CN111212663A - 具有突变的cd28共刺激性结构域的嵌合抗原受体 - Google Patents

Abstract

本文公开可与过继性细胞转移一起使用以靶向和杀死癌症的嵌合抗原受体(CAR)多肽，包含具有例如通过减少CAR‑T细胞衰竭来增强CAR‑T细胞功能的CD28的细胞质结构域的突变形式的共刺激信号传导区域。还公开被工程化以表达这些CAR的免疫效应子细胞，例如T细胞或自然杀伤(NK)细胞。因此，还公开向患有肿瘤相关的抗原表达的癌症的受试者提供抗肿瘤免疫力的方法，所述方法涉及被工程化以表达公开的CAR的所公开的免疫效应子细胞的过继转移。

Description

具有突变的CD28共刺激性结构域的嵌合抗原受体

相关申请的交叉引用

本申请要求2017年7月7日提交的美国临时申请号62/529,919的优先权，其全部内容通过引用合并于此。

序列表

本申请包含以电子形式提交的序列表，该序列表是在2018年7月7日创建的名为“320803_2160_序列表_ST25”的ASCII.txt文件。序列表的内容全文并入本文。

背景技术

手术、放射疗法和化学疗法已成为治疗包括白血病、实体瘤和转移癌在内的癌症的标准方法。作为常规癌症治疗的辅助手段，已经研究直接或间接利用人体免疫系统来缩小或根除癌症的免疫疗法(有时称为生物疗法、生物治疗法或生物反应调节剂疗法)。人们认为，人类免疫系统是用于癌症治疗的未开发资源，一旦正确利用免疫系统的组成部分，就可以开发出有效的治疗方法。

抗癌T细胞疗法的一项重大进步是嵌合抗原受体(CAR)，它是一种单链可变片段(scFv)，其衍生自与T细胞受体(TCR)信号信号结构域融合的抗体(Davila,M.L.,et al.,Oncoimmunology,2012.1(9):1577-1583)。第一代CAR的细胞内结构域仅包含CD3δ，而第二代CAR也包括共刺激性结构域，例如CD28或41BB。这些第二代CAR结构域支持在小鼠中高效杀死肿瘤，并导致对患者的CAR T细胞疗法进行临床评估。据报道，针对B19急性淋巴细胞白血病(B-ALL)的患者，其完全缓解率达到90％，从而证实靶向CD19的CAR T细胞的潜力(Davila,M.L.,et al.,Sci Transl Med,2014.6(224):224ra25；Maude,S.L.,et al.,NEngl J Med,2014.371(16):1507-17)。然而，不良的CAR T细胞持久性和过度的T细胞活化分别导致复发和严重的毒性，这表明了解CAR T细胞生物学的关键需求(Gangadhar,T.C.and R.H.Vonderheide,Nat Rev Clin Oncol,2014.11(2):91-9)。此外，在所有第二代CAR中都发现了复发和毒性，这表明在CAR中添加共刺激性结构域可提高疗效，但以生物并发症为代价。

发明概述

如本文所公开的，具有CD28共刺激性结构域的CAR T细胞在CM细胞中倾向于低水平的强直信号和耗尽表型，并且突变某些CD28亚结构域不能消除CAR信号或细胞因子的产生。因此，可以通过调节CD28共刺激来改善第二代CAR T细胞功能。

本文公开可与过继性细胞转移一起使用以靶向和杀死癌症的嵌合抗原受体(CAR)多肽。公开的CAR包括共刺激性信号传导区域，该共刺激性信号传导区域包括增强CAR-T细胞功能的CD28的细胞质结构域的突变形式。在一些实施方案中，突变形式减少CAR-T细胞的衰竭。CD28结构域包括调节TCR刺激后的信号传导途径的3个细胞内亚结构域(YMNM(SEQ IDNO:1)、PRRP(SEQ ID NO:2)和PYAP(SEQ ID NO:3))。在一些实施方案中，公开的CAR包括增强CAR-T细胞功能(例如减少CAR-T细胞衰竭)的这些亚结构域中一个或多个的突变或缺失。在一些实施方案中，CAR多肽还包括增强CAR T细胞功能的CD3δ和/或41BB中的一种或多种缺失或突变。

至于其他CAR，公开的CAR多肽在胞外结构域中包含配体结合结构域，例如可以结合表达肿瘤相关抗原(TAA)的癌细胞的试剂。公开的多肽还可以包含能够激活免疫效应子细胞的跨膜结构域和胞内结构域。例如，胞内结构域可以包含细胞内信号传导结构域和任选的一个或多个共刺激信号传导区域。

配体结合结构域，例如抗TAA结合剂在一些实施方案中是特异性结合TAA的抗体片段。例如，抗原结合结构域可以是特异性结合TAA的抗体的Fab或单链可变片段(scFv)。在一些实施方案中，抗TAA结合剂是特异性结合TAA的适体。例如，抗TAA结合剂可以是基于其结合TAA的能力选自随机序列库的肽适体。抗TAA结合剂也可以是TAA的天然配体，或其能够结合TAA的变体和/或片段。

在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域是CD3 zeta(CD3δ)信号传导结构域。在某些情况下，共刺激性信号传导区域包含一个或多个细胞内信号传导分子的1、2、3或4个细胞质结构域。

还公开编码所公开的CAR多肽的分离的核酸序列、包含这些分离的核酸的载体和包含这些载体的细胞。例如，细胞可以是选自下列的免疫效应子细胞：αβT细胞、γδT细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、B细胞、先天淋巴样细胞(ILC)、细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞和调节性T细胞。

在一些实施方案中，当CAR的抗原结合结构域与肿瘤上的TAA结合时，细胞就会表现出抗肿瘤免疫力。

还公开一种在患有TAA-表达性癌症的受试者中提供抗肿瘤免疫力的方法，包括向所述受试者施用有效量的使用包含突变的CD28共刺激性结构域的公开的TAA-特异性CAR来遗传修饰的免疫效应子细胞。

本发明的一个或多个实施例的细节在下面的附图和描述中阐明。通过说明书和附图以及权利要求书，本发明的其他特征、目的和优点将变得显而易见。

附图简述

图1是抗小鼠CD19CAR构建体的示意图。逆转录病毒构建体包括具有CD8铰链(H)和跨膜结构域(TM)的抗mCD19 scFv(VH/VL)，其后是CD28(m1928z)或41BB(m19-musBBz)和单独的CD3δ或CD3δ(m19z)。阴性对照CAR不包含信号传导结构域(m19Δz)。G/S是甘氨酸-丝氨酸接头。CAR被标记到荧光蛋白报道分子(GFP或Cherry)上。LTR是长末端重复序列SD是剪接供体，SA是剪接受体，y是包装信号。

图2A是在Nur77^GFP衍生的CAR T细胞中支持CAR信号传导的CD28亚结构域突变的示意图。显示了被AAAA(SEQ ID NO：4)取代的YMNM(SEQ ID NO：1)、PRRP(SEQ ID NO：2)和PYAP(SEQ ID NO：3)序列。图2B是柱状图，显示了用3T3-mCD19刺激的Nur77^GFP(百分比GFP+)CD19靶向的CAR T细胞。刺激后24小时，通过流式细胞术评估Nur77^GFP。

图3A和3B是柱状图，显示了用表达小鼠CD19的3T3细胞(3T3-mCD19)刺激CD28亚结构域突变体CD19靶向的CAR T细胞后IFN-γ(图3A)和IL-2(图3B)的分泌。图3C和3D是显示通过流式细胞术评估的CM和EM子集的条形图。

图4是显示CD28突变的CAR T细胞和非突变的CAR T细胞的生存力的图。从野生型C57BL/6小鼠产生CAR T细胞，并在自动细胞计数器(BIO-RAD)上通过台盼蓝染色测量细胞活力。

图5是显示CD28突变CAR T细胞和未突变CAR T细胞增殖的图。从野生型C57BL/6小鼠产生CAR T细胞，并在第5天通过从初始细胞数到最终细胞产量的倍数变化来评估增殖。

图6A至图6D是柱状图，显示了由突变和未突变的CAR T细胞产生的IFN-γ(图6A)、IL-6(图6B)、IL-12(图6C)和TNF-α(图6D)。CAR T细胞被3T3-mCD19细胞以10:1的比例激活。24小时后，收集上清液，并通过Luminex试剂盒测量细胞因子。

图7A和7B是显示与3T3-mCD19靶细胞以10:1或1:6比例共培养的CD28突变和非突变的CAR T细胞对靶细胞的杀伤图。通过RTCA监测靶细胞的杀死。

图8A至8H是显示体内B细胞杀伤(图8A、8C、8E、8G)和CAR T细胞计数(图8B、8D、8F、8H)的图。1x10⁶ CAR T细胞(CD3+CAR+)经静脉注射到cytoxan(300mg/kg)预处理的野生型C57BL/6小鼠中。在第1周(图8A、8B)、2(图8C、8D)、4(图8E、8F)和6(图8G、8H)放血，并通过流式细胞仪分析B细胞和CAR T细胞计数。

图9A至9D是显示骨髓(图9A和9B)和脾脏(图9C和9D)中B细胞杀伤(图9A和9C)和CAR T细胞计数(图9B和9D)的图。1x10⁶CAR T细胞(CD3+CAR+)经静脉注射到cytoxan(300mg/kg)预处理的野生型C57BL/6小鼠中。在第8周，收集骨髓和脾脏，并通过流式细胞术分析B细胞和CAR T细胞计数。

图10是显示用CAR T细胞治疗后具有Eu-ALL肿瘤的小鼠的存活的图。注射Eu-ALL细胞六天后，对野生型C57BL/6小鼠进行腹膜内注射cytoxan(300mg/kg)后，于1天后静脉注射3x10⁵ CAR T细胞。

图11A和11B是显示CD28突变的和未突变的CAR T细胞的增殖(图11A)和生存力(图11B)的图。从正常的供体PBMC产生CAR T细胞，并在自动细胞计数器(BIO-RAD)上通过台盼蓝染色测量细胞活力。通过在第5天从初始细胞数到最终细胞产量的倍数变化来评估增殖。

图12是显示人CAR T细胞在体外增殖的图。在第5天，以10：1的比例将1x10⁵个人CAR T细胞与3T3-hCD19细胞共培养，并测量细胞数，持续10天。

图13是显示人mut06 CAR T细胞杀伤以及未突变的CAR T细胞的图。CAR T细胞与3T3-hCD19靶细胞以5：1的比例共培养。通过RTCA监测靶细胞的杀死。

发明详述

本文公开了可以特异性识别癌症上的肿瘤相关抗原(TAA)的嵌合抗原受体(CAR)，所述癌症包含CD28的细胞质结构域的突变形式，其减少了CAR-T细胞的衰竭。还公开了经工程改造以表达这些CAR的免疫效应子细胞，例如T细胞或自然杀伤(NK)细胞。因此，还公开了用于在患有表达TAA的癌症的受试者中提供抗肿瘤免疫的方法，其涉及被工程改造以表达所公开的CAR的所公开的免疫效应子细胞的过继转移。

具有突变的CD28结构域的嵌合抗原受体(CAR)

CAR通常包含来自单克隆抗体(mAb)的单链可变片段(scFv)的抗原识别结构域，该抗体具有跨膜信号转导基元，参与淋巴细胞活化(Sadelain M等人，Nat Rev Cancer 2003：35-45)。本文公开了一种嵌合抗原受体(CAR)，其可以在免疫效应子细胞中表达以增强针对癌症的抗肿瘤活性。

所公开的CAR通常由三个结构域组成：胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域。胞外结构域包含TAA结合区并负责抗原识别。它还任选包含信号肽(SP)，以便CAR可以被糖基化并锚定在免疫效应子细胞的细胞膜中。跨膜结构域(TD)顾名思义，将胞外结构域连接到胞内结构域，并在细胞表达时位于细胞膜内。胞内结构域是CAR的业务端，在抗原识别后将激活信号传输至免疫效应子细胞。例如，胞内结构域可以包含细胞内信号传导结构域(ISD)和共刺激信号传导区域(CSR)。

所公开的CAR具有包含减少CAR-T细胞衰竭的突变形式的CD28的CSR。CD28结构域包括3个胞内亚结构域(YMNM(SEQ ID NO：1)、PRRP(SEQ ID NO：2)和PYAP(SEQ ID NO：3))，它们调节TCR刺激后的信号通路。在一些实施方案中，所公开的CAR包含一个或多个这些亚结构域的突变或缺失。

在一些实施方案中，公开的CAR由下式限定：

SP–TAA–HG–TM–CSR–ISD；

其中“SP”表示任选的信号肽,

其中“TAA”表示TAA-结合区域,

其中“HG”表示任选的铰链结构域,

其中“TM”表示跨膜结构域,

其中“CSR”表示共刺激信号传导区域,

其中“ISD”表示细胞内信号传导结构域，和

其中“–”表示肽键或接头。

另外的CAR构建体描述于例如Fresnak AD,et al.Engineered T cells:thepromise and challenges of cancer immunotherapy.Nat Rev Cancer.2016 Aug 23；16(9):566-81，通过引用将其全部内容并入这些CAR模型的教学。

例如，该汽车可以是TRUCK、通用CAR、自动驾驶CAR、Armored CAR、自毁CAR、条件CAR、标记CAR、TenCAR、双CAR或sCAR。

TRUCK(重新定向用于杀死细胞因子的T细胞)共表达嵌合抗原受体(CAR)和抗肿瘤细胞因子。细胞因子表达可以是组成性的或由T细胞活化诱导的。以CAR特异性为目标，促炎性细胞因子的局部产生将内源性免疫细胞募集到肿瘤部位，并可能增强抗肿瘤反应。

通用的同种异体CAR T细胞经过工程改造，不再表达内源性T细胞受体(TCR)和/或主要组织相容性复合体(MHC)分子，从而分别预防了移植物抗宿主病(GVHD)或排斥。

自动驾驶CAR共表达CAR和趋化因子受体，后者与肿瘤配体结合，从而增强肿瘤归巢。

经过工程改造以抵抗免疫抑制的CAR T细胞(Armored CAR)可以进行基因修饰，使其不再表达各种免疫检查点分子(例如，细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA4)或程序性细胞死亡蛋白1(PD1))，可以与免疫检查点转换受体结合使用，也可以与阻断免疫检查点信号传导的单克隆抗体一起使用。

可以使用通过电穿孔递送的RNA来设计自毁CAR，以编码CAR。备选地，可以基于更昔洛韦与基因修饰的淋巴细胞中的胸苷激酶结合或者更近期描述的通过小分子二聚体激活人胱天蛋白酶9的系统来实现T细胞的诱导性凋亡。

默认情况下，条件CAR T细胞无反应或“关闭”，直到添加小分子以完成电路，从而能够完全转导信号1和信号2，从而激活CAR T细胞。或者，可以改造T细胞以表达对后续针对靶抗原的第二抗体具有亲和力的衔接子特异性受体。

标记的CAR T细胞表达CAR加上现有单克隆抗体与之结合的肿瘤表位。在无法忍受的不良反应中，单克隆抗体的施用清除了CAR T细胞并减轻了症状，而没有其他的肿瘤外作用。

串联CAR(TanCAR)T细胞表达由两个连接的单链可变片段(scFv)组成的单个CAR，这些片段具有与细胞内共刺激结构域和CD3δ结构域融合的不同亲和力。仅当靶细胞共表达两个靶标时，才能实现TanCAR T细胞活化。

双CAR T细胞表达两个具有不同配体结合靶标的独立CAR；一个CAR仅包含CD3δ域，另一个CAR仅包含共刺激结构域。双CAR T细胞活化需要在肿瘤上共表达两个靶标。

安全CAR(sCAR)由融合至细胞内抑制结构域的细胞外scFv组成。共表达标准CAR的sCAR T细胞仅在遇到具有标准CAR靶标但缺乏sCAR靶标的靶细胞时才被激活。

所公开的CAR的抗原识别结构域通常是scFv。但是，有很多选择。已经描述了来自天然T细胞受体(TCR)α和β单链的抗原识别结构域，具有简单的胞外结构域(例如CD4胞外结构域以识别感染HIV的细胞)和更多的外来识别组分，例如连接的细胞因子(这导致识别带有细胞因子受体的细胞)。实际上，几乎任何以高亲和力结合给定靶标的东西都可以用作抗原识别区域。

胞内结构域是CAR的业务端，在抗原识别后，该端将信号传递给免疫效应子细胞，从而激活免疫效应子细胞的至少一种正常效应功能。T细胞的效应子功能例如可以是细胞溶解活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。因此，胞内结构域可以包含T细胞受体(TCR)和任选的共受体的“细胞内信号传导结构域”。尽管通常可以使用整个细胞内信号传导结构域，但在许多情况下，不必使用整个链。就使用细胞内信号传导结构域的截短部分而言，只要其转导效应子功能信号，就可以使用该截短部分代替完整链。

调节以刺激方式起作用的调节TCR复合物的初次激活的细胞质信号转导序列可以包含信号转导基序，其被称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)。包含ITAM的胞质信号序列的例子包括衍生自CD8、CD3δ、CD3δ、CD3γ、CD3ε、CD32(Fc gamma RIIa)、DAP10、DAP12、CD79a、CD79b、FcγRIγ、FcγRIIIγ、FcεRIβ(FCERIB)和FcεRIγ(FCERIG)的那些。

在特定的实施方案中，细胞内信号传导结构域衍生自CD3δ(CD3δ)(TCRδ，GenBank登记号BAG36664.1)。T细胞表面糖蛋白CD3 zeta(CD3δ)链，也称为T细胞受体T3 zeta链或CD247(分化簇247)，是一种在人类中由CD247基因编码的蛋白质。

第一代CAR通常具有CD3δ链的胞内结构域，这是来自内源TCR的信号的主要发送者。第二代CAR将来自各种共刺激蛋白受体(例如CD28、41BB，ICOS)的细胞内信号传导结构域添加到CAR的胞内结构域，以向T细胞提供其他信号。临床前研究表明，第二代CAR设计可改善T细胞的抗肿瘤活性。最近，第三代CAR结合了多个信号传导结构域，以进一步增强效能。移植了这些CAR的T细胞已显示出改善的扩增、激活、持久性和根除肿瘤的效率，而与协同刺激受体/配体的相互作用无关(Imai C,et al.Leukemia 2004 18:676–84；Maher J,etal.Nat Biotechnol 2002 20:70–5)。

例如，可以将CAR的胞内结构域设计成单独包含CD3δ信号传导结构域，或者与在本发明的CAR的背景下有用的任何其他期望的细胞质结构域组合。例如，CAR的细胞质结构域可包含CD3δ链部分和共刺激信号传导区域。共刺激信号传导区域是指CAR的一部分，其包含共刺激分子的胞内结构域。共刺激分子是淋巴细胞对抗原的有效应答所需要的除抗原受体或其配体以外的细胞表面分子。这种分子的例子包括CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、和与CD83、CD8、CD4、b2c、CD80、CD86、DAP10、DAP12、MyD88、BTNL3和NKG2D特异性结合的配体。因此，虽然CAR主要以CD28作为共刺激信号元件示例，但是其他共刺激元件可以单独使用或与其他共刺激信号元件组合使用。

在一些实施方案中，CAR包含铰链序列。铰链序列是促进抗体柔性的氨基酸的短序列(参见，例如，Woof等人，Nat.Rev.Immunol.,4(2):89-99(2004))。铰链序列可以位于抗原识别部分和跨膜结构域之间。铰链序列可以是从任何合适的分子衍生或获得的任何合适的序列。在一些实施方案中，例如，铰链序列衍生自CD8a分子或CD28分子。

跨膜结构域可以源自天然或合成来源。如果来源是天然的，则该结构域可源自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。例如，跨膜区域可以衍生自(即至少包含的跨膜区域)T细胞受体的α、β或zeta链、CD28、CD3 epsilon、CD45、CD4、CD5、CD8(例如CD8α、CD8β)、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、或者CD154、KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1(CD11a、CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD160、CD19、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR和PAG/Cbp。或者，跨膜结构域可以是合成的，在这种情况下，其将主要包含疏水性残基，例如亮氨酸和缬氨酸。在某些情况下，在合成跨膜结构域的每个末端会发现三联体苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸。短的寡核苷酸或多肽接头，例如长度在2至10个氨基酸之间，可形成CAR的跨膜结构域和内质结构域之间的连接。

在一些实施方案中，CAR具有一个以上的跨膜结构域，其可以是相同跨膜结构域的重复，或可以是不同的跨膜结构域。

在一些实施方案中，CAR是多链CAR，如WO2015/039523中所述，该教导通过引用并入本文。多链CAR可以在不同的跨膜多肽中包含分开的细胞外配体结合和信号传导结构域。信号传导结构域可以设计成在近膜位置组装，从而形成更接近自然受体的灵活结构，从而实现最佳信号转导。例如，多链CAR可以包含FCERIα链的一部分和FCERIβ链的一部分，使得FCERI链自发地二聚在一起以形成CAR。

表1和表2提供了可以在公开的CAR中出现的TAA结合区域、共刺激信号传导区域和细胞内信号传导结构域的一些示例组合。

在一些实施方案中，抗TAA结合剂是单链可变片段(scFv)抗体。抗TAA scFv的亲和力/特异性在很大程度上由重(V_H)和轻(V_L)链中互补决定区(CDR)中的特定序列驱动。每个V_H和V_L序列将具有三个CDR(CDR1、CDR2、CDR3)。

在一些情况下，抗TAA结合剂是亲和力成熟的scFv。在某些情况下，抗TAA的TAA解离常数(K_D)小于50nM、40nM、30nM、25nM、20nM、15nM或10nM。

在一些实施方案中，抗TAA结合剂衍生自天然抗体，例如单克隆抗体。在某些情况下，抗体是人的。在某些情况下，当施用于人类时，抗体发生了改变，使其免疫原性降低。例如，改变包括选自嵌合、人源化、CDR-移植、脱免疫和构架氨基酸突变以对应于最接近的人种系序列的一种或多种技术。

肿瘤抗原是由肿瘤细胞产生的蛋白质，其引起免疫反应，特别是T细胞介导的免疫反应。额外的抗原结合结构域可以是肿瘤抗原的抗体或天然配体。其他抗原结合结构域的选择将取决于要治疗的癌症的特定类型。肿瘤抗原是本领域众所周知的，并且包括例如神经胶质瘤相关抗原、癌胚抗原(CEA)、EGFRvIII、IL-IIRa、IL-13Ra、EGFR、FAP、B7H3、Kit、CALX、CS-1、MUC1、BCMA、bcr-abI、HER2、β-人绒毛膜促性腺激素、甲胎蛋白(AFP)、ALK、CD19、CD123、细胞周期蛋白BI、凝集素反应性AFP、Fos相关抗原1、ADRB3、甲状腺球蛋白、EphA2、RAGE-1、RUI、RU2、SSX2、AKAP-4、LCK、OY-TESI、PAX5、SART3、CLL-1、岩藻糖基GM1、GloboH、MN-CA IX、EPCAM、EVT6-AML、TGS5、人类端粒酶逆转录酶、丙酸、PLAC1、RUI、RU2(AS)、肠道羧基酯酶、lewisY、sLe、LY6K、mut hsp70-2、M-CSF、MYCN、RhoC、TRP-2、CYPIBI、BORIS、蛋白酶，前列腺特异性抗原(PSA)、PAX3、PAP、NY-ESO-1、LAGE-la、LMP2、NCAM、p53、p53突变体、Ras突变体、gplOO、prostein、OR51E2、PANX3、PSMA、PSCA、Her2/neu、hTERT、HMWMAA、HAVCR1、VEGFR2、PDGFR-β、survivin和端粒酶、legumain、HPV E6、E7、精子蛋白17、SSEA-4、酪氨酸酶、TARP、WT1、前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1)、ML-IAP、MAGE、MAGE-A1、MAD-CT-1、MAD-CT-2、MelanA/MART 1、XAGE1、ELF2M、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、中性粒细胞弹性蛋白酶、肉瘤易位断点、NY-BR-1、ephnnB2、CD20、CD22、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44v6、CD97、CD171、CD179a、雄激素受体、FAP、胰岛素生长因子(IGF)-I、IGFII、IGF-I受体、GD2、邻乙酰基-GD2、GD3、GM3、GPRC5D、GPR20、CXORF61、叶酸受体(FRa)、叶酸受体β、ROR1、Flt3、TAG72、TN Ag、Tie 2、TEM1、TEM7R、CLDN6、TSHR、UPK2和间皮素。在一个优选的实施方案中，肿瘤抗原选自叶酸受体(FRa)、间皮素、EGFRvIII、IL-13Ra、CD123、CD19、CD33、BCMA、GD2、CLL-1、CA-IX、MUCl、HER2及其任何组合。

肿瘤抗原的非限制性实例包括以下：分化抗原例如酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2和肿瘤特异性多谱系抗原例如MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、pi 5；过度表达的胚胎抗原，例如CEA；过度表达的癌基因和突变的肿瘤抑制基因，例如p53、Ras、HER-2/neu；染色体易位导致的独特肿瘤抗原；如BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR；病毒抗原，例如爱泼斯坦巴尔病毒抗原EBVA和人乳头瘤病毒(HPV)抗原E6和E7。其他基于蛋白质的大型抗原包括TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、RAGE、NY-ESO、pl85erbB2、pl80erbB-3、c-met、nm-23H1、PSA、CA 19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、β-连环蛋白、CDK4、Mum-1、p 15、p 16、43-9F、5T4、791Tgp72、甲胎蛋白、β-HCG、BCA225、BTAA、CA 125、CA 15-3\CA 27.29\BCAA、CA195、CA242、CA-50、CAM43、CD68\P1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733\EpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCASl、SDCCAG1 6、TA-90\Mac-2结合蛋白\亲环C相关蛋白、TAAL6、TAG72、TLP、TPS、GPC3、MUC16、LMP1、EBMA-1、BARF-1、CS1、CD319、HER1、B7H6、L1CAM、IL6和MET。

核酸和载体

还公开了编码允许在所公开的免疫效应子细胞中表达CAR的所公开的CAR的多核苷酸和多核苷酸载体。

可以使用本领域已知的重组方法，例如通过从表达该基因的细胞中筛选文库、通过从已知包含相同基因的载体中获得该基因、或者使用标准技术直接从包含相同基因的细胞和组织中分离出来，来获得编码所公开的CAR及其区域的核酸序列。或者，目的基因可以合成产生，而不是克隆。

编码CAR的核酸的表达通常是通过将编码CAR多肽的核酸可操作地连接至启动子，并将构建体整合到表达载体中来实现的。典型的克隆载体包含用于调节所需核酸序列表达的转录和翻译终止子、起始序列和启动子。

所公开的核酸可以被克隆到多种类型的载体中。例如，可以将核酸克隆到载体中，该载体包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特别感兴趣的载体包括表达载体、复制载体、探针产生载体和测序载体。

此外，表达载体可以病毒载体的形式提供给细胞。病毒载体技术是本领域众所周知的，并在例如Sambrook et al.(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory,New York)以及其他病毒学和分子生物学手册中有所描述。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体包含在至少一种生物中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制性核酸内切酶位点和一种或多种选择标记。在一些实施方案中，多核苷酸载体是慢病毒或逆转录病毒载体。

已经开发了许多基于病毒的系统用于基因转移到哺乳动物细胞中。例如，逆转录病毒为基因递送系统提供了便利的平台。可以使用本领域已知的技术将选择的基因插入载体并包装在逆转录病毒颗粒中。然后可以分离重组病毒并体内或离体递送至受试者的细胞。

合适的启动子的一个例子是立即早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列是强组成型启动子序列，能够驱动与其可操作连接的任何多核苷酸序列的高水平表达。合适的启动子的另一个例子是延伸生长因子-1α(EF-1α)。然而，也可以使用其他组成型启动子序列，包括但不限于猿猴病毒40(SV40)早期启动子、MND(骨髓增生肉瘤病毒)启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、禽白血病病毒启动子、爱泼斯坦-巴尔病毒立即早期启动子、劳斯肉瘤病毒启动子以及人类基因启动子，例如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。启动子可以替代地是诱导型启动子。诱导型启动子的实例包括但不限于金属硫氨酸启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。

另外的启动子元件，例如增强子，调节转录起始的频率。通常，它们位于起始位点上游30-110bp的区域，尽管最近已显示许多启动子也包含起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔通常是灵活的，因此当元件相对于彼此反转或移动时，启动子功能得以保留。

为了评估CAR多肽或其部分的表达，导入细胞的表达载体还可以包含选择标记基因或报告基因，或同时包含两者，以促进从试图通过病毒载体进行转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。在其他方面，选择标记可以携带在单独的DNA片段上并用于共转染程序。选择标记和报告基因都可以带有合适的调控序列，以使其在宿主细胞中表达。有用的选择标记包括例如抗生素抗性基因。

报告基因用于鉴定潜在转染的细胞和评估调节序列的功能。通常，报告基因是在受体生物体或组织中不存在或不表达的基因，并且编码其表达通过一些易于检测的性质例如酶活性表现出来的多肽的基因。在将DNA引入受体细胞后的合适时间测定报告基因的表达。合适的报道基因可以包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌的碱性磷酸酶或绿色荧光蛋白基因的基因。合适的表达系统是众所周知的，并且可以使用已知技术制备或从商业上获得。通常，将具有最小5'侧翼区域并显示最高水平的报道基因表达的构建体鉴定为启动子。这样的启动子区域可以与报道基因连接，并用于评估试剂调节启动子驱动的转录的能力。

将基因引入细胞并表达到细胞中的方法是本领域已知的。在表达载体的情况下，可以通过本领域中的任何方法将载体容易地引入宿主细胞，例如哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，可以通过物理、化学或生物学手段将表达载体转移到宿主细胞中。

用于将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔等。产生包含载体和/或外源核酸的细胞的方法是本领域众所周知的。参见，例如，Sambrook等人(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory,New York)。

用于将目的多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，尤其是逆转录病毒载体，已成为将基因插入哺乳动物例如人细胞的最广泛使用的方法。

用于将多核苷酸引入宿主细胞的化学方法包括胶体分散系统，例如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠和基于脂质的系统，包括水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体。在体外和体内用作递送载体的示例性胶体系统是脂质体(例如人工膜囊泡)。

在使用非病毒递送系统的情况下，示例性的递送载体是脂质体。在另一方面，核酸可以与脂质缔合。可以将与脂质相关的核酸封装在脂质体的水性内部中、散布在脂质体的脂质双层中、并通过与脂质体和寡核苷酸都结合的连接分子与脂质体连接、包裹在脂质体中、与脂质体复合、分散在含脂质的溶液中、与脂质混合、与脂质混合、作为脂质的悬浮液包含在脂质中、或与胶束复合或与脂质结合。脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体相关的组合物不限于溶液中的任何特定结构。例如，它们可以双层结构，胶束或“塌陷”结构存在。它们也可以简单地散布在溶液中，可能形成大小或形状不均匀的聚集体。脂质是可以是天然脂质或合成脂质的脂肪物质。例如，脂质包括天然存在于细胞质中的脂肪滴以及包含长链脂族烃及其衍生物的一类化合物，例如脂肪酸、醇、胺、氨基醇和醛。可以从商业来源获得适合使用的脂质。例如，二肉豆蔻基磷脂酰胆碱(“DMPC”)可以从密苏里州圣路易斯的西格玛公司获得；磷酸二鲸蜡酯(“DCP”)可从K&K Laboratories(纽约州普莱恩维尤)获得；胆固醇(“Choi”)可从Calbiochem-Behring获得；二肉豆蔻基磷脂酰甘油(“DMPG”)和其他脂质可从Avanti Polar Lipids，Inc，(阿拉巴马州伯明翰)获得。

免疫效应子细胞

还公开了经工程改造以表达所公开的CAR的免疫效应子细胞(在本文中也称为“CAR-T细胞”)。这些细胞优选获自待治疗的受试者(即自体的)。然而，在一些实施方案中，使用免疫效应子细胞系或供体效应细胞(同种异体)。免疫效应子细胞可以从多种来源获得，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾脏组织和肿瘤。免疫效应子细胞可以使用本领域技术人员已知的许多技术，例如Ficoll ^TM分离，从从受试者收集的血液中获得。例如，可以通过血液分离术从个体的循环血液中获得细胞。在一些实施方案中，例如通过通过PERCOLL ^TM梯度离心或通过逆流离心淘析，通过裂解红细胞并消耗单核细胞从外周血淋巴细胞分离免疫效应子细胞。免疫效应子细胞的特定亚群可以通过阳性或阴性选择技术进一步分离。例如，可以使用针对阳性选择细胞特有的表面标记的抗体的组合来分离免疫效应子细胞，例如，通过与抗体缀合的珠子一起温育足以阳性选择所需免疫效应子细胞的时间段。备选地，可以通过使用针对负选择的细胞特有的表面标记的抗体的组合的负选择来完成免疫效应子细胞群的富集。

在一些实施方案中，免疫效应子细胞包括参与防御身体抵抗传染病和外来物质的任何白细胞。例如，免疫效应子细胞可包括淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、肥大细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞或其任何组合。例如，免疫效应子细胞可包含T淋巴细胞。

通过在细胞表面上存在T细胞受体(TCR)，可以将T细胞或T淋巴细胞与其他淋巴细胞(例如B细胞和自然杀伤细胞(NK细胞))区分开。之所以称为T细胞，是因为它们在胸腺中成熟(尽管有些也在扁桃体中成熟)。T细胞有几个子集，每个子集具有不同的功能。

T辅助细胞(T_H细胞)在免疫过程中协助其他白细胞，包括B细胞成熟为浆细胞和记忆B细胞，以及激活细胞毒性T细胞和巨噬细胞。这些细胞也称为CD4⁺T细胞，因为它们在其表面表达CD4糖蛋白。当辅助T细胞被II类MHC分子呈递肽抗原时，它们被激活，该抗原在抗原呈递细胞(APC)的表面表达。一旦激活，它们就会迅速分裂并分泌称为细胞因子的小蛋白，这些蛋白调节或协助主动免疫反应。这些细胞可以分化为几种亚型之一，包括T_H1、T_H2、T_H3、T_H17、T_H9或T_FH，它们分泌不同的细胞因子以促进不同类型的免疫应答。

细胞毒性T细胞(T_C细胞或CTL)破坏病毒感染的细胞和肿瘤细胞，并且也与移植排斥反应有关。这些细胞也被称为CD8⁺T细胞，因为它们在其表面表达CD8糖蛋白。这些细胞通过结合存在于所有有核细胞表面的与MHC I类分子相关的抗原来识别其靶标。通过IL-10、腺苷和调节性T细胞分泌的其他分子，CD8⁺细胞可以失活为一种无反应状态，从而可以预防自身免疫性疾病。

记忆T细胞是抗原特异性T细胞的一个子集，在感染消退后会长期存在。重新暴露于相关抗原后，它们会迅速扩增为大量效应T细胞，从而为免疫系统提供抵抗过去感染的“记忆”。存储单元可以是CD4⁺或CD8⁺。记忆T细胞通常表达细胞表面蛋白CD45RO。

调节性T细胞(T_reg细胞)，以前称为抑制性T细胞，对于维持免疫耐受性至关重要。它们的主要作用是在免疫反应结束时关闭T细胞介导的免疫力，并抑制逃避胸腺中负选择过程的自身反应性T细胞。已经描述了CD4⁺T_reg细胞的两大类-天然存在的T_reg细胞和适应性T_reg细胞。

自然杀伤T(NKT)细胞(不要与自然杀伤(NK)细胞混淆)将适应性免疫系统与先天免疫系统联系在一起。与识别主要组织相容性复合物(MHC)分子呈递的肽抗原的常规T细胞不同，NKT细胞识别由CD1d分子呈递的糖脂抗原。

在一些实施方案中，T细胞包含CD4⁺细胞的混合物。在其他实施方案中，基于细胞表面表达使T细胞富集一个或多个亚群。例如，在某些情况下，T包括细胞毒性CD8⁺T淋巴细胞。在一些实施方案中，T细胞包括γδT细胞，其具有独特的T细胞受体(TCR)，所述T细胞受体具有一条γ链和一条δ链而不是α和β链。

自然杀伤(NK)细胞是CD56⁺CD3^–大颗粒淋巴细胞，可以杀死被病毒感染和转化的细胞，并构成先天免疫系统的关键细胞亚群(Godfrey J等人，Leuk Lymphoma 2012 53：1666-1676)。与细胞毒性CD8⁺T淋巴细胞不同，NK细胞无需事先敏化即可对肿瘤细胞产生细胞毒性，并且还可以根除MHC-I-阴性细胞(Narni-Mancinelli E,et al.Int Immunol 2011 23:427–431)。NK细胞是更安全的效应细胞，因为它们可以避免细胞因子风暴(Morgan RA,etal.Mol Ther 2010 18:843–851)、肿瘤溶解综合征(Porter DL,et al.N Engl J Med 2011365:725–733)和靶标、非肿瘤效应的潜在致命性并发症。尽管NK细胞作为癌细胞的杀手具有众所周知的作用，并且已经广泛地证明NK细胞损伤对于MM的进展至关重要(Godfrey J,et al.Leuk Lymphoma 2012 53:1666–1676；Fauriat C,et al.Leukemia 2006 20:732–733)，在公开的CAR之前，很大程度上尚未探索可以增强NK细胞介导的抗MM活性的方法。

治疗方法

表达所公开的CAR的免疫效应子细胞可以引起针对表达TAA的癌细胞的抗肿瘤免疫应答。由公开的CAR修饰的免疫效应子细胞引起的抗肿瘤免疫应答可以是主动或被动免疫应答。此外，CAR介导的免疫反应可能是过继免疫疗法方法的一部分，在该方法中，CAR修饰的免疫效应子细胞可诱导针对TAA的免疫反应。

表达嵌合抗原受体的免疫效应子细胞的过继转移是一种有前途的抗癌治疗剂。收集患者的免疫效应子细胞后，可以对其进行基因工程改造以表达所披露的CAR，然后再注入患者体内。

所公开的CAR修饰的免疫效应子细胞可以单独施用，或者作为药物组合物与稀释剂和/或与其他成分例如IL-2、IL-15或其他细胞因子或细胞群组合施用。简而言之，药物组合物可包含与一种或多种药学或生理学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂组合的如本文所述的靶细胞群。这样的组合物可以包含缓冲剂，例如中性缓冲盐溶液、磷酸盐缓冲盐溶液等；碳水化合物，例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸，例如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，例如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如氢氧化铝)；和防腐剂。在一些实施方案中，用于公开方法的组合物被配制用于静脉内给药。药物组合物可以以适合治疗MM的任何方式施用。尽管可以通过临床试验确定适当的剂量，但是给药的量和频率将由诸如患者的状况和患者疾病的严重性等因素来确定。

当指示“免疫学有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤抑制有效量”或“治疗量”时，医师可以考虑年龄、体重、肿瘤大小、感染或转移的程度以及患者的状况(个体)的个体差异来确定要给予的本发明组合物的精确量。通常可以指出，包含本文所述的T细胞的药物组合物可以10⁴至10⁹个细胞/kg体重的剂量施用，例如10⁵至10⁶个细胞/kg体重，包括那些范围内的所有整数值。T细胞组合物也可以这些剂量多次给药。可以通过使用免疫疗法中公知的输注技术来施用细胞(参见，例如，Rosenberg等人，New Eng.J.Med.319：1676，1988)。通过监测患者的疾病征兆并相应地调整治疗，医学领域的技术人员可以容易地确定针对特定患者的最佳剂量和治疗方案。

在某些实施方案中，可能期望向受试者施用活化的T细胞，然后随后重新抽血(或进行采血)，根据公开的方法从中活化T细胞，并向患者重新注入这些活化和扩增的T细胞。此过程可以每几周执行多次。在某些实施方案中，可以从10cc至400cc的抽血激活T细胞。在某些实施方案中，从20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc或100cc的抽血激活T细胞。使用该多次抽血/多次回输方案可以用于选择某些T细胞群。

所公开的组合物的施用可以以任何方便的方式进行，包括通过注射、输血或植入。本文所述的组合物可以通过静脉内(i.v.)注射或腹膜内，皮下、皮内、肿瘤内、结节内、髓内、肌内给予患者。在一些实施方案中，所公开的组合物通过皮内或皮下注射施用于患者。在一些实施方案中，所公开的组合物通过静脉内注射给药。也可以将组合物直接注射到肿瘤、淋巴结或感染部位。

在某些实施方案中，将所公开的CAR修饰的免疫效应子细胞与多种相关治疗方式联合施用(例如，之前、同时或之后)给患者，所述相关治疗方式包括但不限于沙利度胺、地塞米松、硼替佐米和来那度胺。在其他实施方案中，CAR修饰的免疫效应子细胞可以与化学疗法、放射疗法、免疫抑制剂(例如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸酯和FK506)、抗体或其他免疫消除剂，例如CAM PATH、CD3抗体或其他抗体疗法、细胞毒素、氟达立滨、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸、类固醇、FR901228、细胞因子和辐射结合使用。在一些实施方案中，将CAR修饰的免疫效应子细胞与骨髓移植，使用化学治疗剂例如氟达拉滨、外部束放射治疗(XRT)、环磷酰胺或抗体如OKT3或CAMPATH等的T细胞消融疗法联合(例如，之前、同时或之后)给予患者。在另一个实施方案中，本发明的细胞组合物在B细胞消融治疗后施用，例如与CD20反应的药剂，例如利妥昔单抗。例如，在一些实施方案中，受试者可以接受高剂量化学疗法的标准治疗，然后进行外周血干细胞移植。在某些实施方案中，在移植后，受试者接受输注本发明的扩增的免疫细胞。在另一个实施方案中，在手术之前或之后施用扩增的细胞。

所公开的方法的癌症可以是受试者中经历失调的生长、侵袭或转移的任何表达TAA的细胞。在某些方面，癌症可以是当前对其使用放射疗法的任何肿瘤或肿瘤。或者，癌症可以是对使用标准方法对放射疗法不足够敏感的肿瘤或肿瘤。因此，癌症可以是肉瘤、淋巴瘤、白血病、癌、母细胞瘤或生殖细胞肿瘤。所公开的组合物可用于治疗的癌症的代表性但非限制性列表包括淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、蕈样真菌病、霍奇金病、髓样白血病、膀胱癌、脑癌、神经系统癌、头和颈部癌、头颈部鳞状细胞癌、肾癌、小细胞肺癌和非小细胞肺癌等肺癌、神经母细胞瘤/胶质母细胞瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、肝癌、黑素瘤、口腔、喉、喉和肺鳞状细胞癌、子宫内膜癌、宫颈癌、宫颈癌、乳腺癌、上皮癌、肾癌、泌尿生殖道癌、肺癌、食道癌、头颈癌、大肠癌、造血系统癌症；睾丸癌；结肠癌和直肠癌、前列腺癌和胰腺癌。

所公开的CAR可以与具有细胞毒性或细胞抑制作用的任何化合物、部分或基团组合使用。药物部分包括化学治疗剂，其可以充当微管蛋白抑制剂、有丝分裂抑制剂、拓扑异构酶抑制剂或DNA嵌入剂，特别是用于癌症治疗的那些。

所公开的CAR可以与检查点抑制剂组合使用。两种已知的抑制性检查点途径涉及通过细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)和程序性死亡1(PD-1)受体的信号传导。这些蛋白质是共信号传导分子CD28-B7家族的成员，它们在T细胞功能的所有阶段均起重要作用。PD-1受体(也称为CD279)在活化T细胞的表面表达。它的配体PD-L1(B7-H1；CD274)和PD-L2(B7-DC；CD273)在树突状细胞或巨噬细胞等APC的表面表达。PD-L1是主要的配体，而PD-L2的表达模式则受限制得多。当配体与PD-1结合时，抑制信号会传递到T细胞中，从而减少细胞因子的产生并抑制T细胞增殖。检查点抑制剂包括但不限于阻断PD-1(Nivolumab(BMS-936558或MDX1106)、CT-011、MK-3475)、PD-L1(MDX-1105(BMS-936559)、MPDL3280A、MSB0010718C)、PD-L2(rHIgM12B7)、CTLA-4(伊匹单抗(MDX-010)、曲美单抗(CP-675,206))、IDO、B7-H3(MGA271)、B7-H4、TIM3、LAG-3(BMS-986016)的抗体。

美国专利号8,008,449描述了针对程序性死亡1的人单克隆抗体(PD-1)以及单独使用抗PD-1抗体或与其他免疫疗法组合使用的抗PD-1抗体治疗癌症的方法，这些专利通过引用并入本文。抗PD-L1抗体及其用途描述于美国专利号8,552,154中，这些专利通过引用并入本文。包含抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体的抗癌剂描述于美国专利号8,617,546中，这些专利通过引用并入本文。

在一些实施方案中，PDL1抑制剂包含特异性结合PDL1的抗体，例如BMS-936559(Bristol-Myers Squibb)或MPDL3280A(Roche)。在一些实施方案中，PD1抑制剂包含特异性结合PD1的抗体，例如lambrolizumab(Merck)、nivolumab(Bristol-Myers Squibb)或MEDI4736(AstraZeneca)。美国专利第8,008,449号描述了针对PD-1的人单克隆抗体以及单独使用抗PD-1抗体或与其他免疫疗法组合使用的抗PD-1抗体治疗癌症的方法，这些专利通过引用并入本文。抗PD-L1抗体及其用途描述于美国专利号8,552,154中，这些专利通过引用并入本文。包含抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体的抗癌剂描述于美国专利号8,617,546中，这些专利通过引用并入本文。

所公开的CAR可以与其他癌症免疫疗法组合使用。免疫疗法有两种不同的类型：被动免疫疗法使用免疫系统的成分来指导针对癌细胞的靶向细胞毒活性，而不必在患者体内引发免疫反应，而主动免疫疗法则主动触发内源性免疫反应。被动策略包括使用B细胞针对特定抗原产生的单克隆抗体(mAb)。1970年代杂交瘤技术的发展以及对肿瘤特异性抗原的鉴定使得mAb的药物开发成为可能，该mAb可以特异性靶向肿瘤细胞以被免疫系统破坏。迄今为止，单克隆抗体一直是免疫治疗领域最大的成功案例；2012年最畅销的三大抗癌药物是单克隆抗体。其中包括利妥昔单抗(Rituxan，Genentech)，它与CD20蛋白结合，该CD20蛋白在非霍奇金淋巴瘤(NHL)等B细胞恶性肿瘤的表面高度表达。利妥昔单抗已被FDA批准与化学疗法联合治疗NHL和慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。另一个重要的mAb是曲妥珠单抗(Herceptin；Genentech)，它通过靶向HER2的表达，彻底革新了HER2(人类表皮生长因子受体2)阳性乳腺癌的治疗方法。

产生最佳的“杀手”CD8 T细胞应答还需要T细胞受体激活和共刺激，这可以通过连接肿瘤坏死因子受体家族成员(包括OX40(CD134)和4-1BB(CD137))来提供。OX40特别受关注，因为使用活化(激动剂)抗OX40mAb的治疗可增强T细胞分化和细胞溶解功能，从而增强针对多种肿瘤的抗肿瘤免疫力。

在一些实施方案中，这样的另外的治疗剂可以选自抗代谢物，例如甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、氟达拉滨、5-氟尿嘧啶、去卡巴嗪、羟基脲、天冬酰胺酶、吉西他滨或克拉屈滨。

在一些实施方案中，这样的另外的治疗剂可以选自烷化剂，例如甲氯乙胺、噻硫磷、苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(BSNU)、洛莫斯汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲佐菌素、达卡巴嗪(DTIC)、丙卡巴肼、丝裂霉素C、顺铂和其他铂衍生物、如卡铂。

在一些实施方案中，这样的另外的治疗剂可以选自抗有丝分裂剂，例如紫杉烷类，例如多西紫杉醇和紫杉醇，和长春花生物碱，例如长春地辛、长春新碱、长春碱和长春瑞滨。

在一些实施方案中，这样的另外的治疗剂可以选自拓扑异构酶抑制剂，例如托泊替康或伊立替康，或细胞生长抑制药物，例如依托泊苷和替尼泊苷。

在一些实施方案中，这样的另外的治疗剂可以选自生长因子抑制剂，例如ErbB1(EGFR)的抑制剂(例如EGFR抗体，例如扎鲁单抗，西妥昔单抗，帕尼单抗或尼莫珠单抗或其他EGFR抑制剂，例如吉非替尼或厄洛替尼)，另一种ErbB2抑制剂(HER2/neu)(例如HER2抗体，例如曲妥珠单抗，曲妥珠单抗-DM l或帕妥珠单抗)或EGFR和HER2两者的抑制剂，如拉帕替尼)。

在一些实施方案中，这样的另外的治疗剂可以选自酪氨酸激酶抑制剂，例如伊马替尼(Glivec，Gleevec STI571)或拉帕替尼。

因此，在一些实施方案中，公开的抗体与奥法木单抗、zanolimumab、达雷木单抗、ranibizumab、尼妥珠单抗、帕尼单抗、hu806、达利珠单抗(Zenapax)、巴利昔单抗(Simulect)、英夫利西单抗(Remicade)、阿达木单抗(Humira)、那他珠单抗(Tysabri)、奥马珠单抗(Xolair)、依法利珠单抗(Raptiva)和/或利妥昔单抗组合使用。

在一些实施方案中，与CAR一起用于治疗上述疾病的治疗剂可以是抗癌细胞因子、趋化因子或其组合。合适的细胞因子和生长因子的实例包括IFNy、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-18、IL-23、IL-24、IL-27、IL-28a、IL-28b、IL-29、KGF、IFNa(例如INFa2b)、IFN、GM-CSF、CD40L、Flt3配体、干细胞因子、ancestim和TNFa。合适的趋化因子可包括Glu-Leu-Arg(ELR)-阴性趋化因子，例如来自人CXC和C-C趋化因子家族的IP-10、MCP-3、MIG和SDF-1a。合适的细胞因子包括细胞因子衍生物、细胞因子变体、细胞因子片段和细胞因子融合蛋白。

在一些实施方案中，与CAR一起用于治疗上述疾病的治疗剂可以是细胞周期控制/凋亡调节剂(或“调节剂”)。细胞周期控制/凋亡调节剂可包括靶向和调节细胞周期控制/凋亡调节剂的分子，例如(i)cdc-25(例如NSC 663284)，(ii)过度刺激细胞周期的依赖细胞周期蛋白的激酶(例如flavopiridol(L868275，HMR1275)，7-羟基星形孢菌素(UCN-01，KW-2401)和roscovitine(R-roscovitine，CYC202))和(iii)端粒酶调节剂(例如BIBR1532，SOT-095，GRN163)和在例如美国6,440,735和US 6,713,055中所述的组合物)。干扰细胞凋亡途径的分子的非限制性实例包括TNF相关的凋亡诱导配体(TRAIL)/凋亡2配体(Apo-2L)，激活TRAIL受体的抗体，IFN和反义Bcl-2。

在一些实施方案中，与CAR一起用于治疗上述疾病的治疗剂可以是激素调节剂，例如可用于抗雄激素和抗雌激素治疗的药物。此类激素调节剂的实例是他莫昔芬、伊多西芬、氟维司群、屈洛昔芬、托瑞米芬、雷洛昔芬、己烯雌酚、乙炔基雌二醇/雌二醇、抗雄激素药(如氟他胺/欧乐辛)、孕激素(如己酸羟孕酮、甲羟孕酮/provera、醋氨丙酯/megace)、肾上腺皮质类固醇(如氢化可的松、泼尼松)、黄体生成素释放激素(和它们的类似物和其他LHRH激动剂、例如buserelin和goserelin)、芳香酶抑制剂(例如anastrazole/arimidex、氨基谷氨酰胺/cytraden、依西美坦)或激素抑制剂(例如奥曲肽/sandostatin)。

在一些实施方案中，与CAR一起用于治疗上述疾病的治疗剂可以是抗癌核酸或抗癌抑制RNA分子。

如上所述，联合给药可以是同时、分开或顺序的。为了同时给药，所述试剂可以适当地以一种组合物或分开的组合物的形式给药。

在一些实施方案中，所公开的CAR与放射疗法联合施用。放射疗法可以包括放射或向患者提供放射性药物的相关给药。放射源可以在被治疗患者的外部或内部(放射治疗可以是例如外部束放射疗法(EBRT)或近距离放射疗法(BT)的形式)。可用于实施此类方法的放射性元素包括，例如，镭、铯137、铱192、americium-241、金198、钴57、铜67、technetium-99、碘化物123、碘化物131和铟111。

在一些实施方案中，所公开的CAR与手术结合施用。

CAR-T细胞可以几种方式设计，以增强肿瘤的细胞毒性和特异性，逃避肿瘤的免疫抑制，避免宿主排斥，并延长其治疗半衰期。例如，TRUCK(重定向T细胞以杀灭通用细胞因子)T细胞例如拥有CAR，但也经过工程改造以释放促进肿瘤杀死的细胞因子，例如IL-12。由于这些细胞被设计成一旦定位于肿瘤环境，就会在激活CAR后释放分子有效负载，因此这些CAR-T细胞有时也称为“装甲armored CAR”。临床前和临床都在研究几种细胞因子作为癌症的治疗方法，并且当类似地掺入TRUCK形式的CAR-T治疗方法时也可能有用。其中包括IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-18、M-CSF、GM-CSF、IFN-α、IFN-γ、TNF-α、TRAIL、FLT3配体、淋巴动素和TGF-β(Dranoff 2004)。“Self-driving”或“homing”CAR-T细胞经过工程改造，除了表达其CAR以外，还表达趋化因子受体。由于某些趋化因子可以在肿瘤中上调，因此趋化因子受体的结合有助于肿瘤向过继性T细胞的转运和渗透，从而增强CAR-T的特异性和功能性(Moon，2011年)。通用CAR-T细胞也具有CAR，但经过工程改造，使其不表达内源性TCR(T细胞受体)或MHC(主要组织相容性复合物)蛋白。从过继T细胞疗法的信号传导全集中除去这两种蛋白分别防止了移植物抗宿主疾病和排斥反应。Armored CAR-T细胞还具有规避肿瘤免疫抑制和肿瘤诱导的CAR-T功能低下的能力。这些特定的CAR-T具有CAR，并且可以设计成不表达检查点抑制剂。或者，可以将这些CAR-T与阻断检查点信号的单克隆抗体(mAb)共同使用。抗PDL1抗体的给药显着恢复了CAR TIL(肿瘤浸润淋巴细胞)的杀伤能力。虽然已经研究了PD1-PDL1和CTLA-4-CD80/CD86信号传导途径，但在设计armored CAR-T时可能靶向其他免疫检查点信号传导分子，包括LAG-3、Tim-3、IDO-1、2B4和KIR。TIL的其他细胞内抑制剂包括磷酸酶(SHP1)、泛素连接酶(即cbl-b)和激酶(即二酰基甘油激酶)。Armored CAR-T也可以被工程化为表达蛋白质或受体，以保护它们抵抗肿瘤分泌的细胞因子的作用或使其抵抗肿瘤分泌的细胞因子的作用。例如，用TGF-β受体的双重阴性形式转导的CTL(细胞毒性T淋巴细胞)对淋巴瘤分泌的TGF-β的免疫抑制有抵抗力。与它们的对照对应物相比，这些转导的细胞在体内显示出显着增加的抗肿瘤活性。

串联和双重CAR-T细胞的独特之处在于它们具有两个不同的抗原结合结构域。串联CAR包含面对细胞外环境的两个顺序的抗原结合结构域，其与细胞内共刺激和刺激结构域连接。对双CAR进行了工程改造，使得一个胞外抗原结合结构域与胞内共刺激结构域相连，而另一个截然不同的胞外抗原结合结构域与胞内刺激结构域相连。因为刺激结构域和共刺激结构域在两个单独的抗原结合结构域之间划分，所以双重CAR也称为“分裂CAR”。在串联和双重CAR设计中，两个抗原结合结构域的结合是必需的，以允许T细胞中的CAR电路发信号。由于这两种CAR设计对不同的独特抗原具有结合亲和力，因此它们也称为“双特异性”CAR。

CAR-T细胞作为“活性治疗剂”的一种形式，主要关注的是它们在体内的可操作性以及潜在的免疫刺激性副作用。为了更好地控制CAR-T治疗并防止不良副作用，已经设计了多种功能，包括开关、安全机制和条件控制机制。例如，自毁和标记/标记的CAR-T细胞均经过工程改造，具有“开关”功能，可促进表达CAR的T细胞的清除。自毁CAR-T包含CAR，但也经过工程改造以表达在给予外源分子后可诱导的促凋亡的自杀基因或“消除基因”。多种自杀基因可用于此目的，包括HSV-TK(单纯疱疹病毒胸苷激酶)、Fas、iCasp9(诱导型胱天蛋白酶9)、CD20、MYC标签和截短的EGFR(内皮生长因子受体)。例如，HSK会将前药更昔洛韦(GCV)转化为GCV-三磷酸酯，将其自身整合到复制DNA中，最终导致细胞死亡。iCasp9是一种嵌合蛋白，包含FK506结合蛋白的成分，该成分与小分子AP1903结合，导致caspase 9二聚化和凋亡。但是，标记/标记的CAR-T细胞既拥有CAR，又经过工程改造以表达选择标记。针对该选择标记施用mAb将促进CAR-T细胞的清除。截短的EGFR是抗EGFR mAb的此类可靶向抗原之一，西妥昔单抗的给药可促进消除CAR-T细胞。为具有这些功能而创建的CAR也称为“可交换CAR”的sCAR，以及“可调节CAR”的RCAR。工程改造“安全性CAR”，也称为“抑制性CAR”(iCAR)，以表达两个抗原结合结构域。这些细胞外结构域之一针对肿瘤相关抗原，并与细胞内共刺激和刺激结构域结合。但是，第二个细胞外抗原结合结构域对正常组织具有特异性，并与细胞内检查点结构域(例如CTLA4、PD1或CD45)结合。也可以将多个细胞内抑制结构域掺入iCAR。可能提供这些抑制结构域的一些抑制分子包括B7-H1、B7-1、CD160、PIH、2B4、CEACAM(CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG-3、TIGIT、BTLA、LAIR1和TGFβ-R。在正常组织的存在下，该第二抗原结合结构域的刺激将起到抑制CAR的作用。应当指出，由于这种双重抗原特异性，iCARs也是双特异性CAR-T细胞的一种形式。安全的CAR-T工程技术可增强CAR-T细胞对肿瘤组织的特异性，并且在某些正常组织可能表达非常低水平的肿瘤相关抗原(可能导致标准CAR导致脱靶效应)的情况下具有优势(Morgan 2010)。条件CAR-T细胞表达连接至细胞内共刺激结构域的细胞外抗原结合结构域和单独的细胞内共刺激结构。共刺激和刺激结构域序列以这样的方式进行工程化：在施用外源分子后，所得蛋白质将在细胞内汇聚在一起以完成CAR回路。通过这种方式，可以对CAR-T激活进行调制，甚至可以针对特定患者进行“微调”或个性化设置。与双重CAR设计类似，当在条件CAR中不活动时，刺激域和共刺激结构域在物理上是分开的；因此，它们也被称为“分离式CAR”。

在一些实施方案中，这些工程特征中的两个或多个可以组合在一起以创建增强的多功能CAR-T。例如，有可能使用双重或条件CAR设计创建同时释放细胞因子(如TRUCK)的CAR-T细胞。在一些实施方案中，可以制备双条件CAR-T细胞，使得其表达两个CAR，所述CAR具有针对两个不同癌症抗原的两个单独的抗原结合结构域，每个抗原结合结构域均结合至其各自的共刺激结构域。共刺激结构域仅在施用活化分子后才与刺激结构域一起起作用。为了使该CAR-T细胞有效，癌症必须表达两种癌症抗原，并且必须向患者施用激活分子；这种设计因此融合了双重和条件CAR T细胞的功能。

通常，使用α-βT细胞创建CAR-T细胞，但是也可以使用γ-δT细胞。在一些实施方案中，用于生成CAR-T细胞的所述CAR构建体、结构域和工程化特征可类似地用于生成其他类型的表达CAR的免疫细胞，包括NK(自然杀伤)细胞、B细胞、肥大细胞、骨髓来源的吞噬细胞和NKT细胞。备选地，可以创建表达CAR的细胞以具有T细胞和NK细胞的特性。在另一个实施方案中，用CAR转导的可以是自体的或同种异体的。

可以使用几种不同的CAR表达方法，包括逆转录病毒转导(包括γ-逆转录病毒)、慢病毒转导、转座子/转座酶(Sleeping Beauty和PiggyBac系统)以及Messenger RNA转移介导的基因表达。关于工程化CAR-T细胞的可能性，基因编辑(基因插入或基因缺失/破坏)也变得越来越重要。CRISPR-Cas9、ZFN(锌指核酸酶)和TALEN(转录激活剂，如效应核酸酶)系统是可以生成CAR-T细胞的三种潜在方法。

定义

术语“氨基酸序列”是指代表氨基酸残基的缩写、字母、字符或单词的列表。本文所用的氨基酸缩写是氨基酸的常规一个字母代码，并表示如下：A，丙氨酸；B，天冬酰胺或天冬氨酸；C，半胱氨酸；D天冬氨酸；E，谷氨酸，谷氨酸；F，苯丙氨酸；G，甘氨酸；H，组氨酸；I，异亮氨酸；K，赖氨酸；L，亮氨酸；M，蛋氨酸；N，天冬酰胺；P，脯氨酸；Q，谷氨酰胺；R，精氨酸；S，丝氨酸；T，苏氨酸；V，缬氨酸；W，色氨酸；Y，酪氨酸；Z，谷氨酰胺或谷氨酸。

术语“抗体”是指免疫球蛋白，其保持特异性结合能力的衍生物，以及具有与免疫球蛋白结合域同源或很大程度上同源的结合域的蛋白质。这些蛋白质可以源自天然来源，或部分或全部合成产生。抗体可以是单克隆的或多克隆的。抗体可以是来自任何物种的任何免疫球蛋白类别的成员，包括任何人类类别：IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。在示例性的实施方案中，与本文描述的方法和组合物一起使用的抗体是IgG类的衍生物。除完整的免疫球蛋白分子外，术语“抗体”还包括那些免疫球蛋白分子的片段或聚合物，以及选择性结合靶抗原的人或人源化形式的免疫球蛋白分子。

术语“适体”是指与特定靶分子结合的寡核酸或肽分子。这些分子通常选自随机序列库。选定的适体能够适应独特的三级结构并以高亲和力和特异性识别靶分子。“核酸适体”是DNA或RNA寡核酸，其通过其构象与靶分子结合，从而抑制或抑制该分子的功能。核酸适体可以由DNA、RNA或其组合构成。“肽适体”是在恒定支架蛋白内插入有可变肽序列的组合蛋白分子。肽适体的鉴定通常在严格的酵母双杂交条件下进行，这增加了所选肽适体在细胞内环境中稳定表达并正确折叠的可能性。

术语“载体”是指化合物、组合物、物质或结构，当与化合物或组合物结合时，有助于或促进化合物或组合物的制备、储存、给药、递送、有效性、选择性或化合物或组合物的任何其他特征，以用于其预期的用途或目的。例如，可以选择载体以最小化活性成分的任何降解并且最小化受试者中的任何不利副作用。

术语“嵌合分子”是指通过连接以天然状态分开存在的两个或更多个分子而产生的单个分子。单个嵌合分子具有其所有组成分子的所需功能。嵌合分子的一种类型是融合蛋白。

术语“融合蛋白”是指通过一个多肽的氨基末端与另一多肽的羧基末端之间形成的肽键将两个或更多个多肽连接而形成的多肽。融合蛋白可以通过构成多肽的化学偶联形成，或者可以表达为来自编码单个连续融合蛋白的核酸序列的单个多肽。单链融合蛋白是具有单个连续多肽主链的融合蛋白。可以使用分子生物学中的常规技术来制备融合蛋白，以将两个基因框内连接成单个核酸，然后在产生融合蛋白的条件下在合适的宿主细胞中表达该核酸。

术语“同一性”是指两个核酸分子或多肽之间的序列同一性。可以通过比较每个序列中可以比较的目的进行比对的位置来确定同一性。当比较序列中的一个位置被相同碱基占据时，则分子在该位置相同。核酸或氨基酸序列之间的相似性或同一性程度是核酸序列共有的位置上相同或匹配核苷酸的数目的函数。各种比对算法和/或程序可用于计算两个序列之间的同一性，包括FASTA或BLAST，它们可作为GCG序列分析软件包(威斯康星大学，麦迪逊，威斯康星州)的一部分使用，并且可以使用例如默认设置。例如，考虑了与本文所述的特定多肽具有至少70％、85％、90％、95％、98％或99％同一性并且优选地表现出基本上相同的功能的多肽，以及编码这种多肽的多核苷酸。除非另有说明，相似性评分将基于BLOSUM62的使用。当使用BLASTP时，相似性百分比基于BLASTP阳性评分，而序列同一性百分比则基于BLASTP身份评分。BLASTP“Identity”显示相同的高得分序列对中总残基的数量和分数；BLASTP“正”表示比对得分具有正值且彼此相似的残基的数量和分数。与本文所公开的氨基酸序列具有这些同一性或相似性程度或相似性的任何中间同一性程度的氨基酸序列被本发明涵盖并涵盖。使用遗传密码推导相似多肽的多核苷酸序列，并且可以通过常规方式获得，特别是通过使用遗传密码反向翻译其氨基酸序列。

术语“核酸”是指包含单个核苷酸或两个或多个核苷酸的天然或合成分子，所述一个或两个以上核苷酸通过一个核苷酸的3'位置上的磷酸基团连接至另一个核苷酸的5'端。核酸不受长度限制，因此核酸可包括脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。

术语“可操作地连接至”是指核酸与另一核酸序列的功能关系。启动子、增强子、转录和翻译终止位点以及其他信号序列是可操作地连接至其他序列的核酸序列的实例。例如，DNA与转录控制元件的可操作连接是指DNA与启动子之间的物理和功能关系，使得这种DNA的转录是通过特异性识别、结合并转录DNA的RNA聚合酶从启动子开始的。

术语“肽”、“蛋白质”和“多肽”可互换使用，是指包含两个或多个氨基酸的天然或合成分子，所述两个或多个氨基酸通过一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的α-氨基连接。

术语“药学上可接受的”是指在合理的医学判断范围内适用于与人和动物组织接触而无过度毒性、刺激性、过敏反应或其他问题或并发症，且具有适当的获益/风险比。

术语“蛋白质结构域”是指蛋白质的一部分、蛋白质的一部分或显示出结构完整性的完整蛋白质；该确定可以基于蛋白质的一部分、蛋白质的一部分或整个蛋白质的氨基酸组成。

如本文所用，“间隔物”是指连接包含融合蛋白的蛋白质的肽。通常，间隔子除了连接蛋白质或保持它们之间的最小距离或其他空间关系外，没有特定的生物学活性。然而，可以选择间隔基的组成氨基酸以影响分子的某些性质，例如分子的折叠、净电荷或疏水性。

如本文所用，术语“特异性结合”在指多肽(包括抗体)或受体时是指结合反应，其确定异种蛋白质和其他生物制剂中蛋白质或多肽或受体的存在。因此，在指定条件下(例如抗体情况下的免疫分析条件)，当指定的配体或抗体与样品中存在的其他蛋白质或与配体或抗体可能与生物体接触的其他蛋白质没有大量结合时，则特定的配体或抗体“特异性结合”其特定的“靶标”(例如抗体特异性结合内皮抗原)。通常，“特异性结合”第二个分子的第一个分子与该第二个分子的亲和常数(Ka)大于约10⁵M^–1(例如10⁶M^–1、10⁷M^–1、10⁸M^–1、10⁹M^–1、10¹⁰M^–1、10¹¹M^–1、10¹²M^–1或更高)。

如本文所用，术语“特异性递送”是指分子与带有特定靶分子或标志物的细胞或组织的优先结合，而不是与缺乏该靶分子的细胞或组织的优先结合。当然，已经认识到在分子与非靶细胞或组织之间可能发生一定程度的非特异性相互作用。然而，可以通过特异性识别靶分子来区分特异性递送。通常，特异性递送导致递送的分子与带有靶分子的细胞之间的缔合比递送的分子与缺乏靶分子的细胞之间的缔合强得多。

术语“受试者”是指作为给药或治疗目标的任何个体。受试者可以是脊椎动物，例如哺乳动物。因此，受试者可以是人类或兽医患者。术语“患者”是指在临床医生例如医师的治疗下的对象。

术语“治疗有效”是指所用组合物的量足以缓解疾病或病症的一种或多种原因或症状。这种改善仅需要减少或改变，而不必消除。

术语“转化”和“转染”是指将核酸例如表达载体导入受体细胞，包括将核酸导入所述细胞的染色体DNA。

术语“治疗”是指旨在治愈、改善、稳定或预防疾病、病理状况或病症的患者的医学管理。该术语包括积极治疗，即专门针对疾病、病理状况或病症的改善的治疗，并且还包括因果治疗，即针对消除相关疾病、病理状况或病症的原因的治疗。此外，该术语还包括姑息治疗，也就是说，旨在缓解症状而不是治愈疾病、病理状况或病症的治疗；预防性治疗，也就是说，针对最小化或部分或完全抑制相关疾病、病理状况或病症的发展的治疗；以及支持治疗，即用于补充另一种针对相关疾病、病理状况或病症改善的特定治疗的治疗。

术语“变体”是指具有保守氨基酸取代、非保守氨基酸取代(即简并变体)、在每个编码氨基酸的密码子(即DNA和RNA)的摆动位置内被取代的氨基酸或肽序列、添加到肽C端的氨基酸、或与参考序列具有60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的肽。

术语“载体”是指能够将已经连接了载体序列的另一种核酸转运到细胞中的核酸序列。术语“表达载体”包括任何载体，(例如质粒、粘粒或噬菌体染色体)包含适合于细胞表达的形式(例如，与转录控制元件连接)的基因构建体。

已经描述了本发明的多个实施例。然而，将理解，可以在不脱离本发明的精神和范围的情况下进行各种修改。因此，其他实施例在所附权利要求的范围内。

实施例

实施例1:

开发了完全鼠类抗小鼠CD19构建体，以验证B-ALL是否是靶向CD19的CAR T细胞的靶标(Davila等人，2013PLoS One 8：e61338)。其中包括第二代m1928z CAR，其中包含CD28共刺激性结构域(图1)。CAR T细胞中使用的CD28共刺激结构域来自CD28的细胞质尾部，它没有内在的酶活性，但含有调节T细胞信号转导的亚结构域或基序。YMNM(SEQ ID NO：1)基序是PI3k的p85亚基的结合位点，CD28共刺激支持PI3k激活，从而导致细胞周期进程、抗凋亡和细胞代谢(Rudd and Schneider,2003Nat Rev Immunol 3:544-556；Sasaki et al.,2000Science 287:1040-1046；Wang and Rudd,2008Trends Cell Biol 18:486-493)。具有突变的YMNM(SEQ ID NO：1)结构域的小鼠的研究废除了没有其他相关的体内缺陷的PI3k信号传导(Dodson et al。，2009)。CD28的PYAP(SEQ ID NO：3)基序与LCK结合，导致T细胞活化和IL2产生(Holdorf et al.,1999J Exp Med 190:375-384；Kim et al.,1998J Biol Chem273:296-301)。具有SH3结构域的其他分子，包括Fyn、Grb2和GADS，也与PYAP(SEQ ID NO：3)和PRRP(SEQ ID NO：2)基序结合(Ellis et al.,2000J Immunol 164:5805-5814；Okkenhaug and Rottapel,1998 J Biol Chem273:21194-21202)。PYAP(SEQ ID NO：3)结构域发生突变的小鼠，CD28依赖性增殖，细胞因子分泌和适应性免疫能力明显受损(Burr etal.,2001J Immunol 166:5331-5335；Dodson et al.,2009 Mol Cell Biol 29:3710-3721；Friend et al.,2006 J Exp Med 203:2121-2133)。总的来说，这些结果证明CD28亚结构域介导不同的信号传导和功能途径，并且是T细胞功能不同的需要。此外，已知CD28可扩增低水平的TCR信号(Acuto and Michel,2003 Nat Rev Immunol 3:939-951)，并且数据支持一种模型，通过该模型，CD28可扩增低水平的强直性CAR信号，导致体内CAR T细胞衰竭。未知这些亚结构域及其信号传导途径如何调节CAR-T细胞功能，因此进行了实验以定义其作用并设计用于人类翻译的最佳信号传导构建体。因此，设计了YMNM(SEQ ID NO：1)、PRRP(SEQ ID NO：2)或PYAP(SEQ ID NO：3)亚结构域中的一系列7个突变体(图2A)。这些CAR构建体包括单个亚结构域的无效突变(Mut01-Mut03)或两个突变的亚结构域，仅留下单个功能性亚结构域(Mut04-Mu06)。还创建了一个具有所有3个亚结构域突变的三重突变体(Mut07)。在来自Nur77^GFP小鼠的T细胞中评估了CD28Mut CAR，并确定了所有支持的CAR信号传导，尽管双重突变体(Mut04-Mut06)具有较低的Nur77^GFP，其水平与第一代m19z CAR相似(图14B)。使用这些CD28突变体和其他新颖的CAR设计，通过CD28共刺激评估了CAR T细胞衰竭的机制，并确定了减少疲劳以增强持久性的方法。

为了确定CD28共刺激性亚结构域对靶向CD19的CAR T细胞的体外和体内功能的调节作用，使用CD28突变体定义了每个亚结构域如何促进CAR T细胞功能(图2A)。评估了CD28突变体CAR T细胞的细胞因子产生和记忆亚群，表明与单个突变体(Mut01-03)相比，双突变体(Mut04-06)增强了IFNγ的分泌，而所有CD28突变体均产生相似程度的IL2降低(图3A-B)。CM和EM CAR T细胞亚群得以保留，但具有可变效应，例如Mut04具有降低的CM和增加的EM亚群(图3C-D)。这些结果证明了CD28突变体的差异结果，这可能与转录途径(如AP1、NFAT或NFKB)的差异诱导有关。这些修饰可以作为CAR设计的改进，以提高缓解率，减少复发相关性，最重要的是，可以提高难治性癌症患者的生存率。

实施例2:

为了进一步评估CD28突变的CAR T细胞的体外和体内功能，用CAR修饰了小鼠T细胞，并确定了它们对生存力(图4)和增殖(图5)的影响。分泌的细胞因子产生的特征还在于，从正常的野生型小鼠中产生CAR T细胞，并与3T3-mCD19孵育过夜，然后测量分泌的细胞因子水平。与未突变的1928z相比，Mut06 CAR T细胞产生的细胞因子明显减少，但与第一代CAR相比，产生的细胞因子明显增加(图6A至6D)。靶细胞毒性的特征还在于，从正常野生型小鼠中产生CAR T细胞，并与3T3-mCD19一起孵育，并测量RTCA在1周内对靶细胞的杀伤作用。CD28突变的CAR T细胞以及未突变的CAR T细胞均被杀死，而在低E：T比率下，mut06的杀灭效果更好(图7A和7B)。1x10⁶ CAR T细胞(CD3⁺CAR⁺)经静脉注射cytoxan(300mg/kg)预处理的野生型C57BL/6小鼠中，然后通过血液的连续流式细胞术监测B细胞杀伤和CAR T细胞的持久性。在第1(图8A、8B)、2(图8C、8D)、4(图8E、8F)和6(图8G、8H)周，小鼠Mut06和1928zCAR T细胞显示出相似的B细胞杀伤和CAR T细胞的体内计数(图8A至8H，9A至9D)。还比较了各种靶向CD19的CAR T细胞对白血病的体内杀伤作用。注射Eu-ALL细胞六天后，对野生型C57BL/6小鼠进行腹膜内注射cytoxan(300mg/kg)后，于1天后静脉注射3x10⁵ CAR T细胞。与1928z CRA T细胞相比，给予mut06 CAR T细胞时，具有Eu-ALL肿瘤的小鼠的存活时间长得多(图10)。这些观察还扩展到了人类CD28突变的、人类CD19靶向的CAR T细胞。使用获自健康供体的T细胞并用靶向人CD19的CAR T细胞修饰，可以评估构建物的生存力、增殖能力和细胞毒性。当通过台盼蓝细胞计数测定时，CD28突变的人CAR T细胞的活力和增殖在生产结束时类似于非突变的CAR T细胞(图11A和11B)。同样，在表达人CD19的3T3细胞刺激后，所有人类CAR T细胞在体外均表现出相似的增殖(图12)。与非突变的CAR T细胞相比，当通过RTCA测量时，人mut06 CAR T细胞类似地杀死3T3-人CD19细胞(图13)。

除非另有定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语具有与所公开的发明所属领域的技术人员通常所理解的相同含义。本文所引用的出版物及其所引用的材料通过引用具体结合到本文中。

仅使用常规实验，本领域技术人员将认识到或能够确定本文所述的本发明的特定实施方案的许多等同方案。这些等同方案旨在由所附权利要求书涵盖。

序列表

<110> H·李·莫菲特癌症中心研究所公司

<120> 具有突变的CD28共刺激性结构域的嵌合抗原受体

<130> 320803-2160

<150> US 62/529,919

<151> 2017-07-07

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221>

<222>

<223> 合成构建体（Synthetic Construct）

<400> 1

Tyr Met Asn Met

1

<210> 2

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221>

<222>

<223> 合成构建体（Synthetic Construct）

<400> 2

Pro Arg Arg Pro

1

<210> 3

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221>

<222>

<223> 合成构建体（Synthetic Construct）

<400> 3

Pro Tyr Ala Pro

1

<210> 4

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221>

<222>

<223> 合成构建体（Synthetic Construct）

<400> 4

Ala Ala Ala Ala

1

Claims (16)

1.嵌合抗原受体(CAR)多肽，包含配体结合结构域、跨膜结构域、细胞内信号传导结构域和共刺激信号传导区域，其中所述共刺激信号传导区域包含增强CAR-T细胞融合的CD28的细胞质结构域的突变形式。

2.根据权利要求1所述的多肽，其中所述共刺激信号传导区域包含缺乏YMNM亚结构域或在所述YMNM亚结构域中具有无效突变的CD28的细胞质结构域。

3.根据权利要求1或2所述的多肽，其中所述共刺激信号传导区域包含缺乏PRRP亚结构域或在所述PRRP亚结构域中具有无效突变的CD28的细胞质结构域。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的多肽，其中所述共刺激信号传导区域包含缺乏PYAP亚结构域或在所述PYAP亚结构域中具有无效突变的CD28的细胞质结构域。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的多肽，其中所述CAR多肽由下式限定：

SP–TAA–HG–TM–CSR–ISD；或

SP–TAA–HG–TM–ISD–CSR

其中“SP”表示信号肽，

其中“TAA”表示肿瘤相关的抗原结合区，

其中“HG”表示和任选的铰链结构域，

其中“TM”表示跨膜结构域,

其中“CSR”表示所述共刺激信号传导区域，

其中“ISD”表示细胞内信号传导结构域，和

其中“–”表示二价接头。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的多肽，其中所述细胞内信号传导结构域包括CD3zeta(CD3δ)信号传导结构域。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的多肽，其中CD28的细胞质结构域的突变形式减少CAR-T细胞的衰竭。

8.分离的核酸序列，编码权利要求1至7中任一项所述的重组多肽。

9.包含权利要求8所述的分离的核酸序列的载体。

10.包含权利要求9所述的载体的细胞。

11.根据权利要求10所述的细胞，其中所述细胞选自αβT细胞、γδT细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、B细胞、先天淋巴样细胞(ILC)、细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞、调节性T细胞、或其任意组合。

12.根据权利要求11所述的细胞，其中当CAR的抗原结合结构域与TAA结合时，所述细胞显示出抗肿瘤免疫力。

13.一种在患有TAA-表达性癌症的受试者中提供抗肿瘤免疫力的方法，该方法包括向所述受试者施用有效量的经遗传修饰以表达权利要求1至7中任一项所述的CAR多肽的免疫效应子细胞，从而在哺乳动物中提供抗肿瘤免疫力。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述免疫效应子细胞选自T细胞、自然杀伤(NK)细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和调节性T细胞。

15.根据权利要求13或14所述的方法，还包括向所述受试者施用检查点抑制剂。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述检查点抑制剂包括抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体或其组合。

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