CN111249296B - 一种抗真菌的药物组合物及互动抗真菌活性测定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于抗真菌治疗技术领域，公开了一种抗真菌的药物组合物及互动抗真菌活性测定方法，抗真菌的药物组合物由抗真菌性的A药物以及协同性的B药物组成；真菌抑制浓度系数FICI＝(药物组合物中A药物的MIC/A药物单独使用时的MIC)+(药物组合物中B药物的MIC/B药物单独使用时的MIC)≤0.5。本发明能够有效减少药物雷帕霉素的最小抑菌浓度，能够显著提高雷帕霉素的抗真菌效果，从而减少抗真菌治疗过程中雷帕霉素的用量，进而减少其毒副作用，有效控制免疫抑制继发的真菌感染，能够扩大现有抗真菌药物储备池，并为器官移植术后等服用免疫抑制剂患者伴继发性真菌感染提供新的用药依据。

Description

一种抗真菌的药物组合物及互动抗真菌活性测定方法
技术领域
本发明属于抗真菌治疗技术领域，尤其涉及一种抗真菌的药物组合物及互动抗真菌活性测定方法。
背景技术
目前，真菌感染包括发病率高但危害较轻的浅部真菌感染和发病率较低但危害严重的深部真菌感染。由于近些年抗生素的滥用，器官移植及介入治疗的广泛开展及肿瘤与免疫力低下患者的增多，机会性真菌感染的发病率不断上升，使真菌感染的治疗面临严峻的挑战。虽然不断有新的抗真菌药物问世，为抗真菌治疗提供了新的契机，但现有抗真菌药物具有毒副作用大、不良反应多等弊端，同时耐药报道也逐渐增加。因此需要发展新的抗真菌治疗方法，扩大现有的抗真菌药物储备池。
雷帕霉素，又称西罗莫司，是20世纪70年代发现并分离得到的大环内酯类次级代谢产物，最初用于治疗白色念珠菌引起的感染。随着使用的广泛，雷帕霉素被发现具有良好的免疫抑制作用，并被“美国食品与药品管理局(FDA)”批准用作“免疫抑制剂”上市。雷帕霉素在临床试验中显示出强大的免疫抑制作用，现多联合用药作为维持移植器官，特别是肾移植的免疫抑制的药物，而其抗真菌的应用随着新一代抗真菌药物的出现而逐渐被忽视。
伊维菌素同属于大环内脂类化合物，是控制寄生虫感染的最重要的人类和动物药物之一，其发现者曾因此获得了2015年诺贝尔生理学医学奖。伊维菌素最主要的作用是抗寄生虫感染，具有显著的抗盘尾丝虫引发的河盲症及淋巴丝虫引发的象皮肿的作用，也可以作用于班氏丝虫成虫、蛔虫、肠类圆线虫及疥虫等土壤传播寄生虫及体外寄生虫。伊维菌素不易通过血脑屏障，因而具有广泛的安全性。伊维菌素虽然与大环内脂类抗生素结构类似，但对大多数细菌缺乏活性，其抗真菌性能非常微弱，无法单独表现出抗真菌能力。
综上所述，现有技术存在的问题是：(1)现有技术中存在的抗真菌药物组合匮乏，近年来少有新的抗真菌药物及组合制剂问世，具有新型作用靶点的抗真菌药物几乎没有更新，导致了抗真菌药物储备不足的现状。
(2)现有抗真菌药物毒副作用较大，且毒副作用大多为剂量依赖性。现有抗真菌药物的毒副作用主要包括：局部反应，如刺激痛、灼烧痛、红肿、瘙痒及过敏反应；全身反应，如发热、消化道症状、神经症状、贫血等，极大地限制了传统抗真菌药物的使用。
(3)传统药物的持续使用导致真菌耐药现象严重。通常情况下，白色念珠菌对唑类耐药现象比较罕见(1.4％)。而近年来越来越多的证据表明真菌对一线抗真菌药物，如唑类与棘白菌素类耐药逐渐增多，部分真菌甚至出现了对杀菌性药物的耐药。
解决上述技术问题的难度：(1)新型抗真菌药物的研发。研发新型药物难度非常大，首先需明确新型药物的作用靶点及相关机制，这是非常复杂的；此外，新型药物研发后上市需经过体外实验、动物实验、人体实验等复杂的流程，结合商业价值及审批流程，其过程非常漫长。
(2)增大药物剂量。增大药物剂量可在一定程度上加强药物的作用效果，而此时药物剂量依赖的毒副作用也会随之增加，为治疗过程带来隐患。同时部分药物溶解性较差，无法通过增加药物剂量来产生更高的作用效果。
(3)开发协同性药物组合。开发协同性药物组合也存在一定的难度，包括药物的选择及作用效果的印证，但较之前两种方法具有明显的优势与可行性，首先药物组合通常为已上市的药物，其安全性具有保证，且研发技术已得到公开，具有更广泛的商业价值。同时，通过协同效果可产生“1+1＞2”的作用效果，进而高效的发挥抗真菌能力。因此，本专利旨在通过开发协同性药物组合以为现有抗真菌治疗提供指导。
解决上述技术问题的意义：通过解决上述技术问题，能够为每年数百万真菌感染患者的治疗提供潜在的治疗计划。通过开发新型药物组合，能够解决抗真菌药物效果差、真菌耐药严重的现状下抗真菌药物匮乏的问题；弥补当前抗真菌治疗过程中的不足，降低药物的毒副作用，最终为设计广谱、微量、高效、低毒、平价的新型药物组合提供思路和依据，缓解目前真菌感染频发且药物毒性大，耐药问题难以控制的严峻形势，为临床治疗浅部真菌感染，如义齿性口炎，及深部真菌感染，如念珠菌血症提供用药参考与建议，为真菌感染患者提供更多治愈的可能，改善其生活质量。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种抗真菌的药物组合物及互动抗真菌活性测定方法。本发明通过筛选发现免疫抑制剂雷帕霉素与抗虫药物伊维菌素具协同效果，并能够显著抑制最主要的致病性真菌白色念珠菌的生长，本发明中所用浓度均为完全抑制真菌生长的药物浓度，几乎能够彻底导致真菌的死亡，具有良好的抗真菌潜能。虽然二者均不属于抗真菌药物，但通过联合伊维菌素可显著降低雷帕霉素对白色念珠菌的最小抑菌浓度，从而达到显著的抑菌与杀菌效果，可进一步扩大现有抗真菌药物的储备池，为临床治疗真菌感染乃至耐药真菌感染提供新的契机。此外，在使用免疫抑制剂的患者由于免疫功能下降，出现继发性真菌感染的几率较高。因此移植患者伴真菌感染时可选择雷帕霉素作为主要免疫抑制剂，并可联合使用少量伊维菌素，从而发挥协同效果，能够有效控制免疫抑制并清除继发的真菌感染，充分体现了该药物组合的临床用药指导意义。
本发明是这样实现的，一种抗真菌的药物组合物，所述抗真菌的药物组合物由抗真菌性的A药物以及协同性的B药物组成；真菌抑制浓度系数FICI＝(药物组合物中A药物的MIC/A药物单独使用时的MIC)+(药物组合物中B药物的MIC/B药物单独使用时的MIC)≤0.5。
进一步，所述抗真菌性的A药物为雷帕霉素，所述协同性的B药物为伊维菌素；所述雷帕霉素、伊维菌素的质量比为(0.0005～0.004)：(0.5～64)。
进一步，所述雷帕霉素、伊维菌素的质量比为0.008:1或为0.001:1。
所述雷帕霉素、伊维菌素的质量比为0.0005:1或为0.00025:1。
所述雷帕霉素、伊维菌素的质量比为0.000125:1或为0.00003125:1。所述雷帕霉素、伊维菌素的质量比为0.00001562:1或为0.00000781:1。
进一步，所述抗真菌性的A药物为包括大环内脂类免疫抑制剂、大环内脂类免疫抑制剂类似物、大环内脂类免疫抑制剂衍生物、大环内脂类免疫抑制剂前药、大环内脂类免疫抑制剂代谢物和/或大环内脂类免疫抑制剂药物活性盐；
所述协同性的B药物包括倍大环内脂类抗寄生虫药、大环内脂类抗寄生虫药类似物、大环内脂类抗寄生虫药衍生物、大环内脂类抗寄生虫药前药、大环内脂类抗寄生虫药代谢物和/或大环内脂类抗寄生虫药物活性盐。
进一步，所述大环内脂类免疫抑制剂、大环内脂类抗寄生虫药的质量比为(0.0005～0.004)：(0.5～64)。
本发明的另一目的在于提供一种抗真菌的药物组合物的互动抗真菌活性测定方法包括：
(1)、将白色念珠菌Candida albicans SC5314在RPMI 1640培养基中，37℃，湿度为80％，5％CO2的条件下孵育；
(2)、将雷帕霉素和伊维菌素分别溶于DMSO中，至浓度分别为10mg/mL与20mg/mL，于冰箱中贮存待用；
(3)、测定最小抑菌浓度MIC；
(4)、测定最小杀菌浓度MBC。
进一步，步骤(3)具体包括：
(i)用液体培养基将贮存的10mg/mL的雷帕霉素和20mg/mL的伊维菌素溶液配制成雷帕霉素和伊维菌素药液；
(ii)将白色念珠菌细胞接种到96孔板中，每孔98μL，分别加入1μL雷帕霉素和伊维菌素药液，药液的组合方法如下：
第一个药物雷帕霉素在96孔板上按稀释浓度从上到下纵向排布每孔1μL，第二个药物伊维菌素按稀释浓度从左到右横向排布，每孔1μL，记录每一个孔的雷帕霉素与伊维菌素的浓度，同时设单独加入梯度稀释的雷帕霉素或伊维菌素药液每孔2μL的组，以及不加任何药物的空白对照组，做三个平行的96孔板，结果取平均值；
(iii)将96孔板于37℃孵育16～20小时后600nm测试OD值；
(iv)MIC值为能100％抑制真菌生长的最低药物浓度；各药物组合的孔通过与空白对照的OD值进行比较确定MIC值；
通过抑制浓度系数FICI判断抗真菌性的A药物以及协同性的B药物之间是协同、相加还是拮抗作用；
FICI＝(MIC药物组合中的A/MIC A单独)+(MIC药物组合中的B/MIC B单独)，如果FICI值≤0.5，抗真菌性的A药物以及协同性的B药物之间存在协同作用；若FICI值在0.5～4.0，抗真菌性的A药物以及协同性的B药物的活性无明显相互作用；若FICI值＞4.0，抗真菌性的A药物以及协同性的B药物存在拮抗作用；
步骤(4)进一步包括：
(a)采用棋盘法检测药物相互作用及MIC、计算FICI，药液的组合方法如下：
第一个药物雷帕霉素在96孔板上按稀释浓度从上到下纵向排布，每孔1μl，第二个药物伊维菌素按稀释浓度从左到右横向排布，每孔1μl，记录每一个孔的雷帕霉素和伊维菌素的浓度，同时设单独加入梯度稀释的雷帕霉素或伊维菌素药液每孔2μl的组，以及不加任何药物的空白对照组；
(b)将完成MIC检测的96孔板每孔100μl菌液吹打混匀至没有沉淀，形成均一的菌悬液；
(c)将吹匀后的96孔板每孔中吸取1μl菌液，分别移种至不含抗菌药的酵母膏胨葡萄糖琼脂平皿上，于37℃孵育24小时后分析菌落生长情况；
(d)大环内脂类免疫抑制剂抗真菌MBC值确定为能明显杀灭真菌，无真菌生长的最低药物浓度；各药物组合的孔通过与空白对照的菌落形态进行比较确定MBC值。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：该药物组合物包括抗真菌性的A药物以及协同性的B药物；其中，该药物组合物的真菌抑制浓度系数FICI＝(药物组合物中A药物的MIC/A药物单独使用时的MIC)+(药物组合物中B药物的MIC/B药物单独使用时的MIC)≤0.5，其中，A药物包括雷帕霉素，B药物包括伊维菌素。本发明能够有效减少药物雷帕霉素的最小抑菌浓度(MIC)，能够显著提高雷帕霉素的抗真菌效果，从而减少抗真菌治疗过程中雷帕霉素的用量，进而减少其毒副作用，有效控制免疫抑制继发的真菌感染，能够扩大现有抗真菌药物储备池，并为器官移植术后等服用免疫抑制剂患者伴继发性真菌感染提供新的用药依据。
附图说明
图1是本发明实施例提供的抗真菌的药物组合物的互动抗真菌活性测定方法流程图。
图2是本发明实施例提供的雷帕霉素和伊维菌素组合后的菌落生长情况示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
白色念珠菌Candida albicans SC5314购自美国标准生物品收藏中心(AmericanType Culture Collection)，保藏号为ATCC MYA-2876。
雷帕霉素购自MCE公司(产品目录号HY-10219)。
伊维菌素购自MCE公司。(产品目录号HY-15310)。
针对现有技术存在的抗真菌药物组合匮乏、抗真菌药物毒副作用大的问题，本发明提供了一种抗真菌的药物组合物，下面结合附图对本发明作详细的描述。
本发明实施例提供的抗真菌的药物组合物，由抗真菌性的A药物以及协同性的B药物组成；真菌抑制浓度系数FICI＝(药物组合物中A药物的MIC/A药物单独使用时的MIC)+(药物组合物中B药物的MIC/B药物单独使用时的MIC)≤0.5。
所述抗真菌性的A药物为雷帕霉素，所述协同性的B药物为伊维菌素；所述雷帕霉素、伊维菌素的质量比为(0.0005～0.004)：(0.5～64)。
如图1所示，本发明的另一目的在于提供一种抗真菌的药物组合物的互动抗真菌活性测定方法包括：
S101、将白色念珠菌Candida albicans SC5314在RPMI 1640培养基中，37℃，湿度为80％，5％CO2的条件下孵育。
S102、将雷帕霉素和伊维菌素分别溶于DMSO中，至浓度分别为10mg/mL与20mg/mL，于冰箱中贮存待用。
S103、测定最小抑菌浓度MIC。
S104、测定最小杀菌浓度MBC。
下面结合具体实施例对本发明作进一步描述。
实施例
一、雷帕霉素和伊维菌素的互动抗真菌活性测试
应用棋盘法对雷帕霉素和伊维菌素的互动抗真菌(白色念珠菌，Candidaalbicans SC5314)活性进行测试。
(1)、将白色念珠菌Candida albicans SC5314在RPMI 1640培养基中，37℃，湿度为80％，5％CO2的条件下孵育。
(2)、将雷帕霉素和伊维菌素分别溶于DMSO中，至浓度分别为10mg/mL与20mg/mL，于冰箱中贮存待用。
(3)、测定最小抑菌浓度(MIC)
(3.1)参照临床和实验室标准化协会(CLSI)M27-A3方案，即“酵母菌液体培养基稀释法抗真菌药物敏感试验方案”。用液体培养基(RPMI 1640培养基)将贮存的10mg/mL的雷帕霉素和20mg/mL的伊维菌素溶液配制成一系列稀释浓度的雷帕霉素和伊维菌素药液。
(3.2)将白色念珠菌细胞接种到96孔板中，每孔98μL(约1×104个细胞)，分别加入1μL雷帕霉素和伊维菌素药液，药液的组合方法如下：
第一个药物雷帕霉素在96孔板上按稀释浓度从上到下纵向排布(每一横排的雷帕霉素浓度相同)，每孔1μL，第二个药物伊维菌素按稀释浓度从左到右横向排布(每一纵排的伊维菌素浓度相同)，每孔1μL，记录每一个孔的雷帕霉素与伊维菌素的浓度，同时设单独加入梯度稀释的雷帕霉素或伊维菌素药液每孔2μL的组，以及不加任何药物的空白对照组，做三个平行的96孔板，结果取平均值。
(3.3)将96孔板于37℃孵育16～20小时后600nm测试OD值。
(3.4)MIC值定义为能100％抑制真菌生长的最低药物浓度。各药物组合的孔通过与空白对照的OD值进行比较来确定MIC值。
此处设如下定义：通过抑制浓度系数FICI来判断两个药物A和B之间是协同、相加还是拮抗作用。
其中，FICI＝(MIC药物组合中的A/MIC A单独)+(MIC药物组合中的B/MIC B单独)，如果FICI值≤0.5，则表明药物A和B之间存在协同作用，若FICI值在0.5～4.0之间，则表明药物A和B的活性无明显相互作用，若FICI值＞4.0，则表明药物A和B之间存在拮抗作用。
该方法为临床及实验室标准化协会(CLSI)公认有效方法，使用范围广而普遍，能够在短时间内快速实现对药物相互作用效果的检测，并可以通过对实验数据进一步分析得出可靠结论，结果稳定，可重复性高。
通过以上定义检测雷帕霉素和伊维菌素的相互作用，由于伊维菌素本身抗白色念珠菌活性较差，其(MIC药物组合中的伊维菌素/MIC伊维菌素)可忽略不计，结果如表1所示。
表1雷帕霉素和伊维菌素组合后的FICI
Figure BDA0002424898980000091
表1表明，雷帕霉素终浓度为0.004μg/mL、伊维菌素终浓度为0.5μg/mL；雷帕霉素终浓度为0.001μg/mL、伊维菌素终浓度为1μg/mL；雷帕霉素终浓度为0.001μg/mL、伊维菌素终浓度为2μg/mL；雷帕霉素终浓度为0.001μg/mL、伊维菌素终浓度为4μg/mL；雷帕霉素终浓度为0.001μg/mL、伊维菌素终浓度为8μg/mL；雷帕霉素终浓度为0.0005μg/mL、伊维菌素终浓度为16μg/mL；雷帕霉素终浓度为0.0005μg/mL、伊维菌素终浓度为32μg/mL；雷帕霉素终浓度为0.0005μg/mL、伊维菌素终浓度为64μg/mL，这八组药物组合中，雷帕霉素和伊维菌素存在协同抗真菌作用。其中随着伊维菌素终浓度升高，雷帕霉素和伊维菌素的协同抗真菌活性不断增强。常见抗真菌药物最小抑菌浓度见表2。
表2常见抗真菌药物最小抑菌浓度
Figure BDA0002424898980000101
(4)、测定最小杀菌浓度(MBC)。
(4.1)本发明采用棋盘法检测药物相互作用及MIC、计算FICI，药液的组合方法如下：
第一个药物雷帕霉素在96孔板上按稀释浓度从上到下纵向排布(每一横排的雷帕霉素浓度相同)，每孔1μl，第二个药物伊维菌素按稀释浓度从左到右横向排布(每一纵排的伊维菌素浓度相同)，每孔1μl，记录每一个孔的雷帕霉素和伊维菌素的浓度，同时设单独加入梯度稀释的雷帕霉素或伊维菌素药液每孔2μl的组，以及不加任何药物的空白对照组。
(4.2)将完成MIC检测的96孔板每孔100μl菌液吹打混匀至没有沉淀，形成均一的菌悬液。
(4.3)将吹匀后的96孔板每孔中吸取1μl菌液，分别移种至不含抗菌药的酵母膏胨葡萄糖(YPD)琼脂平皿上，于37℃孵育24小时后观测菌落生长情况。
(4.4)大环内脂类免疫抑制剂抗真菌MBC值定义为能明显杀灭真菌，无真菌生长的最低药物浓度。各药物组合的孔通过与空白对照的菌落形态进行比较来确定MBC值，通常情况下，最小杀菌浓度(MBC)会略高于最小抑菌浓度(MIC)。
图2雷帕霉素和伊维菌素组合后的菌落生长情况。图2表明，雷帕霉素MBC约0.064μg/mL，通常情况下MBC较MIC略高。当雷帕霉素终浓度为0.016μg/mL、伊维菌素终浓度为1μg/mL；雷帕霉素终浓度为0.016μg/mL、伊维菌素终浓度为2μg/mL；雷帕霉素终浓度为0.016μg/mL、伊维菌素终浓度为4μg/mL；雷帕霉素终浓度为0.008μg/mL、伊维菌素终浓度为8μg/mL；雷帕霉素终浓度为0.008μg/mL、伊维菌素终浓度为16μg/mL；雷帕霉素终浓度为0.004μg/mL、伊维菌素终浓度为32μg/mL；雷帕霉素终浓度为0.004μg/mL、伊维菌素终浓度为64μg/mL，这七组药物组合中，雷帕霉素和伊维菌素存在协同抗真菌作用，且几乎能够完全杀灭真菌。其中随着伊维菌素终浓度升高，雷帕霉素与伊维菌素的协同抗真菌活性不断增强。
本发明提供的FICI表格，可证明二者单独及协同的作用效果(表1)，较现有抗真菌药物的抑菌浓度(表2)，联合雷帕霉素与伊维菌素具有微量高效的显著优势，MBC测定结果(图2)可直观证明杀菌效果的逐渐增加。同时，FICI表格中有单独两个药物作用效果与联合应用效果的效果对比。现有文献可证明雷帕霉素早期可用于抗真菌治疗：[1]Sehgal SN,Baker H,Vezina C.Rapamycin(AY-22,989),a new antifungalantibiotic.II.Fermentation,isolation and characterization[J].The Journal ofantibiotics.1975,28(10):727-32.
[2]Baker H,Sidorowicz A,Sehgal SN,Vezina C.Rapamycin(AY-22,989),a newantifungal antibiotic.III.In vitro and in vivo evaluation[J].The Journal ofantibiotics.1978,31(6):539-45.
[3]Singh K,Sun S,Vezina C.Rapamycin(AY-22,989),a new antifungalantibiotic.IV.Mechanism of action[J].The Journal of antibiotics.1979,32(6):630-45.
以下文献可证明伊维菌素本身并不具备抗真菌能力：[1]Bruce A.Halley,Theodore A.Jacob,Anthony Y.H.Lu.The environmental impact of the use ofivermectin:environmental effects and fate.Chemosphere,Volume 18,Issues 7–8,1989,Pages 1543-1563,ISSN 0045-6535,
[2]Kollmann,A.,Touton,I.,Brault,A.et al.Effect of the endectocideivermectin on filamentous fungi.Environ Chem Lett(2003)1:215.
[3].Gronvold J,Svendsen TS,Kraglund HO,Bresciani J,Monrad J.Effect ofthe antiparasitic drugs fenbendazole and ivermectin on the soil nematodePristionchus maupasi[J].Veterinary parasitology.2004,124(1-2):91-9.
以上文献均可证实该本发明中两种药物单独作用效果情况真实性。
二、大环内脂类免疫抑制剂与大环内脂类抗寄生虫药的互动抗真菌
雷帕霉素可使用大环内脂类免疫抑制剂或其类似物、衍生物、前药、代谢物和药物活性盐替代。伊维菌素可使用大环内脂类抗寄生虫药及其类似物(如：莫西菌素)、衍生物、前药、代谢物和药物活性盐替代。
大环内脂类免疫抑制剂与大环内脂类抗寄生虫药之间更具体组分的选择根据所需要抑制的真菌类型进行选择和确定，本发明药物组合物所能抑制的真菌来源广泛，对药物组合物对真菌的最佳抑制效果还可通过上述实施方法确定两者之间的最佳混合比例来获得。
上述大环内脂类免疫抑制剂与大环内脂类抗寄生虫药两种药物均购自MCE公司。
本发明主要针对浅部真菌感染与深部真菌感染最常见的主要致病菌进行分析，白色念珠菌是致病性真菌的模式菌株，为所有致病菌的代表病原菌。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种抗真菌的药物组合物，其特征在于，所述抗真菌的药物组合物由抗真菌性的A药物以及协同性的B药物组成；真菌抑制浓度系数FICI＝(药物组合物中A药物的MIC/A药物单独使用时的MIC)+(药物组合物中B药物的MIC/B药物单独使用时的MIC)≤0.5；
所述抗真菌性的A药物为雷帕霉素，所述协同性的B药物为伊维菌素；所述雷帕霉素、伊维菌素的质量比为(0.0005～0.004)：(0.5～64)。
2.如权利要求1所述的抗真菌的药物组合物，其特征在于，所述雷帕霉素、伊维菌素的质量比为0.008:1或为0.001:1。
3.如权利要求1所述的抗真菌的药物组合物，其特征在于，所述雷帕霉素、伊维菌素的质量比为0.0005:1或为0.00025:1。
4.如权利要求1所述的抗真菌的药物组合物，其特征在于，所述雷帕霉素、伊维菌素的质量比为0.000125:1或为0.00003125:1。
5.如权利要求1所述的抗真菌的药物组合物，其特征在于，所述雷帕霉素、伊维菌素的质量比为0.00001562:1或为0.00000781:1。
6.一种如权利要求1～5任意一项所述抗真菌的药物组合物的互动抗真菌活性测定方法，其特征在于，所述抗真菌的药物组合物的互动抗真菌活性测定方法包括：
(1)、将白色念珠菌Candida albicans SC5314在RPMI 1640培养基中，37℃，湿度为80％，5％CO2的条件下孵育；
(2)、将雷帕霉素和伊维菌素分别溶于DMSO中，至浓度分别为10mg/mL与20mg/mL，于冰箱中贮存待用；
(3)、测定最小抑菌浓度MIC；
(4)、测定最小杀菌浓度MBC。
7.如权利要求6所述抗真菌的药物组合物的互动抗真菌活性测定方法，其特征在于，步骤(3)具体包括：
(i)用液体培养基将贮存的10mg/mL的雷帕霉素和20mg/mL的伊维菌素溶液配制成雷帕霉素和伊维菌素药液；
(ii)将白色念珠菌细胞接种到96孔板中，每孔98μL，分别加入1μL雷帕霉素和伊维菌素药液，药液的组合方法如下：
第一个药物雷帕霉素在96孔板上按稀释浓度从上到下纵向排布每孔1μL，第二个药物伊维菌素按稀释浓度从左到右横向排布，每孔1μL，记录每一个孔的雷帕霉素与伊维菌素的浓度，同时设单独加入梯度稀释的雷帕霉素或伊维菌素药液每孔2μL的组，以及不加任何药物的空白对照组，做三个平行的96孔板，结果取平均值；
(iii)将96孔板于37℃孵育16～20小时后600nm测试OD值；
(iv)MIC值为能100％抑制真菌生长的最低药物浓度；各药物组合的孔通过与空白对照的OD值进行比较确定MIC值；
通过抑制浓度系数FICI判断抗真菌性的A药物以及协同性的B药物之间是协同、相加还是拮抗作用；
FICI＝(MIC药物组合中的A/MIC A单独)+(MIC药物组合中的B/MIC B单独)，如果FICI值≤0.5，抗真菌性的A药物以及协同性的B药物之间存在协同作用；若FICI值在0.5～4.0，抗真菌性的A药物以及协同性的B药物的活性无明显相互作用；若FICI值＞4.0，抗真菌性的A药物以及协同性的B药物存在拮抗作用；
步骤(4)进一步包括：
(a)采用棋盘法检测药物相互作用及MIC、计算FICI，药液的组合方法如下：
第一个药物雷帕霉素在96孔板上按稀释浓度从上到下纵向排布，每孔1μl，第二个药物伊维菌素按稀释浓度从左到右横向排布，每孔1μl，记录每一个孔的雷帕霉素和伊维菌素的浓度，同时设单独加入梯度稀释的雷帕霉素或伊维菌素药液每孔2μl的组，以及不加任何药物的空白对照组；
(b)将完成MIC检测的96孔板每孔100μl菌液吹打混匀至没有沉淀，形成均一的菌悬液；
(c)将吹匀后的96孔板每孔中吸取1μl菌液，分别移种至不含抗菌药的酵母膏胨葡萄糖琼脂平皿上，于37℃孵育24小时后分析菌落生长情况；
(d)大环内脂类免疫抑制剂抗真菌MBC值确定为能明显杀灭真菌，无真菌生长的最低药物浓度；各药物组合的孔通过与空白对照的菌落形态进行比较确定MBC值。
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