CN111263752A - 吲哚胺 2,3-双加氧酶的调节剂 - Google Patents

Abstract

提供了式I的IDO1抑制剂化合物及其药学上可接受的盐、它们的药物组合物、它们的制备方法以及它们用于预防和/或治疗疾病的方法。

Description

吲哚胺 2,3-双加氧酶的调节剂

发明领域

公开了用于预防和/或治疗HIV的化合物、方法和药物组合物；包括通过施用治疗有效量的某些吲哚胺2,3-双加氧酶化合物预防AIDS和一般性免疫抑制的进展。还公开了制备这样的化合物的方法以及使用所述化合物及其药物组合物的方法。

发明背景

吲哚胺-2,3-双加氧酶1(IDO1)是一种含血红素的酶，其催化色氨酸的吲哚环氧化以产生N-甲酰基犬尿氨酸，该N-甲酰基犬尿氨酸快速地和组成性地转化为犬尿氨酸(Kyn)和一系列下游代谢物。IDO1是色氨酸代谢的这种犬尿氨酸途径的限速步骤，并且在炎症的情况下IDO1的表达是可诱导的。诱导IDO1的刺激包括病毒或细菌产物，或与感染、肿瘤或无菌组织损伤有关的炎症细胞因子。Kyn和几种下游代谢物是免疫抑制的：Kyn对T细胞和NK细胞是抗增殖和促凋亡的(Munn, Shafizadeh等人 1999, Frumento, Rotondo等人 2002)，而代谢物诸如3-羟基邻氨基苯甲酸(3-HAA)或3-HAA氧化二聚产物朱砂精酸(CA)抑制吞噬细胞功能(Sekkai, Guittet等人 1997)，并诱导免疫抑制性调节性T细胞(Treg)的分化，同时抑制肠道保护性的产生IL-17或IL-22的CD4 + T细胞(Th17和Th22)的分化(Favre, Mold等人2010)。除了其它机制以外，IDO1诱导在限制主动免疫反应期间的免疫病理学中、在促进免疫反应的消退中以及在促进胎儿免疫耐性（fetal tolerance）中可能是重要的。然而，在慢性场合，诸如癌症、或慢性病毒性或细菌性感染中，IDO1活性阻止肿瘤或病原体的清除，并且如果活性是全身性的，IDO1活性可能导致全身性免疫功能障碍(Boasso和Shearer 2008,Li, Huang等人 2012)。除了这些免疫调节作用外，还已知IDO1的代谢物诸如Kyn和喹啉酸是神经毒性的，并在几种神经功能障碍和抑郁症的病况中被观察到是升高的。因此，IDO1是用于抑制多种适应症的治疗靶标，诸如促进肿瘤清除、使得能够清除难治的病毒性或细菌性感染、减少全身免疫功能障碍（表现为在HIV感染期间的持续的炎症或在败血症期间的免疫抑制）和预防或逆转神经学病况。

IDO1和HIV感染中的持续的炎症:

尽管抗逆转录病毒疗法(ART)在抑制HIV复制和减少AIDS-相关病况的发生率方面取得了成功，但正接受ART的HIV-感染的患者具有比他们的未感染的对应人群更高的非-AIDS发病和死亡的发生率。这些非-AIDS病况包括癌症、心血管疾病、骨质疏松症、肝病、肾病、虚弱和神经认知功能障碍(Deeks 2011)。若干研究表明，非-AIDS发病率/死亡率与持续的炎症有关，与对应人群相比其在正接受ART的HIV-感染的患者中保持升高(Deeks 2011)。因此，猜测尽管用ART进行了病毒学抑制，但持续的炎症和免疫功能障碍是这些非-AIDS-定义事件(NADE)的一个原因。

HIV感染并杀死CD4 + T细胞，特别偏好如那些驻留在粘膜表面的淋巴组织中的CD4 + T细胞那样的细胞(Mattapallil, Douek等人 2005)。这些细胞的丧失与对感染的炎症反应相结合，导致宿主与所有病原体(包括HIV本身，但扩展到先前存在的或获得性的病毒感染、真菌感染以及在皮肤和粘膜表面中的驻留细菌)之间的关系受到干扰。这种功能失调的宿主：病原体关系导致宿主对通常是小问题的问题过度反应并允许病原体在微生物丛中向外生长。因此，该功能失调的宿主：病原体相互作用导致炎症加剧，进而导致更严重的功能障碍，驱动恶性循环。由于炎症被认为会驱动非-AIDS发病率/死亡率，因此控制改变的宿主：病原体相互作用的机制是治疗靶标。

在未经治疗和治疗的HIV感染期间以及在灵长类SIV感染模型中，IDO1表达和活性增加(Boasso, Vaccari等人 2007, Favre, Lederer等人 2009, Byakwaga, Boum等人2014, Hunt, Sinclair等人 2014, Tenorio, Zheng等人 2014)。如酶底物和产物的血浆水平之比(Kyn/Tryp或K:T比)所示，IDO1活性与其它炎症标志物相关并且是非-AIDS发病率/死亡率的最强预测因子之一(Byakwaga, Boum等人 2014, Hunt, Sinclair等人 2014,Tenorio, Zheng等人 2014)。此外，与增加的IDO1活性对免疫系统的预期影响相一致的特征是HIV和SIV诱导的免疫功能障碍的主要特征，诸如，对抗原的T细胞增殖反应降低以及全身和肠隔室中Treg：Th17的失衡(Favre, Lederer等人 2009, Favre, Mold等人 2010)。因此，我们和其他人猜测IDO1在驱动免疫功能障碍和与非-AIDS发病率/死亡率相关的炎症的恶性循环中起作用。因此，我们提出抑制IDO1将在ART-抑制的HIV感染的人中减少炎症并降低NADEs的风险。

IDO1和HIV以外的持续的炎症

如上所述，与被治疗的慢性HIV感染相关的炎症可能是多种终末器官疾病的驱动因素[Deeks 2011]。但是，这些终末器官疾病并非HIV感染所独有，并实际上是在HIV-感染人群中较早期发生的常见老年病。在未感染的普通人群中，未知病因的炎症是发病率和死亡率的主要相关因素[Pinti, 2016 #88]。事实上，许多炎症标志物是共享的，诸如IL-6和CRP。如果，如上面猜测的那样，IDO1通过在胃肠道（GI tract）或全身组织中诱导免疫功能障碍而在HIV-感染人群中促成持续的炎症，那么IDO1也可能在更广泛的人群中促成炎症并因此促成终末器官疾病。这些与炎症相关的终末器官疾病示例如下：心血管疾病、代谢综合征、肝病(NAFLD，NASH)、肾病、骨质疏松症和神经认知损伤。事实上，IDO1途径在文献中与肝病(Italian Assoc. 对Study of the Liver Conference 2015的Vivoli摘要]、糖尿病[Baban, 2010 #89]、慢性肾病[Schefold, 2009 #90]、心血管疾病[Mangge, 2014 #92；Mangge, 2014 #91]以及一般性衰老和全因死亡率[Pertovaara, 2006 #93]有关。因此，IDO1的抑制可应用于减少一般人群中的炎症，以减少与炎症和衰老相关的特定终末器官疾病的发生率。

IDO1和肿瘤学

IDO表达可在多种人类癌症(例如；黑素瘤、胰腺癌、卵巢癌、AML、CRC、前列腺癌和子宫内膜癌)中检测到，并且与不良预后相关(Munn 2011)。多种免疫抑制作用可归因于IDO的作用，包括诱导Treg分化和过度激活、抑制Teff免疫反应和降低的DC功能，所有这些都削弱免疫识别并促进肿瘤生长(Munn 2011)。人脑肿瘤中的IDO表达与减少的存活率有关。原位的（Orthotropic）和转基因的神经胶质瘤小鼠模型证明了减少的IDO表达与减少的Treg浸润和增加的长期存活率之间的关联(Wainwright, Balyasnikova等人 2012)。在人类黑素瘤中，高比例的肿瘤(36例中的33例)显示出升高的IDO，表明在确立特征在于MDSC以Treg依赖性方式扩展、激活和募集的免疫抑制性肿瘤微环境(TME)中的重要作用(Holmgaard,Zamarin等人 2015)。另外，已经在引流淋巴结和肿瘤本身中识别出表达宿主IDO的免疫细胞(Mellor和Munn 2004)。因此，肿瘤和宿主来源的IDO均被认为有助于TME的免疫抑制状态。

IDO的抑制是为重建针对癌症的免疫原性反应而提出的首要小分子药物策略之一(Mellor和Munn 2004)。1-甲基色氨酸的d-对映体(D-1MT或吲哚莫德(indoximod)))是进入临床试验的第一个IDO抑制剂。尽管该化合物明显地的确抑制了IDO的活性，但是它是分离的酶的非常弱的抑制剂，并且该化合物的一种或多种体内作用机制仍在解释中。Incyte的研究者将由筛选过程获得的命中化合物优化为具有足够的口服暴露的有效且选择性的抑制剂，以证明在小鼠黑素瘤模型中肿瘤生长的延迟(Yue, Douty等人 2009)。该系列的进一步发展导致INCB204360，其在瞬时转染人或小鼠酶的细胞系中，相对于IDO-2和TDO，高度选择性地抑制IDO-1 (Liu, Shin等人 2010)。对于内源性地表达IDO1的细胞系和原发性人类肿瘤，观察到相似的效力(IC50s ~ 3-20 nM)。当在DC和初始CD4⁺CD25^- T细胞的共培养物中进行测试时，INCB204360阻断这些T细胞向CD4⁺FoxP3⁺ Tregs的转化。最后，当在免疫活性小鼠中的同系模型(PAN02胰腺细胞)中进行测试时，口服给药的INCB204360提供了肿瘤生长的显著剂量依赖性的抑制，但对植入免疫缺陷小鼠中的同样的肿瘤没有影响。相同研究者的其它研究表明了，在免疫活性小鼠中的另一同系肿瘤模型中，IDO1的抑制与全身性犬尿氨酸水平的抑制以及肿瘤生长的抑制相关。基于这些临床前研究，INCB24360进入了治疗转移性黑素瘤的临床试验(Beatty, O'Dwyer等人 2013)。

鉴于色氨酸的分解代谢在维持免疫抑制中的重要性，也已经检测到多种实体瘤(例如膀胱癌和肝癌、黑素瘤)过度表达第二种色氨酸代谢酶、TDO2，这并不令人惊讶。对104种人类细胞系的一项调查揭示，20/104具有TDO表达，17/104具有IDO1且16/104表达两者(Pilotte, Larrieu等人 2012)。类似于IDO1的抑制，对TDO2的选择性抑制可有效逆转过度表达TDO2的肿瘤中的免疫抵抗（immune resistance）(Pilotte, Larrieu等人 2012)。这些结果支持TDO2抑制和/或双重TDO2 / IDO1抑制作为改善免疫功能的可行治疗策略。

多项临床前研究已经表明，将IDO-1抑制剂与针对CTLA-4、PD-1和GITR的T细胞检查点调节性mAb结合具有重要的，甚至是协同的价值。在每种情况下，在跨越多种鼠类模型的这些研究中观察到了改善的免疫活性/功能的功效和相关的PD方面(Balachandran,Cavnar等人 2011, Holmgaard, Zamarin等人 2013, M. Mautino 2014, Wainwright,Chang等人 2014)。已将Incyte IDO1抑制剂(INCB204360, epacadostat)与CTLA4阻滞剂(伊匹单抗(ipilimumab))组合进行了临床测试，但由于该组合所见的剂量限制性不良事件，不清楚是否达到了有效剂量。相比之下，最近发布的一项将epacadostat与Merck的PD-1mAb (派姆单抗(pembrolizumab))组合的正在进行的试验的数据表明了该组合的改善的耐受性，从而允许更高剂量的IDO1抑制剂。存在令人鼓舞的跨跃各种不同的肿瘤类型的若干临床反应。然而，尚不清楚这种组合是否比派姆单抗的单药活性有所改善(Gangadhar,Hamid等人 2015)。类似地，在最近完成了针对晚期肿瘤患者的1a期安全性和PK/PD研究之后，Roche/Genentech正在推进NGL919/ GDC-0919与对PD-L1 (MPDL3280A, Atezo)和OX-40的两种mAb的组合。

IDO1和慢性感染

IDO1活性产生犬尿氨酸途径代谢物诸如Kyn和3-HAA，其至少损害T细胞、NK细胞和巨噬细胞活性(Munn, Shafizadeh等人 1999, Frumento, Rotondo等人 2002) (Sekkai,Guittet等人 1997, Favre, Mold等人 2010)。Kyn水平或Kyn/Tryp比在慢性HIV感染(Byakwaga, Boum等人 2014, Hunt, Sinclair等人 2014, Tenorio, Zheng等人 2014)、HBV感染(Chen, Li等人 2009)、HCV感染(Larrea, Riezu-Boj等人 2007, Asghar, Ashiq等人 2015)和TB感染(Suzuki, Suda等人 2012)的场合升高并与抗原特异性T细胞功能障碍相关(Boasso, Herbeuval等人 2007, Boasso, Hardy等人 2008, Loughman 和Hunstad2012, Ito, Ando等人 2014, Lepiller, Soulier等人 2015)。因此，认为在这些慢性感染的情况下，IDO1介导的病原体特异性T细胞反应的抑制在感染的持续性中起作用，并且IDO1的抑制可能对促进清除和消退感染具有益处。

IDO1和败血症

观察到败血症期间IDO1表达和活性升高，并且Kyn或Kyn/Tryp升高的程度对应于增加的疾病严重性，包括死亡率 (Tattevin, Monnier等人 2010, Darcy, Davis等人 2011)。在动物模型中，IDO1或IDO1基因敲除的阻断保护了小鼠免于LPS的致死剂量或盲肠结扎/穿孔模型中的死亡 (Jung, Lee等人 2009, Hoshi, Osawa等人 2014)。败血症的特征是在严重病例中的免疫抑制期(Hotchkiss, Monneret等人 2013)，潜在地表明IDO1作为免疫功能障碍的介质的作用，并表明IDO1的药理学抑制可为败血症提供临床益处。

IDO1和神经障碍

除了免疫学场合外，IDO1活性还与神经学场合中的疾病相关(在LovelaceNeuropharmacology 2016(Lovelace, Varney等人 2016)中综述)。犬尿氨酸途径代谢物，诸如3-羟基犬尿氨酸和喹啉酸，具有神经毒性，但被神经保护性的替代代谢物犬尿喹啉酸或吡啶甲酸平衡。犬尿氨酸途径代谢物已被证实与疾病相关的神经变性和精神障碍包括多发性硬化症、运动神经元障碍诸如肌萎缩性侧索硬化症、亨廷顿氏病、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、重度抑郁症、精神分裂症、厌食症(Lovelace, Varney等人 2016)。神经学疾病的动物模型已显示出弱的IDO1抑制剂(诸如1-甲基色氨酸)对疾病的某些影响，表明IDO1抑制可能为预防或治疗神经学和精神障碍提供临床益处。

因此，发现有效平衡上述特性的IDO抑制剂将是本领域的一个进步，所述IDO抑制剂作为慢性HIV感染中的疾病改善疗法，以降低非-AIDS发病/死亡的发生率；和/或疾病改善疗法，以阻止败血症的死亡率；和/或免疫疗法，以增强对HIV、HBV、HCV和其它慢性病毒感染、慢性细菌感染、慢性真菌感染和对肿瘤的免疫反应；和/或用于治疗抑郁症或其它神经学/神经精神障碍。

Asghar, K., M. T. Ashiq, B. Zulfiqar, A. Mahroo, K. Nasir和S. Murad(2015)； "Indoleamine 2,3-dioxygenase expression and activity in patients withhepatitis C virus-induced liver cirrhosis." Exp Ther Med 9(3): 901-904；

Balachandran, V. P., M. J. Cavnar, S. Zeng, Z. M. Bamboat, L. M. Ocuin,H. Obaid, E. C. Sorenson, R. Popow, C. Ariyan, F. Rossi, P. Besmer, T. Guo,C. R. Antonescu, T. Taguchi, J. Yuan, J. D. Wolchok, J. P. Allison 和 R. P.Dematteo (2011)； "Imatinib potentiates antitumor T cell responses ingastrointestinal stromal tumor through the inhibition of Ido." Nature Medicine 17(9): 1094-1100；

Beatty, G. L., P. J. O'Dwyer, J. Clark, J. G. Shi, R. C. Newton, R.Schaub, J. Maleski, L. Leopold和T. Gajewski (2013)； "Phase I study of thesafety, pharmacokinetics (PK), and pharmacodynamics (PD) of the oralinhibitor of indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO1) INCB024360 in patients (pts)with advanced malignancies." ASCO Meeting Abstracts 31(15_suppl): 3025；

Boasso, A., A. W. Hardy, S. A. Anderson, M. J. Dolan和G. M. Shearer(2008)； "HIV-induced type I interferon and tryptophan catabolism drive T celldysfunction despite phenotypic activation." PLoS One 3(8): e2961；

Boasso, A., J. P. Herbeuval, A. W. Hardy, S. A. Anderson, M. J. Dolan, D.Fuchs和G. M. Shearer (2007)； "HIV inhibits CD4+ T-cell proliferation byinducing indoleamine 2,3-dioxygenase in plasmacytoid dendritic cells." Blood109(8): 3351-3359；

Boasso, A. 和G. M. Shearer (2008)； "Chronic innate immune activation as acause of HIV-1 immunopathogenesis." Clin Immunol 126(3): 235-242；

Boasso, A., M. Vaccari, A. Hryniewicz, D. Fuchs, J. Nacsa, V. Cecchinato,J. Andersson, G. Franchini, G. M. Shearer 和C. Chougnet (2007)； "RegulatoryT-cell markers, indoleamine 2,3-dioxygenase, and virus levels in spleen andgut during progressive simian immunodeficiency virus infection." J Virol 81(21): 11593-11603；

Byakwaga, H., Y. Boum, 2nd, Y. Huang, C. Muzoora, A. Kembabazi, S. D.Weiser, J. Bennett, H. Cao, J. E. Haberer, S. G. Deeks, D. R. Bangsberg, J.M. McCune, J. N. Martin和P. W. Hunt (2014)； "The kynurenine pathway oftryptophan catabolism, CD4+ T-cell recovery, and mortality among HIV-infectedUgandans initiating antiretroviral therapy." J Infect Dis 210(3): 383-391；

Chen, Y. B., S. D. Li, Y. P. He, X. J. Shi, Y. Chen和J. P. Gong (2009)； "Immunosuppressive effect of IDO on T cells in patients with chronic hepatitisB*." Hepatol Res 39(5): 463-468；

Darcy, C. J., J. S. Davis, T. Woodberry, Y. R. McNeil, D. P. Stephens, T.W. Yeo和N. M. Anstey (2011)； "An observational cohort study of the kynurenineto tryptophan ratio in sepsis: association with impaired immune andmicrovascular function." PLoS One 6(6): e21185；

Deeks, S. G. (2011)； "HIV infection, inflammation, immunosenescence, andaging." Annu Rev Med 62: 141-155；

Favre, D., S. Lederer, B. Kanwar, Z. M. Ma, S. Proll, Z. Kasakow, J.Mold, L. Swainson, J. D. Barbour, C. R. Baskin, R. Palermo, I. Pandrea, C. J.Miller, M. G. Katze和J. M. McCune (2009)； "Critical loss of the balancebetween Th17 and T regulatory cell populations in pathogenic SIV infection."PLoS Pathog 5(2): e1000295；

Favre, D., J. Mold, P. W. Hunt, B. Kanwar, P. Loke, L. Seu, J. D.Barbour, M. M. Lowe, A. Jayawardene, F. Aweeka, Y. Huang, D. C. Douek, J. M.Brenchley, J. N. Martin, F. M. Hecht, S. G. Deeks和J. M. McCune (2010)； "Tryptophan catabolism by indoleamine 2,3-dioxygenase 1 alters the balance ofTH17 to regulatory T cells in HIV disease." Sci Transl Med 2(32): 32ra36；

Frumento, G., R. Rotondo, M. Tonetti, G. Damonte, U. Benatti和G. B.Ferrara (2002)；"Tryptophan-derived catabolites are responsible for inhibitionof T and natural killer cell proliferation induced by indoleamine 2,3-dioxygenase." J Exp Med 196(4): 459-468；

Gangadhar, T., O. Hamid, D. Smith, T. Bauer, J. Wasser, J. Luke, A.Balmanoukian, D. Kaufman, Y. Zhao, J. Maleski, L. Leopold和T. Gajewski(2015)； "Preliminary results from a Phase I/II study of epacadostat(incb024360) in combination with pembrolizumab in patients with selectedadvanced cancers." Journal for ImmunoTherapy of Cancer 3(Suppl 2): O7；

Holmgaard, R. B., D. Zamarin, Y. Li, B. Gasmi, D. H. Munn, J. P. Allison,T. Merghoub和J. D. Wolchok (2015)； "Tumor-Expressed IDO Recruits andActivates MDSCs in a Treg-Dependent Manner." Cell Reports 13(2): 412-424；

Holmgaard, R. B., D. Zamarin, D. H. Munn, J. D. Wolchok和J. P. Allison(2013)； "Indoleamine 2,3-dioxygenase is a critical resistance mechanism inantitumor T cell immunotherapy targeting CTLA-4." Journal of Experimental Medicine 210(7): 1389-1402；

Hoshi, M., Y. Osawa, H. Ito, H. Ohtaki, T. Ando, M. Takamatsu, A. Hara,K. Saito和M. Seishima (2014)； "Blockade of indoleamine 2,3-dioxygenasereduces mortality from peritonitis and sepsis in mice by regulating functionsof CD11b+ peritoneal cells." Infect Immun 82(11): 4487-4495；

Hotchkiss, R. S., G. Monneret和D. Payen (2013)； "Sepsis-inducedimmunosuppression: from cellular dysfunctions to immunotherapy." Nat Rev Immunol 13(12): 862-874；

Hunt, P. W., E. Sinclair, B. Rodriguez, C. Shive, B. Clagett, N.Funderburg, J. Robinson, Y. Huang, L. Epling, J. N. Martin, S. G. Deeks, C.L. Meinert, M. L. Van Natta, D. A. Jabs和M. M. Lederman (2014)； "Gutepithelial barrier dysfunction and innate immune activation predict mortalityin treated HIV infection." J Infect Dis 210(8): 1228-1238；

Ito, H., T. Ando, K. Ando, T. Ishikawa, K. Saito, H. Moriwaki和M.Seishima (2014)；"Induction of hepatitis B virus surface antigen-specificcytotoxic T lymphocytes can be up-regulated by the inhibition of indoleamine2, 3-dioxygenase activity." Immunology 142(4): 614-623；

Jung, I. D., M. G. Lee, J. H. Chang, J. S. Lee, Y. I. Jeong, C. M. Lee,W. S. Park, J. Han, S. K. Seo, S. Y. Lee和Y. M. Park (2009)； "Blockade ofindoleamine 2,3-dioxygenase protects mice against lipopolysaccharide-inducedendotoxin shock." J Immunol 182(5): 3146-3154；

Larrea, E., J. I. Riezu-Boj, L. Gil-Guerrero, N. Casares, R. Aldabe, P.Sarobe, M. P. Civeira, J. L. Heeney, C. Rollier, B. Verstrepen, T. Wakita, F.Borras-Cuesta, J. J. Lasarte和J. Prieto (2007)； "Upregulation of indoleamine2,3-dioxygenase in hepatitis C virus infection." J Virol 81(7): 3662-3666；

Lepiller, Q., E. Soulier, Q. Li, M. Lambotin, J. Barths, D. Fuchs, F.Stoll-Keller, T. J. Liang和H. Barth (2015)； "Antiviral and ImmunoregulatoryEffects of Indoleamine-2,3-Dioxygenase in Hepatitis C Virus Infection." J Innate Immun 7(5): 530-544；

Li, L., L. Huang, H. P. Lemos, M. Mautino和A. L. Mellor (2012)； "Alteredtryptophan metabolism as a paradigm for good and bad aspects of immuneprivilege in chronic inflammatory diseases." Front Immunol 3: 109；

Liu, X., N. Shin, H. K. Koblish, G. Yang, Q. Wang, K. Wang, L. Leffet, M.J. Hansbury, B. Thomas, M. Rupar, P. Waeltz, K. J. Bowman, P. Polam, R. B.Sparks, E. W. Yue, Y. Li, R. Wynn, J. S. Fridman, T. C. Burn, A. P. Combs, R.C. Newton和P. A. Scherle (2010)； "Selective inhibition of IDO1 effectivelyregulates mediators of antitumor immunity." Blood 115(17): 3520-3530；

Loughman, J. A. 和D. A. Hunstad (2012)； "Induction of indoleamine 2,3-dioxygenase by uropathogenic bacteria attenuates innate responses toepithelial infection." J Infect Dis 205(12): 1830-1839；

Lovelace, M. D., B. Varney, G. Sundaram, M. J. Lennon, C. K. Lim, K.Jacobs, G. J. Guillemin和B. J. Brew (2016)； "Recent evidence for an expandedrole of the kynurenine pathway of tryptophan metabolism in neurologicaldiseases." Neuropharmacology；

M. Mautino, C. J. L., N. Vahanian, J. Adams, C. Van Allen, M. D. Sharma,T. S. Johnson和D.H. Munn (2014)； "Synergistic antitumor effects ofcombinatorial immune checkpoint inhibition with anti-PD-1/PD-L antibodies andthe IDO pathway inhibitors NLG919 and indoximod in the context of activeimmunotherapy." April 2014 AACR Meeting Poster # 5023；

Mattapallil, J. J., D. C. Douek, B. Hill, Y. Nishimura, M. Martin和M.Roederer (2005)；"Massive infection and loss of memory CD4+ T cells inmultiple tissues during acute SIV infection." Nature 434(7037): 1093-1097；

Mellor, A. L. 和D. H. Munn (2004)； "IDO expression by dendritic cells:Tolerance and tryptophan catabolism." Nature Reviews Immunology 4(10): 762-774；

Munn, D. H. (2011)； "Indoleamine 2,3-dioxygenase, Tregs and cancer."Current Medicinal Chemistry 18(15): 2240-2246；

Munn, D. H., E. Shafizadeh, J. T. Attwood, I. Bondarev, A. Pashine和A. L.Mellor (1999)； "Inhibition of T cell proliferation by macrophage tryptophancatabolism." J Exp Med 189(9): 1363-1372；

Pilotte, L., P. Larrieu, V. Stroobant, D. Colau, E. Dolušić, R. Frédérick, E. De Plaen, C. Uyttenhove, J. Wouters, B. Masereel和B. J. Van DenEynde (2012)； "Reversal of tumoral immune resistance by inhibition oftryptophan 2,3-dioxygenase." Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 109(7): 2497-2502；

Sekkai, D., O. Guittet, G. Lemaire, J. P. Tenu和M. Lepoivre (1997)； "Inhibition of nitric oxide synthase expression and activity in macrophages by3-hydroxyanthranilic acid, a tryptophan metabolite." Arch Biochem Biophys 340(1): 117-123；

Suzuki, Y., T. Suda, K. Asada, S. Miwa, M. Suzuki, M. Fujie, K.Furuhashi, Y. Nakamura, N. Inui, T. Shirai, H. Hayakawa, H. Nakamura和K.Chida (2012)； "Serum indoleamine 2,3-dioxygenase activity predicts prognosisof pulmonary tuberculosis." Clin Vaccine Immunol 19(3): 436-442；

Tattevin, P., D. Monnier, O. Tribut, J. Dulong, N. Bescher, F. Mourcin,F. Uhel, Y. Le Tulzo和K. Tarte (2010)； "Enhanced indoleamine 2,3-dioxygenaseactivity in patients with severe sepsis and septic shock." J Infect Dis 201(6): 956-966；

Tenorio, A. R., Y. Zheng, R. J. Bosch, S. Krishnan, B. Rodriguez, P. W.Hunt, J. Plants, A. Seth, C. C. Wilson, S. G. Deeks, M. M. Lederman和A. L.Landay (2014)； "Soluble markers of inflammation and coagulation but not T-cell activation predict non-AIDS-defining morbid events during suppressiveantiretroviral treatment." J Infect Dis 210(8): 1248-1259；

Wainwright, D. A., I. V. Balyasnikova, A. L. Chang, A. U. Ahmed, K.-S.Moon, B. Auffinger, A. L. Tobias, Y. Han和M. S. Lesniak (2012)；"IDOExpression in Brain Tumors Increases the Recruitment of Regulatory T Cellsand Negatively Impacts Survival." Clinical Cancer Research 18(22): 6110-6121；

Wainwright, D. A., A. L. Chang, M. Dey, I. V. Balyasnikova, C. K. Kim, A.Tobias, Y. Cheng, J. W. Kim, J. Qiao, L. Zhang, Y. Han和M. S. Lesniak (2014)；"Durable therapeutic efficacy utilizing combinatorial blockade against IDO,CTLA-4, and PD-L1 in mice with brain tumors." Clinical Cancer Research 20(20): 5290-5301；

Yue, E. W., B. Douty, B. Wayland, M. Bower, X. Liu, L. Leffet, Q. Wang,K. J. Bowman, M. J. Hansbury, C. Liu, M. Wei, Y. Li, R. Wynn, T. C. Burn, H.K. Koblish, J. S. Fridman, B. Metcalf, P. A. Scherle和A. P. Combs (2009)； "Discovery of potent competitive inhibitors of indoleamine 2,3-dioxygenasewith in vivo pharmacodynamic activity and efficacy in a mouse melanomamodel." Journal of Medicinal Chemistry 52(23): 7364-7367。

发明概述

简而言之，在一个方面，本发明公开了式I的化合物

或其药学上可接受的盐，其中：

每个n独立地为2、1或0（即不存在）；

Q¹是-C(O)NH-、NHC(O)-或5-9元杂环，其中所述杂环含有1-3个独立地选自O、S和N的杂原子，并且其中所述杂环可以任选被1-4个独立地选自下述的取代基取代：卤素、OH、C_1-3烷基、OC_1-3烷基、C_1-3氟代烷基、CN和NH₂；

Ar¹ 是C_5-9芳基或5-9 元杂芳基，其中芳基和杂芳基包括双环并且杂芳基含有1-3个独立地选自O、S和N的杂原子，并且其中Ar¹ 可以任选被1-4个独立地选自下述的取代基取代：卤素、OH、C_1-3烷基、OC_1-3烷基、C_1-3氟代烷基、CN和NH₂；和

Ar² 是C_5-9芳基或5-9 元杂芳基，其中杂芳基含有1-3个独立地选自O、S和N的杂原子，并且其中Ar¹ 可以任选被1-4个独立地选自下述的取代基取代：卤素、OH、C_1-3烷基、OC_1-3烷基、C_1-3氟代烷基、CN和NH₂。

在另一方面，本发明公开了一种治疗将从IDO的抑制中受益的疾病或病况的方法。实例包括：与HIV感染有关的炎症；涉及乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒的慢性病毒感染；癌症；或败血症。

在另一方面，本发明公开了包含式I化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物。

在另一方面，本发明提供了用于治疗的式I化合物或其药学上可接受的盐。

在另一方面，本发明提供了用于治疗将从IDO的抑制中受益的疾病或病况的式I化合物或其药学上可接受的盐。

在另一方面，本发明提供了式I化合物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗将从IDO的抑制中受益的疾病或病况的药物中的用途。

在另一方面，本发明公开了一种用于治疗至少部分地由病毒的逆转录病毒家族中的病毒介导的患者中的病毒感染的方法，包括向所述患者施用包含式I化合物或其药学上可接受的盐的组合物。在一些实施方案中，病毒感染由HIV病毒介导。

在另一方面，本发明的一个具体实施方案提供了一种治疗被HIV感染的对象的方法，包括向该对象施用治疗有效量的式I化合物或其药学上可接受的盐。

在又另一方面，本发明的一个具体实施方案提供了一种在具有感染HIV风险的对象中抑制HIV感染的进展的方法，包括向该对象施用治疗有效量的式I化合物或其药学上可接受的盐。在下文中进一步描述了那些和其它实施方案。

代表性实施方案的详述

优选地，Ar¹ 是喹啉、异喹啉、喹唑啉、喹喔啉、吲哚、氮杂吲哚、苯并二唑、苯基、吡啶基、二唑或嘧啶，并且其中Ar¹ 可以任选被选自下述的取代基取代：卤素、OH、C_1-3烷基、OC_1-3烷基、C_1-3氟代烷基、CN和NH₂。更优选地，Ar¹ 是喹啉、异喹啉或吲哚，并且可以任选被选自下述的取代基取代：卤素、OH、C_1-3烷基、OC _1-3烷基、C_1-3氟代烷基、CN和NH₂。最优选地，Ar¹ 是任选被卤素取代的喹啉。

优选地，Ar² 是苯基或噻吩，任选被卤素取代。

优选的药物组合物包括单位剂型。优选的单位剂型包括片剂。

特别地，预期本发明的化合物和组合物将可用于预防和/或治疗HIV；包括预防AIDS和一般性免疫抑制的进展。预期在许多情况下，这样的预防和/或治疗将涉及用本发明的化合物与被认为对这样的预防和/或治疗有用的至少一种其它药物组合进行治疗。例如，本发明的IDO抑制剂可以与其它免疫疗法诸如免疫检查点(PD1、CTLA4、ICOS等)组合使用，并且可能与生长因子或细胞因子疗法(IL21、IL-7等)组合使用。

在治疗HIV中的常见实践是采用超过一种的有效药剂。因此，根据本发明的另一个实施方案，提供了一种用于预防或治疗至少部分地由病毒的逆转录病毒家族中的病毒介导的哺乳动物中的病毒感染的方法，该方法包括向已经被诊断出患有所述病毒感染或处于发展所述病毒感染的风险中的哺乳动物施用如式I中所定义的化合物，其中所述病毒为HIV病毒，并且该方法进一步包括施用治疗有效量的一种或多种对HIV病毒有效的药剂，其中所述对HIV病毒有效的药剂选自核苷酸逆转录酶抑制剂；非核苷酸逆转录酶抑制剂；蛋白酶抑制剂；进入、附着和融合抑制剂；整合酶抑制剂；成熟抑制剂；CXCR4抑制剂；和CCR5抑制剂。这样的其它药物的实例是多替拉韦（Dolutegravir）、比特雷韦（Bictegravir）和卡博特韦（Cabotegravir）。

“药学上可接受的盐”指衍生自本领域众所周知的多种有机和无机抗衡离子并且包括（仅作为实例）钠、钾、钙、镁、铵和四烷基铵的药学上可接受的盐，和当分子含有碱性官能团时，有机或无机酸的盐，诸如盐酸盐、氢溴酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、乙酸盐、马来酸盐和草酸盐。合适的盐包括P. Heinrich Stahl, Camille G. Wermuth (编), Handbook ofPharmaceutical Salts Properties, Selection, and Use; 2002中描述的那些。

本发明还包括本文所述化合物的药学上可接受的盐。如本文所用，“药学上可接受的盐”指所公开的化合物的衍生物，其中母体化合物通过将现有的酸或碱基团转化为其盐形式而被修饰。药学上可接受的盐的实例包括但不限于碱性残基诸如胺的无机或有机酸盐；酸性残基诸如羧酸的碱金属或有机盐；等等。本发明的药学上可接受的盐包括例如由无毒的无机或有机酸形成的母体化合物的常规无毒的盐。本发明的药学上可接受的盐可以通过常规化学方法由含有碱性或酸性基团的母体化合物合成。通常，这样的盐可以通过在水中或在有机溶剂中或在两者的混合物中使这些化合物的游离酸或碱形式与化学计量量的合适的碱或酸反应来制备；通常，非水介质如乙醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或ACN是优选的。

本文所用的短语“药学上可接受的”指在合理的医学判断范围内，适合用于与人和动物的组织接触而不具有过度的毒性、刺激性、过敏反应或其它问题或并发症，与合理的获益/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。

在一个实施方案中，含有式I化合物或其盐的药物制剂是适于口服或肠胃外施用的制剂。在另一个实施方案中，所述制剂是长效肠胃外制剂。在另一个实施方案中，所述制剂是纳米颗粒制剂。

本发明涉及作为免疫抑制的新疗法有效用的化合物、组合物和药物组合物。尽管不希望受到任何特定理论的束缚，但认为本发明的化合物能够利用分子氧或活性氧抑制催化生成N-甲酰基犬尿氨酸的I-Trp的氧化吡咯环裂解反应的酶。

因此，在本发明的另一个实施方案中，提供了一种用于预防和/或治疗HIV的方法；包括预防AIDS和一般性免疫抑制的进展。

实施例

下列实施例用于更充分地描述制造和使用上述发明的方式。应当理解，这些实施例决不用于限制本发明的真正范围，而是出于说明性目的而给出。在下面的实施例和合成方案中，以下缩写具有以下含义。如果未定义缩写，则其具有其被普遍接受的含义。

CAN =乙腈

AIBN =偶氮二异丁腈

aq. =含水的

µL或uL =微升

µM或uM =微摩尔

NMR =核磁共振

BOC =叔丁氧基羰基

Br =宽峰

Cbz =苄氧羰基

CDI =1,1′-羰基二咪唑

D =双峰

Δ =化学位移

℃ =摄氏度

DCM =二氯甲烷

Dd =双二重峰

DHP =二氢吡喃

DIAD =偶氮二甲酸二异丙酯

DIEA或DIPEA =N,N-二异丙基乙胺

DMAP =4-(二甲氨基)吡啶

DMEM =达尔伯克改良伊格尔培养基（Dulbeco’s Modified Eagle’s

Medium）

EtOAc =乙酸乙酯

h或hr =小时

HATU =1-[双(二甲氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧

化物六氟磷酸盐

HCV =丙型肝炎病毒

HPLC =高效液相色谱法

Hz =赫兹

IU =国际单位

IC₅₀ =50％抑制时的抑制浓度

J =偶合常数(除非另有说明，否则以Hz给出)

LCMS =液相色谱-质谱法

M =多重峰

M =摩尔

M+H⁺ =母体质谱峰加H⁺

MeOH =甲醇

Mg =毫克

Min =分钟

mL =毫升

mM =毫摩尔的

Mmol =毫摩尔

MS =质谱

MTBE =甲基叔丁基醚

N =标准的

NFK =N-甲酰基犬尿氨酸

NBS =N-溴代琥珀酰亚胺

Nm =纳摩尔的

PE =石油醚

Ppm =百万分率

q.s. =足量

S =单峰

RT =室温

Rf =滞留因子

sat. =饱和的

T =三重峰

TEA =三乙胺

TFA =三氟乙酸

TFAA =三氟乙酸酐

THF =四氢呋喃。

设备描述

¹H NMR谱在Bruker Ascend 400 光谱仪或 Varian 400 光谱仪上记录。化学位移以百万分率(ppm, δ单位)表达。偶合常数以赫兹(Hz)为单位。分裂模式描述了明显的多重态，并指定为s (单峰)、d (双峰)、t (三重峰)、q (四重峰)、quint (五重峰)、m (多重峰)、br(宽峰)。

在具有SQ检测器的Waters ACQUITY UPLC上使用Waters BEH C18, 2.1 x 50 mm,1.7 µm，使用梯度洗脱法，记录分析型低分辨率质谱(MS)。

溶剂A: 在水中的0.1% 甲酸(FA)；

溶剂B: 在乙腈中的0.1% FA；

30% B持续0.5 min，随后是30-100% B历经2.5 min。

实施例1和实施例 2

2-(1,4-二氧杂螺[4.5]癸-8-亚基)乙酸乙酯的制备

在0℃，在氮气下，随着剧烈搅拌，向NaH (60%，在油中) (6.92g，288 mmol)在无水THF(650 mL)中的悬浮液中滴加膦酰基乙酸三乙酯(52.5g，288 mmol)。在0℃搅拌30min后，滴加在THF (150 mL)中的1,4-环己二酮单乙二醇缩酮(41g，260 mmol)。使所得混合物温热至室温并搅拌过夜。将反应混合物倒入饱和NH₄Cl水溶液中并用EtOAc萃取。依次用水和盐水洗涤有机物，并经Na₂SO₄干燥。过滤并真空浓缩得到粗产物，将其通过快速色谱法(硅胶，在PE中的0-30% EtOAc)纯化，得到标题化合物(56g，95%收率)。C₁₂H₁₈O₄的(ESI) m/z计算值：226.12。实测值: 227.33 (M+1)⁺。

7,10-二氧杂二螺[2.2.4 ⁶ .2 ³ ]十二烷-1-甲酸乙酯的制备

在0℃，在氮气下，随着剧烈搅拌，向NaH (60%，在油中) (2.82 g, 70.4 mmol)在无水DMF (120 mL)中的悬浮液中分批加入三甲基碘化亚砜(trimethylsulfoxonium iodide)(15.5 g, 70.4 mmol.)。在0℃搅拌30min后，滴加在DMF (30 mL)中的2-(1,4-二氧杂螺[4.5]癸-8-亚基)乙酸乙酯 (8.76 g, 38.7 mmol)。使所得混合物温热至室温并搅拌另外3h。将反应混合物倒入饱和NH₄Cl水溶液中并用EtOAc萃取。依次用水和盐水洗涤有机物，并经Na₂SO₄干燥。过滤并真空浓缩得到粗产物，将其通过快速色谱法 (硅胶，在PE中的10-30%EtOAc)纯化得到标题化合物(5.2 g, 56%收率)。C₁₃H₂₀O₄的(ESI) m/z计算值：240.14。实测值: 241.56 (M+1)⁺。

6-氧代螺[2.5]辛烷-1-甲酸乙酯的制备

向7,10-二氧杂二螺[2.2.4⁶.2³]十二烷-1-甲酸乙酯 (5.0 g, 20.8 mmol)在丙酮(50mL)中的溶液滴加6 N HCl (20 mL, 120 mmol)。将反应混合物在室温搅拌过夜后，加入水和EtOAc，并分离各层。依次用水和盐水洗涤有机物，并经Na₂SO₄干燥。过滤并真空浓缩得到粗产物，将其通过快速色谱法 (硅胶，在PE中的0-20% EtOAc)纯化得到标题化合物(2.6 g,64%收率)。C₁₁H₁₆O₃的(ESI) m/z计算值：196.11。实测值: 197.26 (M+1)⁺。

6-(((三氟甲基)磺酰基)氧基)螺[2.5]辛-5-烯-1-甲酸乙酯的制备

在-78℃，向6-氧代螺[2.5]辛烷-1-甲酸乙酯(2.57 g, 13.11 mmol)在THF中的溶液中在30min期间滴加LiHMDS (13.77 mL, 13. mmol)，将反应混合物在相同温度搅拌另外1h。然后，将N-苯基双-(三氟甲烷磺酰胺) (4.92 g, 13.77 mmol)在THF (20 mL)中的溶液滴加到反应混合物中。在室温搅拌过夜后，将反应混合物用NH4Cl水溶液淬灭并将所得混合物用EtOAc萃取。合并的有机层依次用水和盐水洗涤，并经Na₂SO₄干燥。过滤并真空浓缩得到粗产物，将其通过快速色谱法 (硅胶，在PE中的0-20%EtOAc)纯化得到标题化合物(2.36 g,55%收率)。C₁₂H₁₅F₃O₅S的(ESI) m/z计算值：328.06。实测值: 329.42 (M+1)⁺。

6-(喹啉-4-基)螺[2.5]辛-5-烯-1-甲酸乙酯的制备

将6-(((三氟甲基)磺酰基)氧基)螺[2.5]辛-5-烯-1-甲酸乙酯 (2.26 g, 6.89mmol)、喹啉-4-基硼酸 (1.79 g, 10.34 mmol)、Pd(PPh₃)₄ (796 mg, 0.689 mmol)、Na₂CO₃(1.83 g, 11.23 mmol)、KBr (902 mg, 7.58 mmol)在二噁烷 (20 mL)和水(2 mL)中的悬浮液在100℃在氮气气氛下搅拌14小时。在反应混合物冷却至室温后，将其在水和EtOAc之间分配并分离各层。依次用水和盐水洗涤有机物，并经Na₂SO₄干燥。过滤并真空浓缩得到粗产物，将其通过快速色谱法纯化，得到标题化合物(1.01 g, 48%收率)。C₂₀H₂₁NO₂的(ESI) m/z计算值：307.16。实测值: 308.26 (M+1)⁺。

6-(喹啉-4-基)螺[2.5]辛烷-1-甲酸乙酯的制备

将6-(喹啉-4-基)螺[2.5]辛-5-烯-1-甲酸乙酯(500 mg, 1.63 mmol)和10% Pd/C(0.2 g)在MeOH (10 mL)中的混合物在室温在H₂气氛(15 psi)下搅拌过夜。将所得混合物滤过硅藻土垫并将滤液在减压下浓缩，得到粗产物，将其通过快速色谱法(硅胶，在PE中的0-30% EtOAc) 纯化，得到标题化合物(0.4 g, 79%收率)，为棕色油。C₂₀H₂₃NO₂的(ESI) m/z计算值：309.41。实测值: 310.68 (M+1)⁺。

6-(喹啉-4-基)螺[2.5]辛烷-1-甲酸的制备

向6-(喹啉-4-基)螺[2.5]辛烷-1-甲酸酯 (0.20 g, 0.65 mmol)在MeOH (6 mL)中的溶液中加入1N NaOH水溶液(2.6 mL, 2.6 mmol)。在室温搅拌过夜后，所得混合物用1N HCl中和，并用EtOAc萃取。有机层用盐水洗涤，经Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩。合并的有机层经Na₂SO₄干燥。在真空下除去溶剂，并将残余物通过制备型TLC (在DCM中的5% MeOH)纯化，得到标题化合物。顺式异构体(80 mg, 44%收率):

。C₁₈H₁₉NO₂的LCMS (ESI) m/z计算值：281.14。实测值: 282.30 (M+1)⁺。反式异构体(30 mg, 16%收率):

。C₁₈H₁₉NO₂的LCMS (ESI) m/z计算值：281.14。实测值: 282.34 (M+1)⁺。

顺式-N-(4-氯苯基)-6-(喹啉-4-基)螺[2.5]辛烷-1-甲酰胺的制备(实施例 1)

向顺式-6-(喹啉-4-基)螺[2.5]辛烷-1-甲酸 (80 mg, 0.285 mmol)和4-氯苯胺 (44mg, 0.342 mmol)在DCM (5 mL)中的搅拌的溶液中加入DIPEA (56 mg, 0.427 mmol)，然后加入HATU (162 mg, 0.427 mmol)。在室温搅拌过夜后，将反应混合物用盐水淬灭，并将所得混合物用DCM萃取(x3)。合并的有机层经Na₂SO₄干燥。在真空下除去溶剂，并将残余物通过制备型HPLC纯化，得到标题化合物(81 mg, 73%收率)。

；

C₂₄H₂₃ClN₂O的LCMS (ESI) m/z计算值：390.15。实测值: 391.24/393.15 (M/M+2)⁺。

反式-N-(4-氯苯基)-6-(喹啉-4-基)螺[2.5]辛烷-1-甲酰胺的制备(实施例 2)

向反式-6-(喹啉-4-基)螺[2.5]辛烷-1-甲酸 (30 mg, 0.107 mmol)和4-氯苯胺 (16mg, 0.128 mmol) 在DCM (2 mL)中的搅拌的溶液中加入DIPEA (21 mg, 0.159 mmol)，然后加入HATU (60 mg, 0.159 mmol)。在室温搅拌过夜后，将反应混合物用盐水淬灭，并将所得混合物用DCM萃取(x3)。合并的有机层经Na₂SO₄干燥。在真空下除去溶剂，并将残余物通过制备型HPLC纯化，得到标题化合物(21 mg, 50%收率)。

；

C₂₄H₂₃ClN₂O的LCMS (ESI) m/z计算值：390.15。实测值: 391.24/393.15 (M/M+2)⁺。

实施例 3

8-亚甲基-1,4-二氧杂螺[4.5]癸烷的制备

在0℃，将1.0M 叔丁醇钾在THF (499 mL, 499 mmol)中的溶液缓慢加入到在0℃的溴化甲基三苯基鏻 (178 g, 499 mmol)在THF (450 mL)中的混合物中。在搅拌1h后，加入1,4-二氧杂-螺[4.5]癸-8-酮 (26 g, 166 mmol)。使所得混合物温热至室温并搅拌3 h。将反应混合物倒入饱和NH₄Cl水溶液中并用EtOAc萃取。依次用水和盐水洗涤有机物，并经Na₂SO₄干燥。过滤并真空浓缩得到粗产物，将其通过快速色谱法 (硅胶，在PE中的0-30% EtOAc)纯化，得到标题化合物(18 g, 70%收率)。C₉H₁₄O₂的(ESI) m/z计算值：154.10。实测值:155.16 (M+1)⁺。

8,11-二氧杂二螺[3.2.4 ⁷ .2 ⁴ ]十三烷-2-酮的制备

在室温，向8-亚甲基-1,4-二氧杂螺[4.5]癸烷 (10 g, 64.8 mmol)和锌-铜 (12.7 g,194 mmol)在Et₂O (100 mL)中的悬浮液中滴加三氯乙酰氯 (8.66 mL, 77.8 mmol)。在室温搅拌1h后，加入MeOH (30 mL)，然后将混合物冷却至-5℃并在-5℃经1 h的时段分批加入锌粉(12.7 g, 194 mmol)。使反应混合物温热至室温，并加入硅藻土。将所得的稠物质经硅藻土垫过滤，并将滤饼用过量的乙酸乙酯洗涤。合并的溶液用盐水洗涤，并经Na₂SO₄干燥。过滤并真空浓缩得到粗产物，将其通过快速色谱法(硅胶，在PE中的0-30% EtOAc)纯化，得到标题化合物(4.4 g, 34%收率)。C₁₁H₁₆O₃的(ESI) m/z计算值：196.11。实测值: 197.18 (M+1)⁺。

N,N-二苄基-8,11-二氧杂二螺[3.2.4 ⁷ .2 ⁴ ]十三烷-2-胺的制备

在氮气气氛下，向8,11-二氧杂二螺[3.2.4⁷.2⁴]十三烷-2-酮 (1.4 g, 7.14 mmol)在MeOH (396 mL)中的溶液中加入二苄胺 (2.8 g, 14.3 mmol)，并将所得溶液在室温搅拌2h。然后分批加入NaBH₃CN (1.79 g, 28.5 mmol)，并将反应混合物在室温搅拌过夜。所得混合物用H₂O淬灭，用EtOAc萃取。合并的有机层依次用水和盐水洗涤，并经Na₂SO₄干燥。过滤并真空浓缩得到粗产物，将其通过快速色谱法 (硅胶，在PE中的0-30% EtOAc)纯化，得到标题化合物(2.4 g, 89%收率)。C₂₅H₃₁NO₂的(ESI) m/z计算值：377.24。实测值: 378.41 (M+1)⁺。

2-(二苄基氨基)螺[3.5]壬烷-7-酮的制备

向N,N-二苄基-8,11-二氧杂二螺[3.2.4⁷.2⁴]十三烷-2-胺 (1.05 g, 2.8 mmol)在丙酮 (10 mL)中的溶液中滴加12 N HCl (2 mL, 24 mmol)。 搅拌反应混合物2 h后， 加入水和EtOAc，并分离各层。依次用水和盐水洗涤有机物，并经Na₂SO₄干燥。过滤并真空浓缩，得到标题化合物(0.50 g, 91%收率)。C₂₃H₂₇NO的(ESI) m/z计算值：333.21。实测值: 334.37 (M+1)⁺。

三氟甲磺酸 2-(二苄基氨基)螺[3.5]壬-6-烯-7-基酯的制备

在-78℃，向N,N-二苄基-8,11-二氧杂二螺[3.2.4⁷.2⁴]十三烷-2-胺 (600 mg, 1.80mmol)和N-苯基双-(三氟甲磺酰胺) (964 mg, 2.70 mmol)在THF中的溶液中在30 min期间滴加LiHMDS (2.7 mL, 2.70 mmol)，并使反应混合物温热至室温，并搅拌过夜。将反应混合物用NH₄Cl水溶液淬灭并将所得混合物用EtOAc萃取。合并的有机层依次用水和盐水洗涤，并经Na₂SO₄干燥。过滤并真空浓缩得到粗产物，将其通过快速色谱法 (硅胶，在PE中的0-10%EtOAc) 纯化，得到标题化合物(728 mg, 87%收率)。C₂₄H₂₆F₃NO₃S的(ESI) m/z计算值：465.16。实测值: 466.24 (M+1)⁺。

N,N-二苄基-7-(喹啉-4-基)螺[3.5]壬-6-烯-2-胺的制备

在氮气气氛下，在100℃，将三氟甲磺酸 2-(二苄基氨基)螺[3.5]壬-6-烯-7-基酯(728 mg, 1.56 mmol)、喹啉-4-基硼酸 (386 mg, 2.35 mmol)、Pd(PPh₃)₄ (180 mg, 0.156mmol)、NaBr (177 mg, 1.72 mmol)在二噁烷 (10 mL)和水(2 mL)中的悬浮液搅拌14小时。在反应混合物冷却至室温后，将其在水和EtOAc之间分配并分离各层。依次用水和盐水洗涤有机物，并经Na₂SO₄干燥。过滤并真空浓缩得到粗产物，将其通过快速色谱法纯化，得到标题化合物(580 mg, 83%收率)。C₃₂H₃₂N₂的(ESI) m/z计算值：444.26。实测值: 445.33 (M+1)⁺。

7-(1,2,3,4-四氢喹啉-4-基)螺[3.5]壬烷-2-胺的制备

在室温，在H₂气氛(15 psi)下，将N,N-二苄基-7-(喹啉-4-基)螺[3.5]壬-6-烯-2-胺(580 mg, 1.30 mmol)和10% Pd/C (290 mg)在EtOAc (10 mL)中的悬浮液搅拌过夜。将所得混合物滤过硅藻土垫并将滤液在减压下浓缩，得到粗产物，将其通过快速色谱法 (硅胶，在PE中的0-50% EtOAc) 纯化，得到标题化合物(200 mg, 57%收率)，为棕色油。C₁₈H₂₆N₂的(ESI) m/z计算值：270.21。实测值: 271.39 (M+1)⁺。

4-氯-N-(7-(1,2,3,4-四氢喹啉-4-基)螺[3.5]壬烷-2-基)苯甲酰胺 (U26883- 059-1) 的制备

向7-(1,2,3,4-四氢喹啉-4-基)螺[3.5]壬烷-2-胺 (100 mg, 0.369 mmol)和4-氯苯甲酸 (86.8mg, 0.555 mmol)在DCM (2 mL)中的搅拌的溶液中加入DIPEA (143 mg, 1.107mmol)，然后加入HATU (211 mg, 0.555 mmol)。在室温搅拌2 h后，将反应混合物用盐水淬灭，并将所得混合物用DCM萃取(x3)。合并的有机层经Na₂SO₄干燥。在真空下除去溶剂，并将残余物通过柱色谱法在硅胶上纯化(在PE中的0～50% EA)得到标题化合物(43 mg, 29%收率)。C₂₅H₂₉ClN₂O的LCMS (ESI) m/z计算值：408.20。实测值: 409.43/411.41 (M/M+2)⁺。

4-氯-N-(7-(喹啉-4-基)螺[3.5]壬烷-2-基)苯甲酰胺的制备(实施例 3)

向4-氯-N-(7-(1,2,3,4-四氢喹啉-4-基)螺[3.5]壬烷-2-基)苯甲酰胺 (43 mg,0.105 mmol)在DME (2 mL)中的搅拌的溶液中加入2,3,5,6-四氯环己-2,5-二烯-1,4-二酮(21 mg, 0.084 mmol)，并将所得混合物在80℃通过微波搅拌1.5 h。在乙酸乙酯和水之间分配反应混合物。分离有机层并用Na₂CO₃和盐水洗涤，经Na₂SO₄干燥。在真空下除去溶剂，并将残余物通过制备型HPLC纯化。得到标题化合物(12 mg, 28%收率)。

；

C₂₅H₂₅ClN₂O的LCMS (ESI) m/z计算值：404.17。实测值: 405.38/407.35 (M/M+2)⁺。

实施例 4

5-氯-N-(7-(1,2,3,4-四氢喹啉-4-基)螺[3.5]壬烷-2-基)噻吩-2-甲酰胺的制备

向7-(1,2,3,4-四氢喹啉-4-基)螺[3.5]壬烷-2-胺 (25 mg, 0.094 mmol)和5-氯噻吩-2-甲酸 (15 mg, 0.094 mmol)在DCM (2 mL)中的搅拌的溶液中加入DIPEA (36 mg,0.28 mmol)，然后加入HATU (36 mg, 0.094 mmol)。在室温搅拌2 h后，将反应混合物用盐水淬灭，并将所得混合物用DCM萃取(x3)。合并的有机层经Na₂SO₄干燥。在真空下除去溶剂，并将残余物通过柱色谱法在硅胶上纯化(在PE中的0～50% EA)，得到标题化合物(23 mg,59%收率)。C₂₃H₂₇ClN₂OS的LCMS (ESI) m/z计算值：414.15。实测值: 415.36/417.32 (M/M+2)⁺。

5-氯-N-(7-(喹啉-4-基)螺[3.5]壬烷-2-基)噻吩-2-甲酰胺的制备(实施例 4)

向5-氯-N-(7-(1,2,3,4-四氢喹啉-4-基)螺[3.5]壬烷-2-基)噻吩-2-甲酰胺 (23 mg,0.055 mmol)在DME (2 mL)中的搅拌的溶液中加入2,3,5,6-四氯环己-2,5-二烯-1,4-二酮(11 mg, 0.044 mmol)，并将所得混合物在80℃通过微波搅拌1.5 h。在乙酸乙酯和水之间分配反应混合物。分离有机层并用Na₂CO₃和盐水洗涤，经Na₂SO₄干燥。在真空下除去溶剂，并将残余物通过制备型HPLC纯化。得到标题化合物(12 mg, 53%收率)。

；

C₂₃H₂₃ClN₂OS的LCMS (ESI) m/z计算值：410.12。实测值: 411.30/413.25 (M/M+2)⁺。

实施例 5

2-(8,11-二氧杂二螺[3.2.47.24]十三烷-2-亚基)乙酸乙酯的制备

在0℃，在氮气下，随着剧烈搅拌，向NaH (153 mg, 3.82 mmol, 在油中60%)在无水THF(3 mL)中的悬浮液中滴加膦酰基乙酸三乙酯(972 mg, 4.34 mmol)。在0℃搅拌30min后，滴加在THF (2 mL)中的8,11-二氧杂二螺[3.2.4⁷.2⁴]十三烷-2-酮 (550 mg, 2.55 mmol)。使所得混合物温热至室温并搅拌过夜。将反应混合物倒入饱和NH₄Cl水溶液中并用EtOAc萃取。依次用水和盐水洗涤有机物，并经Na₂SO₄干燥。过滤并真空浓缩得到粗产物，将其通过快速色谱法 (硅胶，在PE中的0-30% EtOAc) 纯化，得到标题化合物(600 mg, 88%收率)。C₁₅H₂₂O₄的LCMS (ESI) m/z计算值：266.15。实测值: 267.27 (M+1)⁺。

2-(8,11-二氧杂二螺[3.2.4 ⁷ .2 ⁴ ]十三烷-2-基)乙酸乙酯的制备

在室温，在H₂气氛(15 psi)下，将2-(8,11-二氧杂二螺[3.2.4⁷.2⁴]十三烷-2-亚基)乙酸乙酯(600 mg, 2.25 mmol)和10% Pd/C (300 mg)在EtOH (10 mL)中的混合物搅拌过夜。将所得混合物滤过硅藻土垫，并将滤液在减压下浓缩，得到标题化合物(0.59 g, 86%收率), 将其不经纯化用于下一步中。C₁₅H₂₄O₄的LCMS (ESI) m/z计算值：268.17。实测值:269.43 (M+1)⁺。

2-(7-氧代螺[3.5]壬烷-2-基)乙酸乙酯的制备

向2-(8,11-二氧杂二螺[3.2.4⁷.2⁴]十三烷-2-基)乙酸乙酯 (0.59 g, 2.20 mmol)在丙酮 (10 mL)中的溶液中滴加1 N HCl (11 mL, 11.0 mmol)。将反应混合物在室温搅拌过夜后，加入水和EtOAc，并分离各层。依次用水和盐水洗涤有机物，并经Na₂SO₄干燥。过滤并真空浓缩得到粗产物，将其通过快速色谱法 (硅胶，在PE中的0-30% EtOAc) 纯化，得到标题化合物(468 mg, 95%收率)。C₁₃H₂₀O₃的LCMS (ESI) m/z计算值：224.14。实测值: 225.28 (M+1)⁺。

2-(7-(((三氟甲基)磺酰基)氧基)螺[3.5]壬-6-烯-2-基)乙酸乙酯的制备

在-78℃，向N,N-二苄基-8,11-二氧杂二螺[3.2.4⁷.2⁴]十三烷-2-胺 (340 mg, 1.52mmol)和N-苯基双-(三氟甲磺酰胺) (704 mg, 1.97 mmol)在THF (8 mL)中的溶液中在30min期间滴加LiHMDS (1.97 mL, 1.97 mmol)，并使反应混合物温热至室温，并搅拌过夜。将反应混合物用NH₄Cl水溶液淬灭并将所得混合物用EtOAc萃取。合并的有机层依次用水和盐水洗涤，并经Na₂SO₄干燥。过滤并真空浓缩得到粗产物，将其通过快速色谱法 (硅胶，在PE中的0-10% EtOAc) 纯化，得到标题化合物(220 mg, 41%收率)。C₁₄H₁₉F₃O₅S的LCMS (ESI) m/z计算值：356.09。实测值: 357.40 (M+1)⁺。

2-(7-(喹啉-4-基)螺[3.5]壬-6-烯-2-基)乙酸乙酯的制备

在氮气气氛下，在100℃，将2-(7-(((三氟甲基)磺酰基)氧基)螺[3.5]壬-6-烯-2-基)乙酸乙酯 (220 mg, 0.62 mmol)、喹啉-4-基硼酸 (115 mg, 0.70 mmol)、Pd(PPh₃)₄ (54mg, 0.047 mmol)、NaBr (69 mg, 0.67 mmol)和Na₂CO₃ (148 mg, 1.40 mmol)在二噁烷(4.0 mL)和水(1.0 mL)中的悬浮液搅拌14小时。在反应混合物冷却至室温后，将其在水和EtOAc之间分配并分离各层。依次用水和盐水洗涤有机物，并经Na₂SO₄干燥。过滤并真空浓缩得到粗产物，将其通过快速色谱法纯化，得到标题化合物(71 mg, 34%收率)。C₂₂H₂₅NO₂的LCMS (ESI) m/z计算值：335.19。实测值: 336.35 (M+1)⁺。

2-(7-(喹啉-4-基)螺[3.5]壬烷-2-基)乙酸乙酯的制备

在室温，在H₂气氛(15 psi)下，将2-(7-(喹啉-4-基)螺[3.5]壬-6-烯-2-基)乙酸乙酯(71 mg, 0.21 mmol)和10% Pd/C (40 mg)在EtOH (3.0 mL)中的混合物搅拌过夜。将所得混合物滤过硅藻土垫并将滤液在减压下浓缩，得到粗产物，将其通过快速色谱法 (硅胶，在PE中的0-50% EtOAc) 纯化，得到标题化合物(63 mg, 89%收率)，为棕色油。C₂₂H₂₇NO₂的LCMS(ESI) m/z计算值：337.20。实测值: 338.27 (M+1)⁺。

2-(7-(喹啉-4-基)螺[3.5]壬烷-2-基)乙酸的制备

向2-(7-(喹啉-4-基)螺[3.5]壬烷-2-基)乙酸乙酯 (63 mg, 0.19 mmol)在MeOH (2mL)中的溶液中加入1N NaOH水溶液(0.5 mL)。在室温搅拌2h后，所得混合物用1N HCl中和，并用EtOAc萃取。有机层用盐水洗涤，经Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩得到标题化合物(41 mg,70%收率)，为灰白色固体，将其不经进一步纯化即用于下一步骤。C₂₀H₂₃NO₂的LCMS (ESI) m/z计算值：309.17。实测值: 310.20 (M+1)⁺。

N-(4-氯苯基)-2-(7-(喹啉-4-基)螺[3.5]壬烷-2-基)乙酰胺的制备(实施例 5)

向2-(7-(喹啉-4-基)螺[3.5]壬烷-2-基)乙酸 (45 mg, 0.145 mmol)和4-氯苯胺(18.5 mg, 0.145 mmol)在DCM (2 mL)中的搅拌的溶液中加入DIPEA (75 uL, 0.435mmol)，然后加入HATU (55 mg, 0.145 mmol)。在室温搅拌过夜后，将反应混合物用盐水淬灭，并将所得混合物用DCM萃取(x3)。合并的有机层经Na₂SO₄干燥。在真空下除去溶剂，并将残余物通过制备型HPLC纯化，得到标题化合物(20 mg, 33%收率)。

；

C₂₆H₂₇ClN₂O的LCMS (ESI) m/z计算值：418.18。实测值: 419.32/421.27 (M/M+2)⁺。

实施例 6

8,11-二氧杂二螺[3.2.4 ⁷ .2 ⁴ ]十三烷-2-醇的制备

向8, 11-二氧杂二螺[3.2.4⁷.2⁴]十三烷-2-酮 (4 g, 20.4 mmol)在MeOH (100 mL)中的溶液中分批加入NaBH₄ (1.54 g, 40.8 mmol)。在室温搅拌30 min后，在乙酸乙酯和NH₄Cl水溶液之间分配混合物。分离各层，用盐水洗涤有机层并经Na₂SO₄干燥。过滤并真空浓缩得到粗产物，将其通过快速色谱法 (硅胶，在PE中的0-30% EtOAc) 纯化，得到标题化合物(3.6 g, 34%收率)。C₁₁H₁₈O₃的LCMS (ESI) m/z计算值：198.13。实测值: 199.21(M+1)⁺。

甲磺酸 8,11-二氧杂二螺[3.2.4 ⁷ .2 ⁴ ]十三烷-2-基酯的制备

在0℃，向8,11-二氧杂二螺[3.2.4⁷.2⁴]十三烷-2-醇 (3.6 g, 18.2 mmol)和TEA(7.6 mL, 54.5 mmol)在DCM (40 mL)中的溶液中滴加MsCl (2.8 mL, 36.4 mmol)。在室温搅拌1小时后，在DCM和水之间分配反应混合物。分离各层，且有机层用盐水洗涤，经Na₂SO₄干燥，在真空中浓缩得到粗产物，该粗产物不经纯化即可用于后续步骤中(4.0 g, 80%收率)。C₁₂H₂₀O₅S的LCMS (ESI) m/z计算值：276.10。实测值: 277.36 (M+1)⁺。

8,11-二氧杂二螺[3.2.4 ⁷ .2 ⁴ ]十三烷-2-甲腈的制备

将甲磺酸 8,11-二氧杂二螺[3.2.4⁷.2⁴]十三烷-2-基酯 (1.56 g, 5.64 mmol)、KCN(551 mg, 8.46 mmol)、18-C-6 (1.49 g, 5.64 mmol)和NaI (845 mg, 5.64 mmol)在DMSO(15 mL)中的悬浮液在130℃搅拌2小时。冷却至室温后，在乙酸乙酯和水之间分配反应混合物。分离各层，有机层用盐水洗涤，经Na₂SO₄干燥，在真空中浓缩得到粗产物，将其通过快速色谱法 (硅胶，在PE中的0-30% EtOAc) 纯化，得到标题化合物(500 mg, 43%收率)。C₁₂H₁₇NO₂的LCMS (ESI) m/z计算值：207.13。实测值: 208.32(M+1)⁺。

7-氧代螺[3.5]壬烷-2-甲酸的制备

向8,11-二氧杂二螺[3.2.4⁷.2⁴]十三烷-2-甲腈 (500 mg, 2.41 mmol)在EtOH (2.4mL)中的溶液中加入1N LiOH (2.4 mL, 2.41 mmol)，并将混合物在90℃搅拌2小时。冷却至室温后，用1N HCl将反应混合物酸化至pH 3-4，并在乙酸乙酯和水之间分配。分离各层，有机层用盐水洗涤，经Na₂SO₄干燥，在真空中浓缩。将所得粗产物溶解于THF（5mL）中，并用2NHCl水溶液(4 mL)处理。在室温搅拌4小时后，将反应混合物浓缩并将粗产物通过快速色谱法 (硅胶，在PE中的0-50% EtOAc) 纯化得到标题化合物(360 mg, 69%收率)。C₁₀H₁₄O₃的LCMS (ESI) m/z计算值：182.09。实测值: 183.30(M+1)⁺。

7-氧代螺[3.5]壬烷-2-甲酸甲酯的制备

向7-氧代螺[3.5]壬烷-2-甲酸 (380 mg, 2.08 mmol)、K₂CO₃ (862 mg, 6.24 mmol)在丙酮 (4 mL)中的悬浮液中加入碘甲烷(1.48 g, 10.4 mmol)。在室温搅拌过夜后，将反应混合物滤过硅藻土，并在减压下浓缩滤液，得到粗产物，将其通过柱色谱法(硅胶，在PE中的0-30% EtOAc)纯化，得到标题化合物(360 mg, 88%收率)。C₁₁H₁₆O₃的LCMS (ESI) m/z计算值：196.11。实测值: 197.28(M+1)⁺。

7-(((三氟甲基)磺酰基)氧基)螺[3.5]壬-6-烯-2-甲酸甲酯的制备

在-78℃，向7-氧代螺[3.5]壬烷-2-甲酸甲酯 (234 mg, 1.19 mmol)和N-苯基双-(三氟甲磺酰胺) (639 mg, 1.79 mmol)在THF中的溶液经30 min滴加1M LiHMDS (1.79 mL,1.79 mmol)。使混合物温热至室温并搅拌过夜。将反应混合物用NH₄Cl水溶液淬灭并将所得混合物用EtOAc萃取。合并的有机层依次用水和盐水洗涤，并经Na₂SO₄干燥。过滤并真空浓缩得到粗产物，将其通过快速色谱法 (硅胶，在PE中的0-10% EtOAc) 纯化，得到标题化合物(340 mg, 87%收率)。C₁₂H₁₅F₃O₅S的LCMS (ESI) m/z计算值：328.06。实测值: 329.27(M+1)⁺。

7-(6-氟喹啉-4-基)螺[3.5]壬-6-烯-2-甲酸甲酯的制备

在100℃，在氮气气氛下，将7-(((三氟甲基)磺酰基)氧基)螺[3.5]壬-6-烯-2-甲酸甲酯 (340 mg, 1.03 mmol)、(6-氟喹啉-4-基)硼酸 (339 mg, 1.24 mmol)、Pd(PPh₃)₄ (239mg, 0.21 mmol)、KBr (112 mg, 1.03 mmol)在二噁烷 (4 mL)和水(1 mL)中的悬浮液搅拌14小时。冷却至室温后，在水和EtOAc之间分配反应混合物并分离各层。分离各层，并将有机层用盐水洗涤，经Na₂SO₄干燥，在真空中浓缩得到粗产物，将其通过快速色谱法纯化，得到标题化合物(68 mg, 20%收率)。C₂₀H₂₀FNO₂的LCMS (ESI) m/z计算值：325.15。实测值: 326.37(M+1)⁺。

7-(6-氟喹啉-4-基)螺[3.5]壬烷-2-甲酸甲酯的制备

在室温，在H₂气氛(15 psi)下，将7-(6-氟喹啉-4-基)螺[3.5]壬-6-烯-2-甲酸甲酯(68 mg, 0.207 mmol)和10% Pd/C (34 mg)在MeOH (2 mL)中的悬浮液搅拌30 min。将所得混合物滤过硅藻土垫，并将滤液在减压下浓缩得到粗产物，将其通过快速色谱法 (硅胶，在PE中的0-50% EtOAc) 纯化，得到标题化合物(40 mg, 59%收率)，为无色油。C₂₀H₂₂FNO₂的LCMS (ESI) m/z计算值：327.16。实测值: 328.34 (M+1)⁺。

7-(6-氟喹啉-4-基)螺[3.5]壬烷-2-甲酸的制备

向7-(6-氟喹啉-4-基)螺[3.5]壬烷-2-甲酸酯 (40 mg, 0.122 mmol)在MeOH (1mL)中的溶液中加入1N LiOH水溶液(0.3 mL)。在室温搅拌过夜后，所得混合物用1N HCl中和至pH6～7，并用EtOAc萃取。有机层用盐水洗涤，经Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩得到标题化合物(20mg, 52%收率)，为灰白色固体，将其不经进一步纯化即用于下一步骤。C₁₉H₂₀FNO₂的LCMS(ESI) m/z计算值：313.15。实测值: 314.23 (M+1)⁺。

N-(4-氯苯基)-7-(6-氟喹啉-4-基)螺[3.5]壬烷-2-甲酰胺的制备 (实施例 6)

向7-(6-氟喹啉-4-基)螺[3.5]壬烷-2-甲酸 (16 mg, 0.051 mmol)和4-氯苯胺 (7.8mg, 0.061 mmol)在DCM (1 mL)中的搅拌的溶液中加入DIPEA (19 uL, 0.153 mmol)，然后加入HATU (29 mg, 0.076 mmol)。在室温搅拌过夜后，将反应混合物用盐水淬灭，并将所得混合物用DCM萃取(x3)。合并的有机层经Na₂SO₄干燥。在真空下除去溶剂，并将残余物通过制备型HPLC纯化。得到标题化合物(3 mg, 14%收率)。

；

C₂₅H₂₄ClFN₂O的LCMS (ESI) m/z计算值：422.16。实测值: 423.40/425.37 (M/M+2)⁺。

IDO1 PBMC 快速火焰质谱（RapidFire MS）测定

经由高通量细胞测定，利用经由质谱和细胞毒性作为终点检测犬尿氨酸对本发明的化合物进行测试。对于质谱和细胞毒性测定，用人干扰素-γ(IFN-γ) (Sigma-AldrichCorporation, St. Louis, MO)和来自明尼苏达沙门菌（Salmonella minnesota）的脂多糖(LPS)(Invivogen, San Diego, CA)刺激人外周血单核细胞(PBMC) (PB003F; AllCells^®,Alameda, CA)以诱导吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO1)的表达。具有IDO1抑制特性的化合物减少了细胞经由色氨酸分解代谢途径产生的犬尿氨酸的量。使用CellTiter-Glo^®试剂(CTG)(Promega Corporation, Madison, WI)(其基于ATP的发光检测，ATP是代谢活性细胞的指示剂)测量了由于化合物治疗的作用而产生的细胞毒性。

在测定准备中，将测试化合物在DMSO中从1mM 或5 mM的典型最高浓度连续稀释3倍，并以0.5 μL铺板在384-孔聚苯乙烯透明底部组织培养处理的带盖板(Greiner Bio-One, Kremsmünster, Austria)中以生成11-点剂量响应曲线。低对照孔(0％犬尿氨酸或100％细胞毒性)在存在未刺激的(-IFN- γ /-LPS)PBMC的情况下含有0.5 μL DMSO(用于质谱测定)或者在没有细胞的情况下含有0.5 μL DMSO(用于细胞毒性测定)，并且高对照孔(100％犬尿氨酸或0％细胞毒性)在存在被刺激的(+IFN- γ /+LPS)PBMC的情况下含有0.5μL DMSO(既用于质谱也用于细胞毒性测定)。

洗涤PBMC的冷冻原液，并回收于补充有10% v/v热灭活的胎牛血清(FBS) (ThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA)和1X青霉素-链霉素抗生素溶液(ThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA)的RPMI 1640培养基(Thermo FisherScientific, Inc., Waltham, MA)中。在补充的RPMI 1640培养基中将细胞稀释至1,000,000个细胞/ mL。将50μL的细胞悬浮液(用于质谱测定)或单独的培养基(用于细胞毒性测定)添加到先前制备的384-孔化合物板上的低对照孔中，分别产生50,000个细胞/孔或0个细胞/孔。将IFN- γ和LPS分别以100 ng/ml和50 ng/ml的终浓度添加到剩余的细胞悬浮液中，并且将50μL的被刺激的细胞添加到384-孔化合物板上的所有剩余的孔中。然后将带盖板在37℃、5% CO₂的加湿培养箱中放置2天。

温育后，将384-孔板从培养箱中移出并使其平衡至室温30分钟。对于细胞毒性测定，根据制造商的说明制备CellTiter-Glo^®，并向每个板孔中添加40 μL。在室温温育二十分钟后，在EnVision^® Multilabel Reader (PerkinElmer Inc., Waltham, MA)上读取发光。对于质谱测定，在384-孔聚丙烯V形底板(Greiner Bio-One, Kremsmünster, Austria)中，将来自化合物处理的板的每个孔的10μL上清液添加到40μL乙腈(含有10μM用于归一化的内标)中，以萃取有机分析物。在2000 rpm离心10分钟后，将来自乙腈萃取板的每个孔的10μL添加到384-孔聚丙烯V形底板中的90μL无菌蒸馏H2O中，用于在RapidFire 300(Agilent Technologies, Santa Clara, CA)和4000 QTRAP MS (SCIEX, Framingham,MA)上分析犬尿氨酸和内标。使用Agilent Technologies的RapidFire Integrator 软件对MS数据进行积分，并将数据作为犬尿氨酸与内标的比进行归一化，用于分析。

在使用公式100-(100*((U-C2)/(C1-C2)))(其中U是未知值，C1是高(100％犬尿氨酸； 0％抑制)对照孔的平均值并且C2是低(0％犬尿氨酸； 100％抑制)对照孔的平均值)归一化后，将质谱测定中的剂量响应的数据标绘为IDO1抑制百分比（% IDO1 inhibition）对化合物浓度。在使用公式100-(100*((U-C2)/(C1-C2)))(其中U是未知值，C1是高(0％细胞毒性)对照孔的平均值并且C2是低(100％细胞毒性)对照孔的平均值)归一化后，将细胞毒性测定中的剂量响应的数据标绘为细胞毒性百分比（% cytotoxicity）对化合物浓度。

用方程y=A+((B-A)/(1+(10x/10C)D)) (其中A是最小响应，B是最大响应，C是log(XC50)并且D是Hill斜率)进行曲线拟合。将每种测试化合物的结果记录为质谱测定的pIC50值和细胞毒性测定的pCC50值(上面的方程中的-C)。

大鼠PK

Claims (14)

1.式I化合物

或其药学上可接受的盐，其中：

每个n独立地是2、1或0（即不存在）；

Q¹是-C(O)NH-、NHC(O)-或5-9元杂环，其中所述杂环含有1-3 个选自O、S和N的杂原子，并且其中所述杂环可以任选被1-4个选自下述的取代基取代：卤素、OH、C_1-3烷基、OC_1-3烷基、C_1-3氟代烷基、CN和NH₂；

Ar¹ 是C_5-9芳基或5-9 元杂芳基，其中芳基和杂芳基包括双环并且杂芳基含有1-3 个选自O、S和N的杂原子，并且其中Ar¹ 可以任选被1-4个选自下述的取代基取代：卤素、OH、C_1-3烷基、OC_1-3烷基、C_1-3氟代烷基、CN和NH₂； 和

Ar²是C_5-9芳基或5-9 元杂芳基，其中杂芳基含有1-3 个选自O、S和N的杂原子，并且其中Ar¹ 可以任选被1-4个选自下述的取代基取代：卤素、OH、C_1-3烷基、OC_1-3烷基、C_1-3氟代烷基、CN和NH₂。

2.根据权利要求1的化合物或盐，其中Ar¹ 是喹啉、异喹啉、喹唑啉、喹喔啉、吲哚、氮杂吲哚、苯并二唑、苯基、吡啶基、二唑或嘧啶，并且其中Ar¹ 可以任选被选自下述的取代基取代：卤素、OH、C_1-3烷基、OC_1-3烷基、C_1-3氟代烷基、CN和NH₂。

3.根据权利要求1的化合物或盐，其中Ar¹ 是喹啉、异喹啉或吲哚，并且可以任选被选自下述的取代基取代：卤素、OH、C_1-3烷基、OC_1-3烷基、C_1-3氟代烷基、CN和NH₂。

4.根据权利要求1的化合物或盐，其中Ar¹ 是任选被卤素取代的喹啉。

5.根据权利要求1-4中任一项的化合物或盐，其中Ar² 是苯基或噻吩，任选被卤素取代。

6.药物组合物，其包含根据权利要求1-5中任一项的化合物或盐。

7.治疗将从IDO1的抑制中受益的疾病或病况的方法，包括施用根据权利要求6的组合物的步骤。

8.权利要求7的方法，其中在所述疾病或病况中，IDO活性的生物标志物升高。

9.权利要求8的方法，其中所述生物标志物是血浆犬尿氨酸或血浆犬尿氨酸/色氨酸比。

10.权利要求7的方法，其中所述疾病或病况是慢性病毒感染；慢性细菌感染；癌症；败血症；或神经障碍。

11.权利要求10的方法，其中所述慢性病毒感染是涉及HIV、HBV或HCV的那些；所述慢性细菌感染是结核病或人工关节感染；并且所述神经障碍是重度抑郁症、亨廷顿氏病或帕金森氏病。

12.权利要求11的方法，其中所述疾病或病况是与HIV感染有关的炎症；涉及乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒的慢性病毒感染；癌症；或败血症。

13.根据权利要求1-5中任一项的化合物或盐，其用于治疗将从IDO1的抑制中受益的疾病或病况。

14.根据权利要求1-5中任一项的化合物或盐在制造用于治疗将从IDO1的抑制中受益的疾病或病况的药物中的用途。

Images