CN111234143A - pH响应性的嵌段共聚物和纳米粒子、制备方法和药物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种pH响应性的嵌段共聚物和纳米粒子、制备方法和药物，涉及药物载体技术领域。该pH响应性的嵌段共聚物由PEO、MAEBA和DMAEMA聚合而成，能够在水溶液中通过自组装形成pH响应性纳米粒子，其中疏水的MAEBA和pH响应单元DMAEMA形成胶束核心层，亲水性PEO形成胶束外壳，并在pH较低的环境中发生构象的改变使纳米粒子pH敏感。使用上述pH响应性的嵌段共聚物或pH响应性的纳米粒子作为载体搭载药物时，使该药物在pH环境改变时释放其中的药物活性成分，以使该药物具有靶向性。

Description

pH响应性的嵌段共聚物和纳米粒子、制备方法和药物
技术领域
本发明涉及药物载体技术领域，尤其是涉及一种pH响应性的嵌段共聚物和纳米粒子、制备方法和药物。
背景技术
当前，纳米材料被广泛用于药物传输、磁共振造影、生物分离、荧光成像以及光热治疗等生物医学领域。由于纳米载体具有独特的纳米效应而成为药物或基因的靶向输送工具。纳米载体目前主要有脂质体、纳米胶束、聚合物、枝晶、磁性纳米粒子及碳纳米管等类型的载体。但是目前纳米药物载体仍然具有一些缺陷，比如药物的过早释放会产生毒副作用，非靶向释药会降低病灶部位的治疗效果，精准释药是提高纳米载体治疗效果的有效途径。因此，一种改进的能够精准释药的纳米载体是目前需要的。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种pH响应性的嵌段共聚物，该嵌段共聚物具有pH响应性，能够根据环境中pH的变化改变构象，以达到靶向释药的作用。
本发明的第二目的在于提供上述pH响应性的嵌段共聚物的制备方法。
本发明的第三目的在于提供一种pH响应性纳米粒子，该pH响应性纳米粒子主要由上述pH响应性的嵌段共聚物组装而成。
本发明的第四目的在于提供一种药物，该药物包括上述pH响应性的嵌段共聚物或上述pH响应性纳米粒子。
本发明的第五目的在于提供上述药物的制备方法。
为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种pH响应性的嵌段共聚物，其特征在于，结构式如(Ⅰ)所示：
Figure BDA0002407489000000021
其中m为20～100的正整数，n为20～100的正整数。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了上述pH响应性的嵌段共聚物的制备方法，包括：合成含有链转移剂的RAFT试剂PEO-CTA；然后将PEO-CTA与DMAEMA、MAEBA、引发剂和溶剂混合后反应。
优选地，将PEO-CTA、DMAEMA、MAEBA、引发剂和溶剂混合后脱气，然后置于密封容器中65～75℃反应5.5～6.5h后迅速冷却至室温；
优选地，将混合物置于密封容器中68～72℃反应5.8～6.2h；更优选为将混合物置于密封容器中70℃反应6h；
优选地，PEO-CTA、DMAEMA和MAEBA的摩尔比为1:(55～65):(35～45)，优选为1:(58～62):(38～42)；更优选为1:60:40；
优选地，所述迅速冷却至室温为5分钟内温度降至25℃。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种pH响应性纳米粒子，该pH响应性纳米粒子主要由上述pH响应性的嵌段共聚物组装而成。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种药物，该药物包括上述pH响应性的嵌段共聚物或上述pH响应性纳米粒子。
优选地，所述药物包括所述pH响应性纳米粒子和药物活性成分，所述药物活性成分包埋于所述pH响应性纳米粒子中。
优选地，所述药物活性成分包括抗肿瘤药物。
优选地，所述药物用于治疗肺腺癌，所述药物以pH响应性的纳米粒子作为载体，包埋TMEM16A抑制剂；
优选地，所述TMEM16A抑制剂包括CaCCinh-A01。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了上述药物的制备方法，包括将所述嵌段共聚物和待包埋的药物共同溶解于共溶剂中，然后注入水并分散，分离共溶剂后得到载药纳米粒子。
优选地，嵌段共聚物和待包埋的药物的质量比为(1～2):(1～2)，优选为(1～1.5):(1～1.5)；更优选为1:1；
优选地，所述注入水并搅拌分散包括：边搅拌边向溶解有嵌段共聚物和待包埋的药物的共溶剂中以8～10mL/h的速率注入水；注入的水的终体积和共溶剂的体积比为(8～10):1；
优选地，注入的水的终体积和共溶剂的体积比为(8.5～9.5):1；优选为9:1；
优选地，注入水后再将共溶剂和水搅拌分散4～6h，优选4.5～5.5h，更优选5h；
优选地，所述分离共溶剂包括采用透析的方法去除共溶剂。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供的pH响应性的嵌段共聚物是由PEO、MAEBA和DMAEMA聚合而成的PEO-b-P(DMAEMA-co-MAEBA)共聚物，PEO-b-P(DMAEMA-co-MAEBA)嵌段共聚物是一种pH响应性的嵌段共聚物，当环境中pH降低，该嵌段共聚物的结构发生改变。该嵌段共聚物能够在水溶液中通过自组装形成胶束，得到pH响应性的纳米粒子，疏水的PMAEBA和pH响应单元PDMAEMA形成胶束核心层，亲水性PEO形成胶束外壳，提高了纳米粒子的稳定性。核内的PDMAEMA是pH敏感的，使PEO-b-P(DMAEMA-co-MAEBA)自组装形成的胶束在pH较低的环境中发生构象的改变。当使用上述pH响应性的嵌段共聚物或pH响应性的纳米粒子作为载体搭载药物时，可以形成药壳型微小囊状物，以克服其在水溶液中溶解性低的问题，而同时不引起活性损失或变性。同时，本发明提供的嵌段共聚物以及由其组成的纳米粒子，具有pH响应性，使该药物在pH环境改变时释放其中的药物活性成分，以使该药物具有靶向性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1提供的PEO-b-P(DMAEMA-co-MAEBA)的NMR谱测定结果；
图2为本发明实施例2提供的包埋有CaCCinh-A01的pH响应性纳米粒子；
图3为本发明实施例4中pH响应性纳米粒子载药后，在pH5.0和pH7.0的缓冲液中释放曲线；
图4为本发明提供的包埋有CaCCinh-A01的pH响应性纳米粒子在体内聚集在小鼠肺腺癌组织周围；
图5为本发明提供的包埋有CaCCinh-A01的pH响应性纳米粒子对肿瘤模型鼠的治疗效果；
图6为本发明实施例3中的标准曲线。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种pH响应性的嵌段共聚物，所述嵌段共聚物由PEO、MAEBA和DMAEMA聚合而成，其中，PEO为聚氧化乙烯，具有如结构式(ⅰ)所示结构，m为20～100的正整数：
Figure BDA0002407489000000051
DMAEMA为甲基丙烯酸二甲氨基乙酯，具有如结构式(ⅱ)所示结构:
Figure BDA0002407489000000052
MAEBA为对-(甲基丙烯氧基乙氧基)苯甲醛，具有如结构式(ⅲ)所示结构:
Figure BDA0002407489000000053
PEO、MAEBA和DMAEMA聚合而成的pH响应性的嵌段共聚物的结构式如(Ⅰ)所示，其中m和n分别独立的为20～100的正整数：
Figure BDA0002407489000000054
刺激响应性聚合物，是指分子结构中含有响应性高分子链段或者响应性化学基团的聚合物，当外界给予一定的刺激信号时，比如光、温度和pH等，聚合物将会发生可逆或者不可逆的结构性质改变。本发明提供的嵌段共聚物是一种pH响应性的嵌段共聚物，能够在水溶液中通过自组装形成胶束。疏水的聚MAEBA和pH响应单元聚DMAEMA形成胶束核心层，亲水性PEO形成胶束外壳，提高了纳米粒子的稳定性。核内的PDMAEMA是pH敏感的，使pH响应性的嵌段共聚物自组装形成的胶束在pH降低后发生构象的改变。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了上述嵌段共聚物的制备方法。本发明采用可逆加成断裂链转移聚合法(RAFT聚合法)，包括：合成含有链转移剂的RAFT试剂PEO-CTA；然后将PEO-CTA与DMAEMA、MAEBA引发剂和溶剂混合后反应。具体反应过程的一个实施例如下所示：
Figure BDA0002407489000000061
在一些优选的实施方式中，将PEO-CTA、DMAEMA、MAEBA和溶剂混合后脱气，然后置于密封容器中65～75℃反应5.5～6.5h后迅速冷却至室温；反应温度例如可以为但不限于65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃或75℃；反应时间例如可以为但不限于5.5h、5.6h、5.7h、5.8h、5.9h、6.0h、6.1h、6.2h、6.3h、6.4h或6.5h。在一些优选的实施方式中，将混合物置于密封容器中68～72℃反应5.8～6.2h；更优选为将混合物置于密封容器中70℃反应6h。
在一些优选的实施方式中，按照如下方法制备pH响应性的嵌段共聚物，通过1HNMR谱测定的转化率，最终转化率可以达到约为90％。
(a)将PEO-CTA、DMAEMA、MAEBA和THF(四氢呋喃)加入聚合管中，其中PEO-CTA、DMAEMA和MAEBA的摩尔比为1:(55～65):(35～45)；例如可以为但不限于为1:55:45、1:65:45、1:55:35、1:65:35、1:58:42、1:62:42、1:58:38、1:62:38、1:60:38、1:60:42或1:60:40；更优选为1:60:40。
(b)将PEO-CTA、DMAEMA、MAEBA和THF的混合物经过三个冻干-抽真空-解冻循环进行脱气。
(c)将聚合管在真空下火焰密封，密封管在65～75℃油浴中浸泡，反应5.5～6.5h，然后将聚合管5分钟内将温度降至25℃。
(d)将反应产物经正己烷沉淀法分离，过滤后真空干燥过夜。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种pH响应性纳米粒子，该pH响应性纳米粒子主要由上述pH响应性的嵌段共聚物组装而成，组装形成的纳米粒子在pH降低后发生构象的改变，可使纳米粒子中包埋的物质得到释放，能够用于制备药物载体。本发明提供的pH响应性纳米粒子由上述pH响应性的嵌段共聚物PEO-b-P(DMAEMA-co-MAEBA)自组装即可得到，自组装的方式通常是将具有两亲性的嵌段共聚物先溶解在共溶剂中，然后再向共溶剂中加入水，则两亲性的嵌段共聚物则自组装成胶束。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种药物，该药物包含上述pH响应性的嵌段共聚物PEO-b-P(DMAEMA-co-MAEBA)或上述pH响应性的纳米粒子。本发明提供的PEO-b-P(DMAEMA-co-MAEBA)或pH响应性的纳米粒子可以包载疏水性药物，形成药壳型微小囊状物，以克服其在水溶液中溶解性低的问题，而不引起活性损失或变性。同时，本发明提供的嵌段共聚物以及由其组成的纳米粒子，具有pH响应性，使该药物在pH环境改变时释放其中的药物活性成分，以使该药物具有靶向性。
在一些优选的实施方式中，该药物包括上述pH响应性纳米粒子和药物活性成分，并且药物活性成分包埋于pH响应性纳米粒子中。PEO-b-P(DMAEMA-co-MAEBA)在水溶液中通过自组装形成胶束，疏水的PMAEBA和pH响应单元PDMAEMA形成胶束核心层，药物活性成分通过疏水相互作用被包裹在胶束核心层。亲水性PEO形成胶束外壳，提高了纳米粒子的稳定性。核内的PDMAEMA是pH敏感的，使纳米颗粒在pH较低的组织周围释放药物活性成分。可以理解的是，本发明不限制PEO-b-P(DMAEMA-co-MAEBA)中包埋的药物活性成分的种类，包括但不限于紫杉醇、阿霉素等广谱抗癌化合物分子。
在一些优选的实施方式中，所述药物活性成分包括抗肿瘤药物。以pH响应性纳米粒子包埋抗肿瘤药物，使抗肿瘤药具有pH靶向性：肿瘤组织细胞具有独特的微酸性的特点，肿瘤组织的pH(5～6.8)明显低于正常的组织pH(7.4)。肿瘤组织的弱酸性环境，使包埋有药物活性成分的pH响应性纳米粒子由于环境中pH的变化，结构发生改变，释放其中包埋的抗肿瘤药物。纳米尺度的载体体系，能够使分散在体液中的药物通过血液循环和实体瘤组织的高通透性和滞留效应，被动富集到细胞周围，从而在相对较低的抗癌药物浓度下杀死癌症细胞，有效的提高了抗癌药物的生物利用率、降低药物的毒副作用。纳米尺度药物，还可有效逃避被肾脏排泄和脾脏过滤。可以理解的是，所述肿瘤只要为组织周围的pH低于正常组织的肿瘤即可，本发明对此不做限制，包括但不限于肺腺癌、胃癌、宫颈癌、乳腺癌、神经胶质瘤、骨肉瘤、肝癌、试管鳞状癌、大肠结肠癌或白血病等。
在一些优选的实施方式中，提供了一种用于治疗肺腺癌的药物，该药物以pH响应性的纳米粒子作为载体，包埋TMEM16A抑制剂。肺癌是常见恶性肿瘤，肺腺癌是肺癌的主要类型，发病率和死亡率较高，且易发转移，治愈率低。TMEM16A是一种钙激活氯离子通道，通过Ca2+浓度激活氯离子转运功能。TMEM16A离子通道在肺腺癌中高表达，且TMEM16A的高表达与肺腺癌的增殖，迁移，侵袭等都有密切的关系，因此通过抑制肺腺癌中的TMEM16A可以对肺腺癌生长产生抑制。
在一些优选的实施方式中，所述TMEM16A抑制剂包括CaCCinh-A01，CaCCinh-A01具有如结构式(ⅳ)所示结构：
Figure BDA0002407489000000091
本发明经实验发现，CaCCinh-A01对肺腺癌具有抑制作用，同时使用PEO-b-P(DMAEMA-co-MAEBA)包埋CaCCinh-A01后，能够提高CaCCinh-A01在肺腺癌组织周围的富集，使用PEO-b-P(DMAEMA-co-MAEBA)包埋CaCCinh-A01的药物的治疗效果优于单独使用CaCCinh-A01。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了上述药物的制备方法，该制备方法采用将上述pH响应性的嵌段共聚物PEO-b-P(DMAEMA-co-MAEBA)和待包埋的药物或共同溶解于共溶剂中，然后注入水并搅拌分散，分离共溶剂后得到包埋有药物或形成分的pH响应性纳米粒子。
在一些优选的实施方式中，按照如下方法使用pH响应性的嵌段共聚物PEO-b-P(DMAEMA-co-MAEBA)包埋药物活性成分，包埋效果更佳：
(A)将PEO-b-P(DMAEMA-co-MAEBA)和待包埋药物共同溶解于THF中；其中嵌段共聚物和待包埋的药物的质量比为(1～2):(1～2)，例如可以为但不限于为1:2、1:1、2:1、1:1.5、2:1.5、1.5:2或1.5:1，优选为(1～1.5):(1～1.5)；更优选为1:1。
(B)在剧烈搅拌下，通过注射器泵以8～10mL/h的速率注入去离子水，加入完成后，再搅拌分散；其中，注入去离子水的速率例如可以为但不限于为8mL/h、8.5mL/h、9mL/h、9.5mL/h或10mL/h；优选为8.5～9.5mL/h，更优选为9mL/h。
在一些优选的实施方式中，注入的水的终体积和THF的体积比为(8～10):1，例如可以为但不限于为8:1、8.5:1、9:1、9.5:1、10:1，优选为(8.5～9.5)：1，更优选为9:1。
在一些优选的实施方式中，注入水后再将共溶剂和水搅拌分散4～6h，例如可以为但不限于为4h、4.5h、5h、5.5h或6h；优选4.5～5.5h，更优选5h。
(C)对去离子水透析(分子量截止(MWCO)：35kda)，48h去除THF，每12小时定期更换透析介质，然后用紫外分光光度法测定pH响应性的纳米粒子中的载药量。
下面结合优选实施例进一步说明本发明的技术方案和有益效果:
实施例1
制备pH响应性嵌段共聚物PEO-b-P(DMAEMA-co-MAEBA)，包括如下步骤:
(a)将单羟基聚氧化乙烯m-PEO44(20g，0.01mol)、含羧基的链转移剂CTA(7.28g，0.02mol)、二环己基碳二亚胺DCC(2.06g，0.01mol)、4-二甲胺基吡啶DMAP(0.0127g，0.001mol)溶于100mLDCM中，室温下反应24h后，在乙醚中沉淀得到黄色粉末。
(b)分别将PEO-CTA(250mg，0.05mmol)、DMAEMA(471mg，3mmol)、MAEBA(234mg，1mmol)、AIBN(1.64mg，0.01mmol)、THF(2ml)加入5mL的聚合管中。
(c)将步骤(b)的混合物经过三个冻干-泵浦-解冻循环进行脱气。
(d)将聚合管在真空下火焰密封，密封管在70℃油浴中浸泡，反应6h，然后将聚合管迅速冷却至室温。
(e)将反应产物经正己烷沉淀法分离，过滤后真空干燥过夜。
(f)通过1H NMR谱测定的转化率，最终转化率约为90％，结果如图1所示。
实施例2
使用实施例1制备得到的pH响应性嵌段共聚物制备包埋CaCCinh-A01的pH响应性纳米粒子，包括如下步骤：
(A)将10mg嵌段共聚物PEO-b-P(DMAEMA-co-MAEBA)与10mg待包埋药物CaCCinh-A01共同溶解于1mL THF中。
(B)在剧烈搅拌下，通过注射器泵以9mL/h的速率加入去离子水，共加入去离子水9mL，加入完成后，再搅拌分散5h。
(C)对去离子水透析(分子量截止(MWCO)：35kda)，48h去除THF，每12小时定期更换透析介质，制备得到的载药的pH响应性纳米粒子如图2所示。
实施例3
使用实施例2提供的方法制备包埋有CaCCinh-A01的pH响应性纳米粒子，通过UV定量分析测量胶束的载药量(DLC)。对于UV方法，制备DMSO中的一系列药物溶液(10μM、50μM、100μM、200μM)，然后测量每种溶液的UV吸光度，建立标准曲线。标准曲线如图6所示。
将PEO-b-P(MAEBA-co-DMAEMA)(1mg)溶解在DMSO(1mL)中，并基于标准曲线获得其中包埋的CaCCinh-A01药物浓度。DLC根据通式计算：DLC＝(负载药物重量/聚合物重量)×100％。
实施例4
取1mL所制备的载药纳米粒子悬液，将其加入10mL pH值分别为5和7的PBS缓冲液中，每四小时取出100μL液体，并补充相应的PBS缓冲液，检测取出液体吸光度变化。24小时以后每12小时取样一次，并补充PBS缓冲液。持续检测96小时，通过测量液体吸光度计算液体中药物释放出的量，绘制标准曲线。
分析包含有CaCCinh-A01的载药纳米粒子分别在pH为5.0和pH为7.0的条件下的释放效果，结果如图3所示，表明载药纳米粒子在体外pH较低的环境中释放更快，在体内则会在pH较低的肺腺癌组织周围聚集。
实施例5
本实验中使用的所有裸鼠均购自北京斯贝福生物技术有限公司，取6-8周健康雄性裸鼠，在其右侧腋下注入肺腺癌LA795细胞悬液0.1mL，细胞量约为106个细胞，正常喂养，约1周后可以形成肺腺癌肿瘤模型鼠。待小鼠体内肿瘤体积生长值150mm3时，开始每三天检测肿瘤体积和小鼠体重，并通过皮下注射给药方式在小鼠颈后皮下给药，持续给药和测量10次，随后将小鼠处死，并剥离肿瘤称重测量。
在肺腺癌肿瘤模型鼠中进行了载药纳米粒子抗癌实验，结果表明，载药纳米粒子对肺腺癌的治疗效果比直接给药提升了1倍以上，基于载药纳米粒子具有良好的靶向性效果，结果如图4和图5所示：从图4中可以看出，载药纳米粒子在体内聚集在小鼠肺腺癌组织周围；从图5可以看出，肿瘤模型鼠实验表明1.3mg/kg的Nano-A01治疗效果比2.6mg/kg的直接注射A01药效还要好，可见pH响应性纳米粒子与CaCCinh-A01的治疗肺腺癌的方式具有较好的治疗效果。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种pH响应性的嵌段共聚物，其特征在于，结构式如(Ⅰ)所示：
Figure FDA0002407488990000011
其中m为20～100的正整数，n为20～100的正整数。
2.权利要求1所述的pH响应性的嵌段共聚物的制备方法，其特征在于，包括：合成含有链转移剂的RAFT试剂PEO-CTA；然后将PEO-CTA与DMAEMA、MAEBA、引发剂和溶剂混合后反应。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，将PEO-CTA、DMAEMA、MAEBA、引发剂和溶剂混合后脱气，然后置于密封容器中65～75℃反应5.5～6.5h后迅速冷却至室温；
优选地，将混合物置于密封容器中68～72℃反应5.8～6.2h；更优选为将混合物置于密封容器中70℃反应6h；
优选地，PEO-CTA、DMAEMA和MAEBA的摩尔比为1:(55～65):(35～45)，优选为1:(58～62):(38～42)；更优选为1:60:40；
优选地，所述迅速冷却至室温为5分钟内温度降至25℃。
4.一种pH响应性纳米粒子，其特征在于，主要由权利要求1所述的pH响应性的嵌段共聚物组装而成。
5.药物，其特征在于，所述药物包括权利要求1所述的pH响应性的嵌段共聚物或权利要求4所述的pH响应性纳米粒子。
6.根据权利要求5所述的药物，其特征在于，所述药物包括权利要求5所述的pH响应性纳米粒子和药物活性成分，所述药物活性成分包埋于所述pH响应性纳米粒子中。
7.根据权利要求6所述的药物，其特征在于，所述药物活性成分包括抗肿瘤药物。
8.根据权利要求7所述的药物，其特征在于，所述药物用于治疗肺腺癌，所述药物以pH响应性的纳米粒子作为载体，包埋TMEM16A抑制剂；
优选地，所述TMEM16A抑制剂包括CaCCinh-A01。
9.权利要求5-8任一项所述的药物的制备方法，其特征在于，包括将所述嵌段共聚物和待包埋的药物共同溶解于共溶剂中，然后注入水并分散，分离共溶剂后得到载药纳米粒子。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，嵌段共聚物和待包埋的药物的质量比为(1～2):(1～2)，优选为(1～1.5):(1～1.5)；更优选为1:1；
优选地，所述注入水并搅拌分散包括：边搅拌边向溶解有嵌段共聚物和待包埋的药物的共溶剂中以8～10mL/h的速率注入水；注入的水的终体积和共溶剂的体积比为(8～10):1；
优选地，注入的水的终体积和共溶剂的体积比为(8.5～9.5):1；优选为9:1；
优选地，注入水后再将共溶剂和水搅拌分散4～6h，优选4.5～5.5h，更优选5h；
优选地，所述分离共溶剂包括采用透析的方法去除共溶剂。
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