CN111227161A - 一种卵清蛋白-香芹酚纳米颗粒及其制备方法和抗菌用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种卵清蛋白‑香芹酚纳米颗粒及其制备方法和抗菌用途，该卵清蛋白‑香芹酚纳米颗粒是将卵清蛋白和香芹酚在溶液中混合，然后加热凝胶化制得卵清蛋白‑香芹酚凝胶，将所得卵清蛋白‑香芹酚凝胶依次进行破碎、超声、冻干和复溶处理，即得卵清蛋白‑香芹酚纳米颗粒。本发明以卵清蛋白和香芹酚为主要原料，先应用卵清蛋白的乳化和两亲性功能使其与香芹酚进行乳化交联，再通过卵清蛋白变性凝胶以及后续处理使卵清蛋白和香芹酚自组装形成纳米粒子，减少了其因环境因素造成的氧化分解，不仅解决香芹酚溶解性的问题，而且提高了抑菌活性。所制备的纳米粒子具有不添加化学乳化剂、分散性好、水溶性强、稳定性好、制备周期短、产率高等特点。
Description
技术领域
本发明属于香芹酚纳米材料技术领域，具体涉及一种卵清蛋白-香芹酚纳米颗粒及其制备方法和抗菌用途。
背景技术
香芹酚是牛至、百里香、马郁兰和亚加菊等精油的主要成分，是一种安全的添加剂(GRAS)，被美国食品和药物管理局批准用于食品，且已经被欧洲委员会列入可添加到食品中的化学调味剂列表中，并在我国食品添加剂国标中也有相关描述。香芹酚具有广泛的应用价值，常用作消毒剂、杀菌剂、香料及化妆品的配方中。但香芹酚稳定性差，当其暴露在空气、光线或热源中时，会被氧化、分解或蒸发；在水中高度不溶，导致香芹酚在水含量高的基质中与病原菌的接触有限。所以要寻找有效的方法改善香芹酚的水溶性并提高其抑菌活性，延长其贮存期。现有技术中有将香芹酚制备成纳米乳液的报道，但普遍存在包封率不高、添加化学乳化剂等缺陷，且并没有显著改善香芹酚稳定性以及长效的抑菌活性。
卵清蛋白作为纳米载体具有优异的营养价值、消化率、自组装和两亲性质，由385个氨基酸组成，其中50％是疏水性的，33％是带电荷的，这表明卵清蛋白可用作亲脂性组分的高效载体。
现有技术中，一般通过薄膜分散、乳化交联或热自组装等方式制备纳米颗粒，但热自组装存在多次离心去除杂质，存在样品回收率的问题；乳化交联法在制备纳米颗粒的过程中需添加化学的乳化剂，且乳化速度、相比等环境因素对产品的影响较大；薄膜分散法制备纳米颗粒工艺流程复杂，成本高。
发明内容
发明目的：针对上述技术问题，本发明提供了一种卵清蛋白-香芹酚纳米颗粒及其制备方法和抗菌用途。本发明通过将香芹酚包裹在卵清蛋白中，以减少其在使用过程中的挥发性，增强香芹酚的溶解度，增强其稳定性，从而减少香芹酚的浪费，提高其利用率，达到长效抗菌与高效利用的目的。
技术方案：为了达到上述发明目的，本发明所采用的技术方案如下：
一种卵清蛋白-香芹酚纳米颗粒的制备方法，包括将卵清蛋白和香芹酚在溶液中混合，然后加热凝胶化制得卵清蛋白-香芹酚凝胶，将所得卵清蛋白-香芹酚凝胶依次进行破碎、超声、冻干和复溶处理，即得所述卵清蛋白-香芹酚纳米颗粒。
具体地，包括以下步骤：
(1)壁材制备：取卵清蛋白，以去离子水作为溶剂，并调节溶液pH，水化制备卵清蛋白水溶液；
(2)混合物制备：取卵清蛋白水溶液，加入香芹酚，搅拌制备卵清蛋白-香芹酚乳化混合物；
(3)凝胶制备：取搅拌后混合物加热使其凝胶化，冷却，过夜，制得卵清蛋白-香芹酚凝胶；
(4)将所得卵清蛋白-香芹酚凝胶依次进行破碎、超声、冻干和复溶处理，即得所述卵清蛋白-香芹酚纳米颗粒。
优选，步骤(1)中，所述卵清蛋白水溶液质量浓度为10-25％，溶液pH为2-9，所述水化是在室温下水化2-3h。
优选，步骤(2)中，所述加入香芹酚的方式为：在搅拌状态下以0.1-1mL/min的速度滴加香芹酚到卵清蛋白水溶液中，使香芹酚浓度为20-50mg/mL，并在20-30℃下搅拌2-4h。
优选，步骤(3)中，所述加热的条件为85-95℃，20-40min；所述冷却是采用冰浴10-20min冷却，所述过夜是在4℃下过夜。
优选，步骤(4)中，所述破碎，是在1-2万转/min的条件下均质破碎3-5min；所述超声，是在600-900W条件下超声处理10-20min；所述冻干，是在-80℃条件下冷冻干燥12-24h；所述复溶，是采用去离子水复溶，然后超声，再4000-6000rpm低速离心5-15min后，收集上清。
本发明还提供了上述制备方法所制得的卵清蛋白-香芹酚纳米颗粒。
本发明最后提供了所述的卵清蛋白-香芹酚纳米颗粒作为抗菌剂的应用。
本发明采用绿色天然的卵清蛋白使香芹酚与外界环境隔绝开来，可以降低香芹酚的挥发性，提高其水溶性，延长保存期。此外，纳米颗粒可以增加与细菌的接触面积，从而增强香芹酚的抗菌效果。本发明充分利用卵清蛋白的乳化和两亲的特性，在不添加化学乳化剂的前提下将卵清蛋白和香芹酚乳化交联，再通过热凝胶自组装的方式进一步提高包埋效果，所得纳米颗粒具有包封率高、PDI低(均匀分散性好)、水溶性强、操作简单便捷、绿色安全的特点。
有益效果：相对于现有技术，本发明具有以下优势：
1.本发明通过将卵清蛋白变性凝胶的过程使卵清蛋白和香芹酚自组装成纳米粒子，整个制备方法及制备过程简单快捷，卵清蛋白来源广泛，纳米粒子制备周期短、分散性好、产率高。
2.针对香芹酚水溶性差的问题，合理利用卵清蛋白系统包埋，不仅解决香芹酚溶解性的问题，而且对香芹酚的刺激性气味到有效的消除作用。
3.本发明通过将香芹酚与卵清蛋白自组装制备纳米粒子，对香芹酚起到了保护作用，减少了其因环境因素造成的氧化分解，提高了其生物利用率，并且纳米粒子具有更大的接触面积，能够更好地使香芹酚与细菌接触，提高其抑菌效果。
4.本发明充分利用卵清蛋白和香芹酚的结合特性，不添加化学乳化剂，绿色安全。
5.本发明充分蛋白质利用资源，不仅拓宽了香芹酚的应用价值，而且为提高卵清蛋白这一优质资源的附加价值，提供了新的出路。
附图说明
图1：包埋前后样品的粒径图。
图2：卵清蛋白-香芹酚纳米粒子的透射电镜图。
图3：卵清蛋白-香芹酚纳米粒子的成品图，A1：游离香芹酚乳液；A2：卵清蛋白-香芹酚纳米颗粒。
图4：卵清蛋白-香芹酚纳米粒子药物体外释放曲线。
图5：卵清蛋白-香芹酚纳米颗粒的时间杀菌曲线，A:蜡样芽孢杆菌；B:沙门氏菌；
图6：卵清蛋白-香芹酚纳米颗粒对肉制品贮藏过程中菌落总数的影响。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明所述的技术方案给予进一步详细的说明。
实施例1
卵清蛋白-香芹酚纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：
1.取卵清蛋白，以去离子水作为溶剂，使卵清蛋白水溶液质量浓度为20％，并调节溶液pH＝2，水化2h，制备卵清蛋白水溶液；
2.取卵清蛋白水溶液，以0.1mL/min的速度滴加香芹酚到卵清蛋白溶液中，使香芹酚浓度为50mg/mL，并在30℃下搅拌3h；
3.取搅拌后混合物在90℃下加热30min使其凝胶化并冰浴20min，于4℃过夜，制得卵清蛋白-香芹酚凝胶；
4.取卵清蛋白-香芹酚凝胶于乳化均质机中10000rpm均质破碎3min，破碎后样品于600W超声处理15min；
5.取超声后样品于-80℃冷冻干燥24h，制得卵清蛋白-香芹酚复合物粉末；
6.取卵清蛋白-香芹酚复合物粉末于去离子水中复溶，600W超声10min后于5000rpm低速离心收集上清，制得卵清蛋白-香芹酚纳米颗粒放入-20℃储存。
实施例2
卵清蛋白-香芹酚纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：
1.取卵清蛋白，以去离子水作为溶剂，使卵清蛋白水溶液质量浓度为15％，并调节溶液pH＝5，水化3h，制备卵清蛋白水溶液；
2.取卵清蛋白水溶液，以0.5mL/min的速度滴加香芹酚到卵清蛋白溶液中，使香芹酚浓度为60mg/mL，并在30℃下搅拌2h；
3.取搅拌后混合物在85℃下加热30min使其凝胶化并冰浴15min，于4℃过夜，制得卵清蛋白-香芹酚凝胶；
4.取卵清蛋白-香芹酚凝胶于乳化均质机中20000rpm均质破碎5min，破碎后样品于600W超声处理15min；
5.取超声后样品于-80℃冷冻干燥36h，制得卵清蛋白-香芹酚复合物粉末；
6.取卵清蛋白-香芹酚复合物粉末于去离子水中复溶，600W超声15min后于4000rpm低速离心收集上清，制得卵清蛋白-香芹酚纳米颗粒放入-20℃储存。
实施例3
卵清蛋白-香芹酚纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：
1.取卵清蛋白，以去离子水作为溶剂，使卵清蛋白水溶液质量浓度为25％，并调节溶液pH＝7，水化2h，制备卵清蛋白水溶液；
2.取卵清蛋白水溶液，以1mL/min的速度滴加香芹酚到卵清蛋白溶液中，使香芹酚浓度为60mg/mL，并在30℃下搅拌3h；
3.取搅拌后混合物在95℃下加热30min使其凝胶化并冰浴20min，于4℃过夜，制得卵清蛋白-香芹酚凝胶；
4.取卵清蛋白-香芹酚凝胶于乳化均质机中10000rpm均质破碎3min，破碎后样品于600W超声处理15min；
5.取超声后样品于-80℃冷冻干燥24h，制得卵清蛋白-香芹酚复合物粉末；
6.取卵清蛋白-香芹酚复合物粉末于去离子水中复溶，600W超声15min后于6000rpm低速离心收集上清，制得卵清蛋白-香芹酚纳米颗粒放入-20℃储存。
实施例4
1.取卵清蛋白，以去离子水作为溶剂，使卵清蛋白水溶液质量浓度为25％，并调节溶液pH＝5，水化2h，制备卵清蛋白水溶液；
2.取卵清蛋白水溶液在90℃下加热30min使其凝胶化并冰浴20min，于4℃过夜，制得卵清蛋白凝胶；
3.取卵清蛋白凝胶于乳化均质机中10000rpm均质破碎3min，破碎后样品于600W超声处理15min；
4.取破碎后卵清蛋白凝胶，以1mL/min的速度滴加香芹酚到卵清蛋白凝胶颗粒中，使香芹酚浓度为60mg/mL，并在30℃下搅拌3h；
5.取超声后样品于-80℃冷冻干燥36h，制得卵清蛋白-香芹酚复合物粉末；
6.取卵清蛋白-香芹酚复合物粉末于去离子水中复溶，600W超声15min后于6000rpm低速离心收集上清，制得卵清蛋白-香芹酚纳米颗粒放入-20℃储存。
对于上述实施例1和4制得的卵清蛋白-香芹酚纳米颗粒的各项指标进行检测，测得的各项技术指标如下表所示：
一、卵清蛋白-香芹酚纳米颗粒的包封和负载率
对于卵清蛋白-香芹酚纳米颗粒，将5mg样品溶解于5mL乙腈中，充分混合后在室温下放置48h，间歇摇动，以留出足够的时间使所有活性物质进入溶液中，在测量之前，将溶液在3200g下离心15min，以除去溶液中的蛋白，只留下香芹酚。通过公式计算了卵清蛋白-香芹酚纳米颗粒的包封率(EE)和载药量(LC)。(1)和(2)，分别为：
包封率(％)＝纳米颗粒内香芹酚的质量/初始香芹酚质量×100 (1)
负载率(％)＝纳米颗粒内香芹酚的质量/样品质量×100 (2)
包封率和负载率是评价包封物质质量好坏的重要指标，也是载体是否充分发挥包封性能的关键。结果测得通过交联会和凝胶包埋的卵清蛋白-香芹酚纳米颗粒包封率为91.13％，负载率为43.36％；而先制备凝胶，再加入香芹酚制备出的卵清蛋白-香芹酚纳米颗粒包封率仅为51.38％。说明通过先乳化交联再凝胶包埋制备出的纳米颗粒具有更高的包封率。
二、卵清蛋白-香芹酚纳米颗粒和PDI
粒径和PDI是反映蛋白质纳米颗粒均匀性及其在食品工业中应用效果的重要指标。纳米颗粒的PDI越小说明纳米颗粒分散性越好，当PDI小于0.3时，表示纳米颗粒具有优良的均匀性和分散性。如图1所示，先乳化交联再凝胶制备出的纳米颗粒平均粒径从81.13nm(不含香芹酚)增加到179.1nm(含香芹酚)，PDI从0.176(不含香芹酚)增加到0.108(含香芹酚)。说明此卵清蛋白-香芹酚纳米颗粒具有优良的均匀性和分散性；而先制备凝胶再加入香芹酚制备出的纳米颗粒为132.2nm，PDI为0.336。说明先乳化交联再凝胶包埋制备出的纳米颗粒具有更好的均匀分散性。
三、抗菌作用研究
(1)最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)
根据NCCLS 2000推荐的肉汤稀释法测定颗粒的最小抑菌浓度(MIC)。以沙门氏菌和蜡样芽孢杆菌为试验菌，所有细菌接种于LB肉汤中，培养8-10h。采用LB肉汤二倍稀释法在96孔板中制备一系列样品浓度。在37℃培养24小时后，MIC被确定为最低样品浓度的澄清孔。为了评估最小杀菌浓度(MBC)，将所有无浊度孔(MIC试验)中的液体涂布到LB琼脂平板上，在37℃培养24h。MBC为无细菌生长的平板相应的样品的最低浓度。对每个样品进行三次试验。
香芹酚、卵清蛋白-香芹酚纳米颗粒对LB培养基中蜡样芽孢杆菌和沙门氏菌的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度值见表1。由表1可知，经包封处理的香芹酚及卵清蛋白-香芹酚纳米颗粒的MIC和MBC得到了明显的改善。
表1卵清蛋白-香芹酚纳米颗粒的MIC和MBC
(2)时间-杀菌曲线
根据MIC检测结果，对卵清蛋白-香芹酚纳米颗粒进行进一步检测。将细菌悬浮液稀释至最终浓度为5x105 CFU/mL。根据卵清蛋白-香芹酚纳米颗粒的MIC，实验组设为空白卵清蛋白、游离香芹酚、卵清蛋白-香芹酚混合物和卵清蛋白-香芹酚纳米颗粒，初始接种量为5-105cfu/mL，然后在37℃下培养。并在0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和24h时取样测定，仅添加细菌的试管视为对照。
由图5可知，浓度低于0.08mg/ml的纳米粒不能抑制蜡样芽胞杆菌和沙门氏菌的生长。同时负载香芹酚的卵清蛋白纳米颗粒相较于游离香芹酚对蜡状芽孢杆菌和沙门氏菌的具有较强的生长抑制作用。
四、卵清蛋白-香芹酚纳米颗粒在肉制品中的应用
无菌环境下，将肉的皮层及脂肪去掉，分成10g左右的肉块。吸取100μL稀释到104CFU/mL的菌液，均匀接种于肉块表面，用卵清蛋白-香芹酚纳米颗粒均匀涂裹在肉块表面于4℃中贮存，每隔1d将肉块放入装有90mL无菌生理盐水的均质袋中，拍打使肉样中的微生物均匀分散，用6×6点样计数法测定肉块中所接种的菌的菌落数以及菌落总数，不含卵清蛋白-香芹酚纳米颗粒做阴性对照。
由图6可知，实验结果显示，24h后加入卵清蛋白-香芹酚纳米颗粒的肉制品菌落数明显低于对照样品，说明卵清蛋白-香芹酚纳米颗粒在肉制品中有良好的应用。
Claims (8)
1.一种卵清蛋白-香芹酚纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括将卵清蛋白和香芹酚在溶液中混合，然后加热凝胶化制得卵清蛋白-香芹酚凝胶，将所得卵清蛋白-香芹酚凝胶依次进行破碎、超声、冻干和复溶处理，即得所述卵清蛋白-香芹酚纳米颗粒。
2.根据权利要求1所述的卵清蛋白-香芹酚纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)壁材制备：取卵清蛋白，以去离子水作为溶剂，并调节溶液pH，水化制备卵清蛋白水溶液；
(2)混合物制备：取卵清蛋白水溶液，加入香芹酚，搅拌制备卵清蛋白-香芹酚乳化混合物；
(3)凝胶制备：取搅拌后混合物加热使其凝胶化，冷却，过夜，制得卵清蛋白-香芹酚凝胶；
(4)将所得卵清蛋白-香芹酚凝胶依次进行破碎、超声、冻干和复溶处理，即得所述卵清蛋白-香芹酚纳米颗粒。
3.根据权利要求2所述的卵清蛋白-香芹酚纳米颗粒的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述卵清蛋白水溶液质量浓度为10-25％，溶液pH为2-9，所述水化是在室温下水化2-3h。
4.根据权利要求2所述的卵清蛋白-香芹酚纳米颗粒的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述加入香芹酚的方式为：在搅拌状态下以0.1-1mL/min的速度滴加香芹酚到卵清蛋白水溶液中，使香芹酚浓度为20-50mg/mL，并在20-30℃下搅拌2-4h。
5.根据权利要求2所述的卵清蛋白-香芹酚纳米颗粒的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述加热的条件为85-95℃，20-40min；所述冷却是采用冰浴10-20min冷却，所述过夜是在4℃下过夜。
6.根据权利要求2所述的卵清蛋白-香芹酚纳米颗粒的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述破碎，是在10000-20000rpm条件下均质破碎3-5min；所述超声，是在600-900W条件下超声处理10-20min；所述冻干，是在-80℃条件下冷冻干燥12-24h；所述复溶，是采用去离子水复溶，然后超声，再4000-6000rpm低速离心5-15min后，收集上清。
7.权利要求1-6任一项所述制备方法所制得的卵清蛋白-香芹酚纳米颗粒。
8.权利要求7所述的卵清蛋白-香芹酚纳米颗粒作为抗菌剂的应用。
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