CN111214665A - Pda@pamam复合纳米材料的制备及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种PDA@PAMAM复合纳米材料的制备方法及其应用。所述制备方法为：通过化学聚合法，选择含有空腔的PAMAM溶液引发多巴胺聚合成PDA，实现PDA纳米颗粒的合成与PAMAM的表面包覆。利用光热转换能力，在所述PDA@PAMAM复合纳米材料上负载药物或基因，随着温度的局部升高，肿瘤细胞被灭杀。负载的PAMAM赋予材料丰富的表面官能团，使其带正电，具有很强的生物毒性，选择了PVP表面修饰，还可以对其进行其它的多功能表面修饰，在提升其生物安全性的同时键合其它有机物或者基因载体。同时，树枝状结构的PAMAM具有大量空腔，可以通过物理吸附或者化学键合等方法负载药物或者蛋白基因等。

Description

PDA@PAMAM复合纳米材料的制备及应用
技术领域
本发明涉及一种复合光热材料PDA@PAMAM的制备方法及应用，属于生物纳米材料领域。
背景技术
聚酰胺-胺树状大分子(PAMAM)因其特殊的结构和性质，在生物医学上得到了广泛的应用。纳米药物载体是以纳米颗粒作为药物转移载体，将药物包裹在纳米颗粒之中或吸附在其表面，同时也在颗粒表面耦联特异性的靶向分子(如特异性配体、单克隆抗体等)，通过靶向分子与细胞表面特异性受体结合，在细胞摄取作用下进入细胞内，实现安全有效的靶向性药物治疗。一般的周期性给药方式产生的有效浓度只能维持较短时间，且浓度上下波动较大，往往容易造成体内药物浓度过高，对人体造成毒副作用。纳米颗粒具有较高的表面能和较小的粒径。较高的表面能使得纳米颗粒可以吸附一些小分子药物，而较小的粒径则可以保证纳米粒子可以通过人体的毛细血管，还可以通过血脑屏障。通过纳米药物载体可以达到药物控制释放，实现安全有效的药物治疗的目的，纳米颗粒作为药物载体受到了学者们越来越多的青睐。
光热治疗又被称作光热消融治疗，是将具有很高的光热转换效率(将光能转换为热能的能力)的材料注射入生物体体内，利用材料本身的靶向识别能力，实现材料在肿瘤组织部位富集，并在外部利用近红外激光照射，将材料吸收的光能转换成热能，在肿瘤组织部位局部升温至可治疗范围(43-48℃)，利用肿瘤细胞和正常细胞对于温度的耐受不同而达到杀死肿瘤细胞，抑制肿瘤增殖的方法。这种治疗方式适合大部分的癌症患者，尤其是上皮组织癌变患者。根据近期的研究，光热治疗的原理仍存在很多争议。但公信力最高，也是沿用最广泛的一种原理是：当光热材料受到NIR激光照射，吸收了光能，电子相应的从基态产生跃迁，跃迁至激发态，然后激发态电子产生非辐射弛豫过程，导致分子动能增加，最终达到局部升温的效果。
发明内容
本发明所要解决技术问题是：提供一种PDA@PAMAM复合纳米材料的制备及其应用。
为了解决上述问题，本发明提供了一种PDA@PAMAM复合纳米材料的制备方法，其特征在于，通过化学聚合法，选择含有空腔的PAMAM溶液引发多巴胺聚合成PDA，实现PDA纳米颗粒的合成与PAMAM的表面包覆，得到PDA@PAMAM复合纳米材料。PAMAM树状大分子表面有大量氨基、其水溶液呈碱性，而DA在碱性条件下可以被引发聚合生成光热材料PDA。而且，表面的PAMAM赋予了PDA丰富的氨基，可对其进行表面氨基封端修饰。本发明基于氨基与PVP的氢键作用，拟在PDA@PAMAM纳米材料表面修饰PVP，并通过细胞安全性实验来探究材料生物应用的可行性。
优选地，所述多巴胺原料采用多巴胺水溶液，其质量浓度为0.1-0.5％；多巴胺水溶液的有效成分与PAMAM的质量比为20:1。
优选地，所述的多巴胺为盐酸多巴胺。
优选地，所述PAMAM溶液在搅拌条件下引发多巴胺，搅拌设备采用磁力搅拌器或离心机。
更优选地，所述磁力搅拌器的转速250-500r/min；离心机的转速为10000-15000r/min。
优选地，所述PDA@PAMAM复合纳米材料表面用PVP进行修饰。
更优选地，所述修饰的方法为：将所述PDA@PAMAM复合纳米材料置于PVP溶液中。
进一步地，所述PVP溶液的质量浓度为1％。
本发明还提供了上述PDA@PAMAM复合纳米材料的制备方法所制备的PDA@PAMAM复合纳米材料的应用，其特征在于，利用光热转换能力，在所述PDA@PAMAM复合纳米材料上负载药物或基因，随着温度的局部升高，肿瘤细胞被灭杀。PVP的修饰降低了材料的生物毒性，PAMAM的分子空腔可以负载热休克蛋白，利用PDA的光热转换能力，并负载药物或基因，随着温度的局部升高，从而达到杀死肿瘤细胞的目标。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
以PDA为基础，表面包覆了PAMAM。负载的PAMAM赋予材料丰富的表面官能团，使其带正电，具有很强的生物毒性，选择了PVP表面修饰，还可以对其进行其它的多功能表面修饰，在提升其生物安全性的同时键合其它有机物或者基因载体，如金和阿霉素等。同时，树枝状结构的PAMAM具有大量空腔，可以通过物理吸附或者化学键合等方法负载药物或者蛋白基因等，以搭建新型的携带热诱导基因HSP70启动子调控的结肠肿瘤内靶向基因平台。
本发明利用PAMAM对DA溶液有引发聚合的作用，创造性地一步合成了PDA@PAMAM复合纳米材料。聚多巴胺作为光热治疗剂有很高的光热转化效率，同时PAMAM提高了材料的应用价值。这样的简单的合成策略为今后纳米材料的设计提供了新的思路，促进了具有优异生物相容性的有机光热诊疗剂的长期发展。
附图说明
图1a分别为PDA@PAMAM不同倍率下SEM图像的比较图；
图1b为PDA@PAMAM纳米材料与原料的红外对比图；
图1c为不同浓度的PDA@PAMAM复合纳米材料的UV-Vis-NIR吸收光谱图；
图2a为PDA@PAMAM纳米材料在去离子水中的稳定性以及丁达尔效应；
图2b为PDA@PAMAM纳米材料在生理盐水中的稳定性以及丁达尔效应；
图3a为PDA的Zeta电位图；
图3b为PAD@PAMAM的Zeta电位图；
图3c为PDA@PAMAM-PVP的Zeta电位图；
图4为PDA@PAMAM纳米材料的光热实验图；其中，(a)为在功率为1W/cm2的808nm激光照射下，不同浓度的PDA@PAMAM纳米材料的温度变化曲线；(b)为(a)对应的热成像照片；(c)为不同功率的808nm激光照射下的温度变化曲线；(d)为(c)对应的热成像照片；(e)为PDA@PAMAM纳米材料的光热循环图；(f)为PDA@PAMAM纳米材料的光热转化效率图；
图5a为PDA@PAMAM-PVP纳米材料对SW1990细胞增殖的影响，即不同浓度材料与SW1990细胞培育24h后细胞存活率；
图5b为图5a对应的细胞图像；其中，细胞分别被(1)DMEM、(2)0.5mg/mL、(3)1mg/mL、(4)2mg/mL处理24h。
具体实施方式
为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。
以下实施例中所用到的各原料均为市售产品。其中，PVP(M.W.＝40kDa，购自Sigma-Aldrich(USA))。
本发明中的各浓度，如无特殊说明，均指重量浓度。
实施例
一种PDA@PAMAM复合纳米材料的制备方法，具体步骤为：
步骤1：称取62mg DA，将其溶于10mL去离子水中，不断搅拌。
步骤2：再用注射器吸取0.05mL第五代树状大分子PAMAM(124mg/mL)，逐滴加入DA溶液中(DA和PAMAM的质量比为10:1)。
步骤3：搅拌速度为300rpm，持续搅拌12h，得到黑色溶液。用去离子水离心洗涤三次，存储备用。所制备的纳米凝胶可以通过超声分散至水和生理盐水中。图1(d，e)显示材料在水和等渗溶液中有较好的稳定性，均显示出明显的丁达尔效应。
将上述值得得复合纳米材料进行相关测试：
1、通过扫描电子显微镜对实施例所得的PDA@PAMAM纳米材料的形貌和尺寸进行观察和测量。通过动态光散射测量颗粒的流体动力学尺寸及其稳定性。采用FTIR对PDA@PAMAM纳米材料的结构进行分析和测量，通过4000-400cm-1的传输模式，以32次扫描/分钟的速度采集数据。由图1a可看到实施例中合成的材料为球形颗粒结构。
分析图1b可知，PDA@PAMAM复合纳米材料在3367cm-1，3272cm-1，3052cm-1，2944cm-1，1602cm-1，1520cm-1，1278cm-1和1182cm-1处有吸收峰。其中3367cm-1的吸收峰为PAMAM和PDA结构上共有的叔胺N-H变形振动或者PDA上O-H伸缩振动。3274cm-1左右的吸收峰为PAMAM中缩合反应生成的N-H伸缩振动。PAMAM结构上的N-H面外弯曲振动的吸收信号为3052cm-1左右，2944cm-1吸收峰为亚甲基-CH2-的伸缩振动。1602cm-1和1520cm-1的吸收峰为PAMAM上酰胺键的特征吸收或者分别表示为苯环的伸缩振动和变形振动。1278cm-1左右的吸收为PDA上C-N的弯曲振动，而1182cm-1左右的吸收峰为PAMAM上C-N的伸缩振动。FTIR表征数据充分证明成功合成了PDA@PAMAM复合纳米材料。
通过紫外光谱法测试材料在近红外区域的吸收情况，由图1c可知，材料在近红外光下有优异的吸收能力，且光吸收强度随着材料浓度的增大而增大。在808nm的NIR激光的照射下，材料的吸光度分别为：0.526(2mg/mL)、0.422(1mg/mL)、0.221(0.5mg/mL)、0.115(0.3mg/mL)。
2、当一束激光穿过胶束时，会形成一条明亮的通路，这就是纳米胶束本身所具有丁达尔效应。将材料加入石英比色皿中，用激光垂直于比色皿照射，并对其进行拍摄。DLS实验：将ALG/PDA-PVP复合纳米材料分别分散至去离子水和生理盐水中，在0h，24h以及48h时间点对其进行DLS检测，以评估材料在两种分散介质中的粒径稳定性。通过将材料分散至小鼠的100％血清中，静置24h，观察有无沉淀来检测ALG/PDA-PVP/DOX的稳定性。
如图2a、2b所示，PDA@PAMAM纳米材料分别分散于去离子水以及生理盐水中的动态光散射图以及纳米胶束所具有的丁达尔效应图，表面包覆的PAMAM赋予PDA较好的胶体稳定性。分散的纳米胶束也表现出经典的丁达尔效应，同时，DLS数据显示表面含有大量亲水性的氨基基团使得PDA@PAMAM纳米材料在去离子水以及生理盐水中有很好的分散性。除此以外，DLS分析进一步显示材料的水合粒径在48h后并没有表现出显著的变化，表明材料具有长期的稳定性，为后续治疗提供了条件。
3、Zeta电位是指材料剪切面的电位，是表征颗粒表面电荷性质的重要指标之一。本实验所用仪器为Nano ZS 90(马尔文公司，英国)，操作步骤：分别取PDA，PDA@PAMAM和PDA@PAMAM-PVP纳米材料分散在水中，加入到仪器配备的比色皿中，在其中插入电极一端，另一端(信号端)接到仪器进行测量，记录电位正负及大小。
由图3a可知，单纯PDA的表面Zeta电势为-42.7mV左右，而一锅法合成的PDA@PAMAM纳米材料的表面电势为24.1mV左右(图3b)，而表面修饰了PVP的纳米材料的Zeta电位为2.3mV左右。其首先表明具有大量氨基的PAMAM成功包覆到PDA表面，同时黑色溶液表明PAMAM成功引发了DA的聚合。而表面正电性限制了PDA@PAMAM的生物学应用，如图3c，PDA@PAMAM-PVP纳米材料的表面电荷有显著降低，表明了PVP的成功修饰，同时也为后续应用打下了基础。
4、在固定的扫描速度下利用紫外分光光度法(Lambda 25，PerkinElmer，USA)测定实施例所制备的PDA@PAMAM复合纳米材料在500-900nm波长范围内的吸光特性。本次测试中使用的近红外激光器是上海Corning光纤公司生产的高功率多模泵激光器，对材料温度变化的监测，用FLIRTME60红外摄像机(FLIR，USA)对红外热成像图片进行拍摄。以蒸馏水作为对照，研究了浓度(0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL)及功率(0.6W/cm2、0.8W/cm2、1W/cm2)对于材料升温(△T)的影响。具体步骤如下：将100μL PDA@PAMAM纳米材料材料置于96孔板的培养孔中，用808nm的激光对孔中的材料照射5min。材料的光热转换效率是利用激光(1W/cm2，808nm)连续照射材料(2mg/mL，5min)，然后自然降温(5min)，并计算出光热效率。利用近红外激光的开与关对材料进行6个循环的照射(808nm，1W/cm2)来研究的材料的光热稳定性。
紫外分光光度计测量PDA@PAMAM纳米复合材料在波长为500-900nm的吸光度，表明材料在近红外区域是有吸收的，具有和单纯聚多巴胺类似的光热转换性能，其具有显著的浓度依赖性。为了进一步研究材料的光热转换能力与材料浓度，激光功率以及照射时间的关系，用808nm激光照射材料5min，并记录其升温数据。在外部激光的辐射下，材料显示出不同的升温表现。如图4中(a)，由上至下样品的浓度分别为2mg/mL，1mg/mL，0.5mg/mL，其温度分别升高了38.5℃，27.4℃，14.4℃，以水作为对照组，其温度仅升高了4℃。用不同功率密度(1W/cm2，0.8W/cm2，0.6W/cm2)的808nm激光照射同等浓度的材料。结果如图4中(c)所示，随着激光功率的降低，溶液的温升也越低，相应的△T分别为38.5℃，30.8℃，25.9℃。除了升温曲线，图4中(b)、(d)的红外热成像图进一步证明了材料的温度变化趋势。如图4中(f)所示，PDA@PAMAM复合纳米材料光热转换的时间常数为182.61，材料的光热转化效率为32.9％。另外，图4中(e)表示在6个光照循环中，PDA/PAMAM复合纳米材料展现出优异的光热稳定性，溶液的△T没有明显的变化。光热转换实验有效证实了PDA@PAMAM复合纳米材料可作为一种高效光热试剂，运用于癌症的光热治疗技术领域。
5、实施例所制备的PDA@PAMAM复合纳米材料的体外生物相容性实验是以SW1990细胞为细胞模型，通过Cell counting kit-8(CCK-8)检测和观察细胞形态来评估。将细胞密度为8×103的SW1990细胞转移至96孔板中，在37℃培养箱中培育24h，然后，分别将100μg不同浓度的PDA@PAMAM和PDA@PAMAM-PVP纳米材料(0mg/mL，0.5mg/mL，1mg/mL，2mg/mL)加入孔中，继续培养24h。按照说明使用CCK-8试剂盒定量测量培养24h之后的细胞的代谢活性。在每个孔中加入100μL CCK-8溶液，继续培养10min，然后用酶联免疫检测仪测量每个孔在450nm的吸光度。用PBS溶液清洗细胞三次，用活/死试剂共培养15min，利用相差显微镜(Leica DM IL LED，德国)观察细胞的微观形态。
如图5a所示，PDA@PAMAM-PVP纳米材料与SW1990细胞培育24h后，细胞活性没有降低，其具体数据分别为：98.4％(0.5mg/mL)，98.5％(1mg/mL)和98.1％(2mg/mL)，表明PVP的修饰降低了材料的细胞毒性。图5b的活/死细胞染色实验也进一步证明了PDA@PAMAM-PVP纳米材料具有很好的生物安全性，为其后续的生物应用奠定了良好的基础。

Claims (9)

1.一种PDA@PAMAM复合纳米材料的制备方法，其特征在于，通过化学聚合法，选择含有空腔的PAMAM溶液引发多巴胺聚合成PDA，实现PDA纳米颗粒的合成与PAMAM的表面包覆，得到PDA@PAMAM复合纳米材料。
2.如权利要求1所述的PDA@PAMAM复合纳米材料的制备方法，其特征在于，所述多巴胺原料采用多巴胺水溶液，其质量浓度为0.1-0.5％；多巴胺水溶液的有效成分与PAMAM的质量比为20:1。
3.如权利要求1所述的PDA@PAMAM复合纳米材料的制备方法，其特征在于，所述的多巴胺为盐酸多巴胺。
4.如权利要求1所述的PDA@PAMAM复合纳米材料的制备方法，其特征在于，所述PAMAM溶液在搅拌条件下引发多巴胺，搅拌设备采用磁力搅拌器或离心机。
5.如权利要求4所述的PDA@PAMAM复合纳米材料的制备方法，其特征在于，所述磁力搅拌器的转速250-500r/min；离心机的转速为10000-15000r/min。
6.如权利要求1所述的PDA@PAMAM复合纳米材料的制备方法，其特征在于，所述PDA@PAMAM复合纳米材料表面用PVP进行修饰。
7.如权利要求6所述的PDA@PAMAM复合纳米材料的制备方法，其特征在于，所述修饰的方法为：将所述PDA@PAMAM复合纳米材料置于PVP溶液中。
8.如权利要求7所述的PDA@PAMAM复合纳米材料的制备方法，其特征在于，所述PVP溶液的质量浓度为1％。
9.权利要求1-8任意一项所述的PDA@PAMAM复合纳米材料的制备方法所制备的PDA@PAMAM复合纳米材料的应用，其特征在于，利用光热转换能力，在所述PDA@PAMAM复合纳米材料上负载药物或基因，随着温度的局部升高，肿瘤细胞被灭杀。
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