根据权利要求1所述拟穴青蟹与锯缘青蟹人工定向杂交方法，其特征在于，步骤(1)挑选出来的拟穴青蟹与锯缘青蟹的父本及母本时应挑选未完成生殖蜕壳、体肢完整、活力强且无寄生虫的雌蟹作为母本；挑选体型大、体肢完整、精巢发育饱满、活力强且无寄生虫的雄蟹作为父本。
6.根据权利要求1所述拟穴青蟹与锯缘青蟹人工定向杂交方法，其特征在于，每个室内循环水立体养殖设备只养殖一只蟹。
7.根据权利要求1所述拟穴青蟹与锯缘青蟹人工定向杂交方法，其特征在于，步骤(1)中拟穴青蟹与锯缘青蟹的母本培育的条件为盐度10～15ppt，pH值7.4～8.1，氨氮低于0.5毫克/升，亚硝态氮低于0.1毫克/升；室内温度控制在22～27℃；以红肉蓝蛤为饵料饲喂亲本。
8.根据权利要求1所述拟穴青蟹与锯缘青蟹人工定向杂交方法得到的子一代苗种。
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