CN111197003A - 一种基于智能手机的集成核酸提取扩增检测的分析装置及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于智能手机的集成核酸提取扩增检测的分析装置及方法，涉及智能医疗仪器关键技术领域。所述分析装置，使用智能手机作为主要部件，将智能手机和微流体驱动、温度控制、多色荧光检测集成在一起，形成一个集成核酸提取、扩增和检测的便携式多功能的通用化装置，该装置与微流控芯片相结合，实现片上核酸提取、等温扩增定性检测以及实时荧光定量PCR(Quantitative Real‑time PCR，qPCR)和多重荧光PCR(Multiplex PCR)的检测，实现对病原体核酸的分析检测。所述分析方法，包括核酸提取、体系配置、体系加载、温度设置、图像采集、图像处理和结果保存和分享。本发明使用智能手机作为主要部件，体积小、成本低，此外功能全，适用性强，检测方法多样。

Description

一种基于智能手机的集成核酸提取扩增检测的分析装置及 方法
技术领域
本发明涉及智能医疗仪器关键技术领域，具体涉及一种基于智能手机的集成核酸提取、扩增、检测的分析装置。
背景技术
近年来，各种传染病在世界范围内不断爆发，如2013年的禽流感、2016年的寨卡、2018年的非洲猪瘟等，这些传染病严重威胁人类的生命健康，给人民造成巨大的财产损失，甚至威胁到国家安全，因此开展传染病的即时检测具有重要意义。
传染病的传播具有传染性、流行性、地域性和突发性的特点，因此针对传染病的检测方法需要满足现场、即时、准确的要求。目前对传染病的检测主要是在在分子层面对病原体核酸进行检测，而核酸检测技术在传染病病原体核酸检测方面的应用受限于核酸检测设备的发展。传统的核酸检测设备大都需要复杂的核酸提取和耗时的扩增检测过程，而且设备集成度低，体积庞大，操作复杂，价格昂贵，仅能用于中心实验室检测，无法满足传染病现场即时检测的要求。
微流控芯片技术具有将核酸提取、扩增、检测等步骤集成到几个平方厘米的芯片上的能力，具有易于集成化、自动化、流体可控以及所需样本量小的特点，广泛应用于生化分析领域。随着微流控芯片技术的发展，基于微流控芯片的核酸检测装置具有热容量低、扩增速度快、样品消耗量小、制作成本低、可抛弃和实时检测扩增产物等优点。智能手机是一种具有独立的操作系统和硬件高度集成的移动通信设备，体积小，使用方便，功能强大。其集成的众多物理传感器能够采集各种实验数据，不亚于计算机的数据处理能力，能够对各种实验数据进行分析，多种无线数据传输功能能够非常方便的共享实验结果。将智能手机应用于核酸检测设备不仅可以提高设备集成度，减小设备体积，简化实验操作，而且能够非常方便的共享实验结果，对传染病的检测和实时监控具有重要意义。
目前已经出现了将智能手机和微流控芯片相结合应用于核酸检测设备的报道。如加利福尼亚大学的Aydogan Ozcan等人在ACS Nano上发表的《Highly Stable andSensitive Nucleic Acid Amplification and Cell-Phone-Based Readout》，此论文报道一种使用环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)的智能手机荧光微孔板核酸检测系统，但是该系统没有集成核酸提取功能，智能手机仅用于采集荧光图像，功能单一，仅能用于特定方法的检测；浙江大学的牟颖等人在Biosensors andBioelectronics上发表的《Smartphone-based mobile digital PCR device for DNAquantitative analysis with high accuracy》，此论文报道了一种使用数字PCR技术(Digital polymerase chain reaction，dPCR)的智能手机便携式核酸检测设备，但是该设备不具备核酸提取功能，而且智能手机仅用于拍摄荧光图像和荧光点计数，仅能用于单通道荧光检测；宾西法尼亚大学的Haim H.Bau等人在Analytical Chemistry上发表的《Smartphone-Based Mobile Detection Platform for Molecular Diagnostics andSpatiotemporal Disease Mapping》，此论文报道了一种基于智能手机的手持式智能连接杯装置，用相变材料控温来实现等温扩增检测，但是该设备没有集成核酸提取功能，检测方法单一。
因此，虽然将智能手机和微流控芯片相结合应用于病原体核酸检测设备，能够实现病原体核酸的现场及时检测，但是目前基于智能手机和微流控芯片的核酸检测设备还存在着许多问题。例如：1)设备不具备核酸提取能力，难以适用于现场快速检测；2)没有将智能手机的计算机功能发挥到极致，大多设备中智能手机仅用于拍照；3)通常仅用于特定环境执行对特定病原体的检测，环境适应性较差；4)传统设备仅配有单一荧光检测通道，检测通量低，无法实现高通量的荧光检测。
发明内容
本发明为了解决传统便携式核酸检测设备存在的缺陷，提供了一种基于智能手机的集成核酸提取扩增检测的分析装置。该装置具有以下特征：1)系统集成度高，体积小，便于携带，成本低；2)集成核酸提取和变温/等温扩增检测功能，功能全，适应性强；3)智能手机APP具有温度控制、图像采集、数据分析和共享等功能，操作简单；4)装置配有六个荧光检测通道，可以实现高通量的多重荧光检测。该装置具备在资源匮乏的地区进行现场即时检测的能力。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种基于智能手机的集成核酸提取扩增检测的分析装置，所述分析装置使用智能手机作为主要部件，将智能手机和微流体驱动、温度控制、多色荧光检测集成在一起，形成一个集成核酸提取、扩增和检测的便携式多功能的通用化装置，该装置与微流控芯片相结合，实现片上核酸提取、等温扩增定性检测以及qPCR和Multiplex PCR的检测，实现对病原体核酸的分析检测。
所述核酸分析装置包括智能手机、微控制单元、微流体驱动单元、温度控制单元和荧光检测单元；智能手机用于实验结果的显示以及实验数据的处理和共享，智能手机还通过蓝牙与微控制单元进行通信，实现对整个装置的控制；微流体驱动单元结合微流控芯片实现片上核酸提取；温度控制单元进行温度调控，满足核酸扩增的温度条件；荧光检测单元使用诱导荧光检测法，实现FAM、HEX、TAMRA、ROX、CY5、CY5.5这六种荧光波段的检测。
所述智能手机搭载Android系统，具备蓝牙通信、数据网络通信和后置拍照的功能；智能手机上安装一款自制的软件模块，在该模块内把智能手机与微控制单元通过蓝牙连接，智能手机通过该模块，一方面通过蓝牙向微控制单元发送命令，实现对装置的控制；另一方面通过蓝牙接收微控制单元发送的数据，在智能手机界面上显示；在模块内使用智能手机的相机拍摄荧光图像，智能手机使用模块内的图像处理功能对拍摄的荧光图像进行荧光强度分析，并绘制荧光强度曲线，最后在模块内将处理后的数据保存，并记录下地理位置，通过数据网络将这些数据上传分享。
所述自制的软件模块包括六个控制界面：电机控制界面、温度控制界面、图像采集界面、图像处理界面、绘制曲线界面和数据分享界面；电机控制界面设置蠕动泵、电磁阀和步进电机的工作状态；温度控制界面设置温度控制单元的工作模式，并实时绘制温度曲线；图像采集界面调用智能手机的相机，手动调节相机的焦距、增益和曝光时间，手动打开LED灯进行手动拍照，设置拍照温度点和时间点以及拍照间隔进行自动拍照，并记录拍照次数；图像处理界面对拍摄的荧光图片进行处理，手动框选荧光区域，计算荧光强度；曲线绘制界面将计算出的荧光值绘制成曲线，横坐标为循环数，纵坐标为荧光强度；数据分享界面调用第三方地图软件，显示每次实验的地理位置以及保存的实验结果。
所述微控制单元是一块基于STM32的电路板，微控制单元包括：电源转换模块、蓝牙通信模块、温度采集和控制模块、LED灯控制模块、步进电机控制模块、蠕动泵和电磁阀控制模块，电源控制模块将24V的输入电压依次转换为12V、5V、3.3V，蓝牙通信模块与智能手机通信，蠕动泵和电磁阀控制模块控制微流体驱动单元，温度采集和控制模块控制温度控制单元，LED灯控制模块以及步进电机控制模块控制荧光检测单元；微控制单元内存储有蓝牙串口通信算法，步进电机运动控制算法，温度传感器电信号和温度的转换算法，半导体温控片的PID控制和Bang-Bang控制算法，温度补偿算法。
所述微流体驱动单元由蠕动泵、电磁阀和数字步进电机驱动器组成，微流体驱动单元用于实现微流控芯片内的核酸提取，用导气管将蠕动泵和电磁阀分别接到微流控芯片的气阀上，数字步进电机驱动器控制蠕动泵转动，推吸空气，改变气路中的气体压强，驱动微流控芯片里的反应液流动；电磁阀控制气路通断，气路的通断影响反应液的流动方向，通过精确控制蠕动泵的转动速度和方向，以及电磁阀导通方向，实现微流控芯片内的核酸提取。
所述温度控制单元由半导体温控片、银质热沉片、温度传感器、铜质鳍片散热器和风扇组成；半导体温控片改变微流控芯片反应腔的温度，银质热沉片提高传热和温度均匀性，温度传感器置于银质热沉片内部中心处，检测微流控芯片的温度并将温度转换为电信号，通过预先存储在微控制单元内的电信号和温度之间的相互关系，确定微流控芯片反应腔的温度并通过PID算法对半导体温控片进行反馈控制，实现高精度的温度控制；铜质鳍片散热器和风扇用于微流控芯片反应腔降温时散热；温度控制单元的装置结构呈层状分布，从上到下，分别为装有温度传感器的银质热沉片、半导体温控片、铜质鳍片散热器和风扇；微流控芯片放在银质热沉片上，温度传感器实时采集微流控芯片反应腔中的温度，根据采集的温度对半导体温控片进行控制，达到升降温的目的。
所述温度控制单元使用的半导体温控片和银质热沉片的面积均为50×50mm，可以适配不同尺寸的微流控芯片；微控制单元内存储的半导体温控片的PID控制和Bang-Bang控制算法，可以控制温度控制单元实现快速且稳定的温度控制；温度补偿算法可以提高温度控制单元的温度均匀性。经测试温度控制单元可以实现0-100℃调节范围，0.1℃调节精度，5℃/s升降温速度的快速高精度温度控制。
所述荧光检测单元由激发光源、准直光路、六色荧光转台、步进电机、数字步进电机驱动器和智能手机组成；激发光源使用大功率白光LED灯，以满足多波段的荧光激发；准直光路由六块平凸透镜组成，用于激发光的匀光和准直；六色荧光转台采用共聚焦式的荧光激发光路，使用FAM、HEX、ROX、TAMRA、CY5、CY5.5这六个不同激发波段的荧光激发模块；荧光激发模块由激发滤光片、二向色镜和发射滤光片组成，六组荧光激发模块分别使用了不同光学参数的激发滤光片、二向色镜和发射滤光片，每组荧光激发模块的镜片都固定在相同尺寸的金属盒内，六个金属盒固定在一个水平的金属圆盘上，围着圆心排成一个圆，激发滤光片所在的面向外，发射滤光片所在的面向上，二向色镜放在金属盒的对角上，激发滤光片和发射滤光片在二向色镜镜面的两边；步进电机用于支撑金属圆盘，并带动金属圆盘转动，进行荧光切换；数字步进电机驱动器用来对步进电机的旋转角度进行精确控制；智能手机的相机拍摄荧光图像。
所述荧光检测单元由激发光源发出的白光，经过准直光路变为准直光，再经过激发滤光片变为单色光，经二向色镜反射后，照射微流控芯片反应腔内反应液的荧光染料或荧光探针，使荧光染料或荧光探针受激发产生荧光；激发出的荧光透过二向色镜，再经发射滤光片滤光，被智能手机的相机接收；智能手机将荧光图像拍摄并保存；使用多种荧光染料或荧光探针时，微控制单元首先通过光电开关对六色荧光转台进行位置校准，让FAM通道的荧光镜片组正对准直光路，然后通过步进电机驱动器精确控制步进电机的旋转角度，带动六色荧光转台旋转，使六色荧光转台每次旋转60°，进行精确的荧光通道切换，实现核酸的多重荧光检测。
本发明的一种基于智能手机的集成核酸提取扩增检测的分析方法，包括以下步骤：
(1)核酸提取
将微流体驱动单元和核酸提取芯片用导气管连接，在芯片内加入样品、磁珠和提取试剂，智能手机通过蓝牙与微控制单元进行通信，在自制软件模块的电机控制界面控制蠕动泵和电磁阀的工作状态，实现反应液在芯片内的震荡混合和转移。按照磁珠法提取核酸的操作步骤在芯片上完成核酸提取；
(2)体系配置
将提取的核酸和扩增试剂按照体系配比，配制成扩增反应液；
(3)体系加载
将扩增反应液加载到微流控芯片内，其中PCR扩增反应液加载到四腔芯片内，等温扩增反应液加载到点样后的树形芯片内；
(4)温度设置
将完成反应液加载的芯片放到温度控制单元的热沉片上，在自制软件模块的温度控制界面设置温度控制单元的工作模式，通过调用微控制单元内存储的程序，可以实现等温扩增温度控制和PCR扩增温度控制；
(5)图像采集
在自制软件模块的电机控制界面，控制步进电机位置校准，使FAM通道的荧光镜片组正对准直光路，然后控制步进电机旋转选择需要的荧光通道。在图像采集界面，手动设置相机的焦距、增益和曝光时间，并调节智能手机的位置，使图像采集界面的中心位置可以看到清晰且对比度高的荧光图像，设置拍照参数，其中等温扩增反应使用手动拍照的方式采集反应开始前和反应结束后的荧光图像；qPCR根据温度控制单元设置的温度条件对拍照温度点和拍照时间进行设置，在每个PCR循环内，到达拍照温度点后，经过拍照时间的延时，自动打开LED灯并拍摄一张荧光图像，拍照结束后关闭LED灯；Multiplex PCR根据温度控制单元设置的温度条件对拍照温度点、拍照时间和拍照间隔进行设置，在每个PCR循环内，到达拍照温度点后，经过拍照时间的延时，自动打开LED灯并拍摄一张荧光图像，拍照结束后经过拍照间隔再次进行拍照，在拍照间隔内，步进电机将切换荧光通道，在每个PCR循环内，六个荧光通道各拍摄一张图片，拍照完成后关闭LED灯，步进电机将荧光通道切换到初始通道；
(6)图像处理
在自制软件模块的图像处理界面，将拍摄的荧光图像加载到界面上，其中qPCR加载最后一个循环的荧光图像，使用图像处理界面上的框选工具对荧光图像上的荧光区域进行手动框选，在曲线绘制界面，软件模块内部的算法程序会自动计算出框选区域的荧光强度值，然后绘制出荧光强度曲线；Multiplex PCR拍摄的荧光图像会按照单个PCR循环内的拍照顺序进行分类，使同一荧光通道拍摄的荧光图像放在一起，然后按照qPCR的方法对每个通道进行单独分析；
(7)结果保存和分享
将绘制的荧光强度曲线进行重命名并保存在本地，软件模块内部程序会自动保存当前的地理位置，在数据分享界面，调用第三方地图软件，在界面上可以看到所有重命名后的实验以及对应的地理位置，点击实验名称查看实验结果，然后通过网络传输将数据分享给其他人。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
(1)将Bang-Bang控制算法与PID控制算法相结合用于温度控制，并加入温度补偿算法，使得装置的温控模块升降温速度快、温控精度高，此外温控模块通用性强，既可以进行等温扩增的温度控制，也可以进行PCR变温扩增的温度控制；
(2)荧光检测模块由六种不同激发波段的荧光检测通道组成，通过步进电机带动转盘转动来切换荧光通道，可以实现不同波段的荧光检测和多重荧光检测；
(3)装置集成了微流体驱动模块，具备核酸提取功能，结合微流控芯片可以实现芯片上的核酸提取。
(4)本发明中的智能手机使用一款自制的APP，可以实现对整个装置的控制，具备多种荧光图像采集方式，能够对实验数据处理，并将实验结果保存和分享；
(5)本发明装置使用智能手机作为主要部件，体积小、成本低，此外功能全，适用性强，检测方法多样，既可以用于等温扩增检测，也可以用于实时荧光PCR检测和多重PCR扩增检测，能够实现对任何病原体核酸的分析检测。
附图说明
图1是本发明的装置框图，1智能手机、2微控制单元、3微流体驱动单元、4微流控芯片、5温度控制单元、6荧光检测单元；
图2是与本发明装置结合使用的三个微流控芯片，41核酸提取芯片，411进样腔、412废液腔、413混合腔、414微管道；42四腔芯片，421反应腔、422进样孔；43树形芯片，431反应腔、432进样口、433微流道、434排气孔、435出样口、436密封槽；
图3是微流体驱动单元与图2所示的核酸提取芯片41连接图，31蠕动泵、32电磁阀一、33电磁阀二、34电磁阀三、35导气管、41核酸提取芯片；
图4是温度控制单元结构图，51银质热沉片、52半导体温控片、53铜质鳍片散热器、54风扇、4微流控芯片；
图5(a)和(b)是荧光检测单元结构图，1智能手机、61大功率白光LED灯、62回转轴承、63准直透镜组、64荧光镜片组、65转盘、66步进电机、4微流控芯片、5温度控制单元；
图6是对本发明装置提取的核酸和Roche MP24提取的核酸进行比较的电泳图和质量测定数据；
图7是本发明装置对IAV病毒进行PCR扩增检测时的温度曲线图、荧光曲线图和数据保存图；
图8是本发明装置对IBV病毒进行等温扩增检测时拍摄的荧光图片；
图9是使用本发明装置对非洲猪瘟病毒(African Swine Fever Virus，ASFV)实际样本进行检测绘制的荧光曲线图。
具体实施方式
下面结合附图以及实施例对本发明作进一步详细说明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动和修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求所限定的范围。
如图1所示，一种基于智能手机的集成核酸提取、扩增、检测的分析装置由智能手机1、微控制单元2、微流体驱动单元3、温度控制单元5、荧光检测单元6，以及微流控芯片4组成。
智能手机1在自制的软件模块内通过蓝牙通信向微控制单元2发送控制命令，微控制单元2根据接收到的命令分别对微流体驱动单元3、温度控制单元5、荧光检测单元6进行控制。其中微流体驱动单元3用来驱动微流控芯片4内的液体流动，进行芯片上的核酸提取；温度控制单元5用来监测微流控芯片4的温度并将温度值发送给微控制单元2，微控制单元2一方面将温度值通过蓝牙通信发送给智能手机，另一方面对温度控制单元5进行反馈控制，为微流控芯片4内的扩增反应提供温度条件；荧光检测单元6用来激发微流控芯片4的荧光，实时监测微流控芯片4内的扩增反应，智能手机1用来采集荧光检测单元6激发出的荧光图像。
如图2所示，在本实施例中使用的微流控芯片4由集成了微腔、微流道的PDMS材料键合封接而成，包括玻璃基底和PDMS主体。其中核酸提取芯片41的PDMS主体包括进样腔411、废液腔412、混合腔413、微管道414，进样腔411和混合腔413的底部通过微管道414连接，废液腔412的上部通过微管道414与进样腔411的底部连接，进样腔411顶部直接与大气连通，废液腔412和混合腔413通过微孔与大气连接。四腔芯片42的PDMS主体包括反应腔421、进样孔422，四个反应腔421彼此独立，各自通过两个进样孔422与大气连接。树形芯片43的PDMS主体包括反应腔431、进样口432、微流道433、排气孔434、出样口435、密封槽436，微流道433将各个反应腔431的一端连接到一起，反应腔431的另一端通过排气孔434与大气相连，进样孔432位于微流道433前端，用于反应腔431的统一进样，排气孔434用于排出反应腔431内的空气，废液腔435位于微流道433末端，并通过排气孔434与大气相连，进样口432、排气孔434和出样口435都在密封槽436的底部，通过在密封槽436内填充密封膜来对进样口432、排气孔434和出样口435进行密封。
在本实施例中使用的核酸提取芯片41的进样腔411的体积为3500μL，混合腔413体积为1500μL，废液腔412体积为10000μL。四腔芯片42的反应腔421体积为20μL。树形芯片43的反应腔431体积为9μL。
如图3所示，微流体驱动单元3包括蠕动泵31、电磁阀一32、电磁阀二33、电磁阀三34、导气管35。结合图2所示的本实例使用的核酸提取芯片41，蠕动泵31的接口1和接口2通过导气管35分别与电磁阀一32的接口1和电磁阀三34的接口1相连，电磁阀一32的接口2与电磁阀二33的接口3相连，电磁阀二33的接口1与核酸提取芯片41的混合腔413顶部的微孔相连，电磁阀三34的接口3与核酸提取芯片41的废液腔412顶部的微孔相连。
智能手机1通过自制软件模块的电机控制界面向微控制单元2发送命令，微控制单元2调用内部存储的程序控制微流体驱动单元3。在电机控制界面可以控制蠕动泵31的旋转速度、工作模式、旋转方向，以及启动和停止。其中工作模式分为单向模式和双向模式，选择双向模式时，电磁阀一32的接口1和2导通，电磁阀二33的接口1和3导通，电磁阀三34的接口1和2导通，此时蠕动泵31按照微控制单元2内设置的周期进行双向往复旋转，核酸提取芯片41的进样腔411内的液体通过微管道414在进样腔411和混合腔413内来回震荡，完成抽吸混合操作；选择单向模式时，电磁阀一32的接口1和3导通，电磁阀二33的接口1和2导通，电磁阀三34的接口1和3导通，设置蠕动泵31逆时针旋转，核酸提取芯片41的进样腔411和混合腔413内的液体通过微管道414抽吸到废液腔，完成废液排出操作。通过在电机控制界面设置微流体驱动单元的工作状态，可以在核酸提取芯片上提取核酸。
如图4所示，温度控制单元5包括银质热沉片51、半导体温控片52、铜质鳍片散热器53、风扇54、温度传感器55。温度传感器55放置在银质热沉片51内部的中心位置，银质热沉片51底部与半导体温控片52紧贴，半导体温控片52的底部紧贴在铜质鳍片散热器53的上表面，风扇54固定在铜质鳍片散热器53的底部。实验时微流控芯片4放在银质热沉片51的中心，微流控芯片4的玻璃基底与银质热沉片51的上表面紧贴。
智能手机1通过自制软件模块的温度控制界面可以向微控制单元2发送命令，微控制单元2调用内部存储的程序控制温度控制单元5。在温度控制界面可以控制温度控制单元5实现等温温度控制和PCR变温温度控制。微控制单元2根据接收到的温度控制命令，调用相应的算法程序控制温度控制单元。银质热沉片51内部的温度传感器55将所在位置的温度转化为电信号，微控制单元2根据内部存储的电信号与温度的转换算法计算出温度传感器所在位置的温度值，微控制单元2一方面将温度值通过蓝牙通信发送给智能手机，在温度控制界面实时显示并绘制温度曲线；另一方面根据程序里设置的温度与测得的温度的关系，调用相应的温度控制算法程序，控制流入半导体温控片52电流的大小和方向，实现实时的升降温控制。其中温度控制使用的是Bang-Bang控制和PID控制相结合的控制算法，在提高温度控制单元5的升降温速率的同时，又有很好的温度稳定性，经测量温度控制单元5的升降温速率达到了5℃/s，恒定温度点的温度变化差异小于0.04℃；温度控制单元5内还加入了温度补偿算法，以减小温度传感器55测得的温度与微流控芯片4的实际温度的误差，经测量在升降温过程中两温度的误差小于0.1℃。因此温度控制单元5可以和等温扩增和PCR扩增提供很好的温度条件。
如图5(a)和(b)所示，荧光检测单元6包括LED灯61、回转轴承62、准直透镜组63、荧光镜片组64、转盘65、步进电机66。LED灯61使用白光CBT90灯珠，供电电压3.3V，电流5A；准直透镜组63放在大功率白光LED灯61前面，由六块平凸透镜组成；荧光镜片组64由激发滤光片、二向色镜和发射滤光片组成，一共有六组，分别对应FAM、HEX、ROX、TAMRA、CY5、CY5.5这六个荧光通道；六组荧光镜片组都固定在转盘65上，围绕转盘65圆心按照FAM、HEX、ROX、TAMRA、CY5、CY5.5的顺序逆时针排成一个圆；回转轴承62的外环与转盘65底部固定，用来旋转，回转轴承62的内环与步进电机66固定，用来承重；步进电机66的旋转轴穿过回转轴承62的中心连接到转盘65的圆心，步进电机66转动会带动转盘65转动，通过精确控制步进电机66的旋转角度，可以对转盘65的旋转进行精确的控制，实现荧光镜片组的切换。智能手机1的摄像头在荧光镜片组64中发射滤光片的正上方，准直透镜组63在荧光镜片组64中激发滤光片的正前方，微流控芯片4放在温度控制单元5上，位于荧光镜片组64的正下方。
智能手机1通过自制软件模块的电机控制界面和图像采集界面可以向微控制单元2发送命令，微控制单元2调用内部存储的程序控制荧光检测单元6。在电机控制界面可以控制步进电机66的旋转，实现转盘65的位置校准和荧光镜片组64的选择。转盘65边缘装有一个挡片，通过在特定位置放置光电开关，控制步进电机66的旋转，实现转盘65的位置校准，使FAM通道的荧光镜片组64正对准直透镜组63。然后电机控制界面发送通道选择命令，微控制单元2内部的程序通过步进电机驱动器控制步进电机66旋转60°，切换一次荧光镜片组64，每发送一次命令，切换一次，根据荧光镜片组64在转盘65上的排列顺序，找到需要的荧光通道。在图像采集界面可以控制LED灯的开和关，实现荧光的激发。LED灯发出的光经过准直透镜组63的汇聚照射到所需要的荧光镜片组64的激发滤光片上，经激发滤光片后变成单色光，经二向色镜反射照射到微流控芯片反应腔内的荧光物质上，激发出荧光，荧光透过二向色镜再经发射滤光片滤除杂光，照射到发射滤光片上方的智能手机的相机上，智能手机在自制软件模块内的图像采集界面采集荧光图像。
在自制软件模块的图像采集界面调用智能手机1的相机，手动调节相机的焦距、增益和曝光时间，调整智能手机1的位置，使智能手机1可以拍摄到位于图片中心位置、清晰、对比度高的荧光图像。设置拍照温度点、拍照时间和拍照间隔以实现不同的拍照模式。其中等温扩增检测使用自动开灯拍照，采集实验开始前和实验结束后的荧光图片各一张；qPCR按照扩增反应设置的温度条件来设置拍照温度点和拍照时间，在每个PCR循环内，到达拍照温度点后，经过拍照时间的延时，进行一次自动开灯拍照，拍照结束关灯，并将拍摄的荧光图像保存在本地；Multiplex PCR按照扩增反应设置的温度条件来设置拍照温度点和拍照时间，以及拍照间隔，在每个PCR循环内，到达拍照温度点后，经过拍照时间的延时，进行一次自动开灯拍照，拍照结束经过拍照间隔再次进行拍照，在拍照间隔内步进电机66自动旋转60°，进行一次荧光通道切换，在一个PCR循环内，每拍摄一次图片，切换一次荧光通道，直至每个荧光通道都拍摄一次图片，转盘65旋转一周，回到初始位置，然后关灯，并将拍摄的荧光图像分类保存，同一通道的荧光图像放在一起。在图像处理界面对荧光图像进行处理。其中qPCR的最后一张荧光图像被加载到图像处理界面，使用框选工具框选荧光图像里的荧光区域，切换到曲线绘制界面，软件模块内部的算法程序会自动计算出框选区域的荧光强度值，然后绘制出荧光强度曲线；Multiplex PCR按照qPCR的方法对每个通道进行单独分析。然后对处理的实验结果进行重命名并保存在本地，软件模块内的程序会自动保存地理位置。切换到数据分享界面，会自动调用第三方地图软件，在地图上可以看到所有保存实验数据的地理位置，并可以查看所有的实验结果，然后可以通过智能手机1的网络通信功能对数据进行分享。
结合图2所示的微流控芯片4，本实施例分为如下四部分：
1、结合核酸提取芯片41进行样品核酸提取
(1)将核酸提取芯片41按照图3所示与微流体驱动单元3的各组件相连。用智能手机1上的定制软件与微控制单元2进行蓝牙通信，控制微流体驱动单元3的各组件。电磁阀一32的接口1、2导通，电磁阀二33的接口1、3导通，电磁阀三34的接口1、2导通。此时电磁阀三34的接口3关闭，废液腔412顶部的微孔没有与大气连接，混合腔413顶部的微孔通过电磁阀二33、电磁阀一32、蠕动泵31和电磁阀三34与大气连接。
(2)用移液枪在核酸提取芯片41的进样腔411内加入2μL Carrier RNA、20μLProteinase K、20μL MagBind Particles和400μL Buffer MLB，再加入200μL血清或血浆样品。
(3)开启蠕动泵31，根据加入核酸提取芯片41内的溶液体积设置时间，蠕动泵31按设置的时间间隔切换旋转方向，微管道35内的空气流动方向改变。此时废液腔412顶部的微孔不与大气连通，混合腔413顶部的微孔与大气连通，核酸提取芯片41内的溶液在混合腔413和进样腔411间来回震荡混匀。
(4)震荡混匀10min后，关闭蠕动泵31，将核酸提取芯片41放置在磁铁上，让混合腔413和进样腔411的底部与磁铁紧贴。静置吸附磁珠5min后，用智能手机1控制微流体驱动单元3，电磁阀一32接口1、3导通，电磁阀二33接口1、2导通，电磁阀三34接口1、3导通。此时混合腔413顶部微孔通过电磁阀二33与大气连通，废液腔412顶部的微孔通过电磁阀三34、蠕动泵31和电磁阀一32与大气连通。开启蠕动泵31，控制蠕动泵31的旋转方向，让接口1吹气，接口2吸气，核酸提取芯片41进样腔411和混合腔413内的溶液通过微管道35转移进废液腔412。关闭蠕动泵31，将核酸提取芯片从磁铁上取下。
(6)用移液枪在核酸提取芯片41的进样腔411加入500μL Buffer MW1。按步骤(1)控制微流体驱动单元3，按步骤(3)控制蠕动泵31，震荡混匀15s，按步骤(4)操作，静置吸附磁珠2min后，将核酸提取芯片41进样腔411和混合腔413内的溶液通过微管道35转移进废液腔412。
(7)用移液枪在核酸提取芯片41的进样腔411加入500μL Buffer MW2。按步骤(6)操作控制微流体驱动单元3。
(8)重复一次步骤(7)。用移液枪在核酸提取芯片41的进样腔411加入100μLNuclease Free Water，用移液枪来回推吸1min，静置5min，将核酸提取芯片41放到磁铁上，让混合腔413和进样腔411的底部与磁铁紧贴，静置吸附3min，用移液枪将进样腔411内的溶液吸出，放在EP管中备用。
使用本发明装置和Roche MP24核酸提取仪分别对相同的样本进行核酸提取，并将提取到的核酸进行比较。在Tanon 2500全自动数码凝胶图像分析系统上获得的凝胶电泳图和ThermoFisher的NanoDrop 2000紫外-可见分光光度计测得的核酸质量数据图如图6所示。从凝胶电泳图(图6中的a)中的Mark条带(6a-1)、装置提取的核酸条带(6中的a-2)和Roche MP24提取的核酸条带(6中的a-3)可以看出，本发明装置提取的核酸完整性好，比较装置提取核酸的质量数据图(图6中的b)和Roche MP24提取核酸的质量数据图(图6中的c)可以看出，本发明装置提取的核酸质量好。因此本发明装置具有近似于Roche MP24核酸提取仪的核酸提取能力。
2、结合四腔芯片42进行实时荧光PCR检测
(1)配置体系。按照四腔芯片42每个反应腔421体积20μL配置反应体系。取四支EP管，分别加入10μL的Probe qPCR Mix、0.5μL的Probe、2μL的模板DNA、5.5μL的灭菌水，然后在每个EP管中分别加入不同类型的上下游引物各1μL。将EP管放到涡旋振荡器上混匀，用移液枪将四支EP管中的混合液分别注入四腔芯片42的反应腔421中，用堵头密封进样口422。
(2)PCR扩增。将完成样品混合液加载的四腔芯片42放到温度控制平台5上，让四腔芯片42上反应腔421的底部与温度控制单元5上的银质热沉片51紧贴。智能手机1通过蓝牙向微控制单元2发送命令，微控制单元2控制温度控制单元5为PCR扩增提供温度条件。首先95℃持续30s实现Taq酶预变性，然后按照95℃持续5s、57℃持续40s运行40个循环。智能手机1通过蓝牙接收微控制单元2发送的温度数据，将温度数据实时的显示在手机界面上，如图7中的a所示。
(3)荧光图像采集。在智能手机1上定制软件内设置拍照温度和延迟时间，当反应到达拍照温度后，经过延迟时间，智能手机1自动向微控制单元2发送开灯命令，然后自动拍照，拍照结束再向微控制单元2发送关灯命令，在每个温度循环内都会拍摄一张荧光图像；进行多重PCR扩增定量检测时，要设置拍照温度、延迟时间和间隔时间来进行自动拍照，在到达拍照温度，经过延迟时间，并自动开灯和拍照后，智能手机1向微控制单元2发送步进电机旋转命令，存储在微控制单元2内的算法程序控制步进电机66进行精确的角度旋转，带动转盘65转动，在间隔时间内进行荧光镜片组64的切换并自动拍照，每个循环内都会拍摄六张不同的荧光图像。将拍摄的荧光图像保存到手机上。
(4)图像处理和数据共享。使用智能手机1上定制的软件对拍摄的荧光图像进行图像处理。将保存到手机上的荧光图像加载到软件上，通过软件内的图像处理算法对荧光图像进行荧光强度分析，绘制荧光强度曲线(图7中的b)，将处理后的实验数据保存。在智能手机的定制软件上自动定位当前位置，并保存当前的位置信息(图7中的c)。将保存的实验数据和位置信息通过数据网络进行共享。
3、结合树形芯片43进行等温扩增检测
(1)芯片点样。使用博奥生物的PersonalArrayerTM16个人点样仪在树形芯片43的玻璃基底上点样。将上游引物和下游引物配成80μM/L的混合溶液，加入到点样仪的样品孔板中，在点样仪的软件控制界面对点样仪进行设置，按照树形芯片43的尺寸，使用点样针在玻片的中部位置点一个行间距5mm、列间距21.5mm的4×2的点阵，每个点的溶液体积为1.2μL，然后将玻片放在避风橱内自然晾干。
(2)芯片键合。将点样完成的玻片与树形芯片43的PDMS主体贴合，让芯片中间的八个反应腔431完全覆盖在点上。使用热压键合机对玻片和PDMS主体进行热压键合。
(3)配置体系。使用RPA核酸扩增试剂盒配置等温扩增反应体系。取一支EP管，用移液枪加入100μL的2x Reaction Buffer，20μL的dNTPs Mix，20μL的10x Probe E-mix，10μL的20x core Reaction，5μL的50x EXO(per reaction)，10μL的MgOAc，10μL的模板DNA，总计175μL的混合溶液，将EP管放到涡旋振荡器上混匀。
(4)反应试剂加载。在树形芯片43每个反应腔的排气孔434上贴上一层ePTFE膜，用移液枪将混匀的反应试剂从进样口432注入到树形芯片43内，反应试剂通过微流道433均匀充满每个反应腔431，多余的反应试剂通过出样口435排出。用移液枪将密封油从进样口432注入树形芯片43内，密封油将微流道433内的反应试剂通过出样口435排出，并充满微流道433，密封隔离各个反应腔431，然后在每个密封槽436内填入密封膜。
(5)等温扩增反应。将完成反应试剂加载和密封的树形芯片43放到温度控制平台5上，让反应腔431的底部与温度控制单元5上的银质热沉片51紧贴。智能手机1通过蓝牙向微控制单元2发送命令，微控制单元2控制温度控制单元5在39℃恒温保持30min，智能手机1通过蓝牙接收微控制单元2发送的温度数据，将温度数据实时的显示在手机界面上。
(6)荧光图像采集和结果分析。在智能手机1的定制软件内对扩增过程进行手动拍照。点击开灯按钮，智能手机1向微控制单元2发送开灯命令，点击拍照，拍照结束后，点击关灯按钮发送关灯命令。分别在实验开始和结束时进行拍照，如图8所示，比较实验开始时拍摄的荧光图片(图8中的a)和实验结束时拍摄的荧光图片(图8中的b)的对应反应腔的荧光强度变化，对实验结果进行定性判断。
4、以ASFV为例对实际样本进行检测
本实施例中使用的ASFV是本发明装置可以检测的一种病毒，但不是唯一的一种病毒。本发明装置是一种多功能通用型的病原体核酸分析装置，可以对任何病原体的核酸进行分析检测。
(1)将患有ASFV的猪的口腔拭子样本进行前处理，得到悬浮液样本。使用核酸提取芯片按照实施例1所述的操作步骤对悬浮液样本进行核酸提取。
(2)按照实施例2所述配置反应体系。取一块四腔芯片42，将四个腔依次标记为ASFV1(实验组1)、ASFV2(实验组2)、Positive(阳性对照组)、Negative(阴性对照组)。在ASFV1和ASFV2腔中分别加入使用悬浮液样本提取出的核酸作为模版配置的反应溶液，Positive腔中加入使用人的血清提取的人的基因组核酸作为模板配置的反应溶液，Negative腔中加入由水代替模板配置的反应液。
(3)按照实施例2所述设置反应温度，设置荧光图像采集模式。使用FAM通道在每个温度循环内进行一次自动拍照。
(4)对拍摄的荧光图像进行处理，绘制荧光强度曲线图，如图9示，横坐标代表qPCR的循环个数，纵坐标代表每个循环拍摄的荧光图像中荧光区域的荧光强度。从图中可以看到，随着循环数增加，Negative腔的荧光强度没有增加，Positive腔的荧光强度有增加，说明Negative腔中没有扩增，Positive腔中有扩增，实验成功；ASFV1和ASFV2腔的荧光强度都有增加，说明都有扩增，且两条曲线近似重合，说明使用的拭子样本中含有ASFV。本发明装置成功对ASFV的实际样本进行了分析检测。

Claims (9)

1.一种基于智能手机的集成核酸提取扩增检测的分析装置，其特征在于：所述分析装置使用智能手机作为主要部件，将智能手机和微流体驱动、温度控制、多色荧光检测集成在一起，形成一个集成核酸提取、扩增和检测的便携式多功能的通用化装置，该装置与微流控芯片相结合，实现片上核酸提取、等温扩增定性检测以及实时荧光定量PCR(QuantitativeReal-time PCR，qPCR)和多重荧光PCR(Multiplex PCR)的检测，实现对病原体核酸的分析检测。
2.根据权利要求1所述的一种基于智能手机的集成核酸提取扩增检测的分析装置，其特征在于：所述核酸分析装置包括智能手机、微控制单元、微流体驱动单元、温度控制单元和荧光检测单元；智能手机用于实验结果的显示以及实验数据的处理和共享，智能手机还通过蓝牙与微控制单元进行通信，实现对整个装置的控制；微流体驱动单元结合微流控芯片实现片上核酸提取；温度控制单元进行温度调控，满足核酸扩增的温度条件，荧光检测单元使用诱导荧光检测法，实现FAM、HEX、TAMRA、ROX、CY5、CY5.5这六种荧光波段的检测。
3.根据权利要求2所述的一种基于智能手机的集成核酸提取扩增检测的分析装置，其特征在于：所述智能手机搭载Android系统，具备蓝牙通信、数据网络通信和后置拍照的功能；智能手机上安装一款自制的软件模块，在该模块内把智能手机与微控制单元通过蓝牙连接，智能手机通过该模块，一方面通过蓝牙向微控制单元发送命令，实现对装置的控制；另一方面通过蓝牙接收微控制单元发送的数据，在智能手机界面上显示；在模块内使用智能手机的相机拍摄荧光图像，智能手机使用模块内的图像处理功能对拍摄的荧光图像进行荧光强度分析，并绘制荧光强度曲线，最后在模块内将处理后的数据保存，并记录下地理位置，通过数据网络将这些数据上传分享。
4.根据权利要求3所述的一种基于智能手机的集成核酸提取扩增检测的分析装置，其特征在于：所述自制的软件模块包括六个控制界面：电机控制界面、温度控制界面、图像采集界面、图像处理界面、绘制曲线界面和数据分享界面；电机控制界面设置蠕动泵、电磁阀和步进电机的工作状态；温度控制界面设置温度控制单元的工作模式，并实时绘制温度曲线；图像采集界面调用智能手机的相机，手动调节相机的焦距、增益和曝光时间，手动打开LED灯进行手动拍照，设置拍照温度点和时间点以及拍照间隔进行自动拍照，并记录拍照次数；图像处理界面对拍摄的荧光图片进行处理，手动框选荧光区域，计算荧光强度；曲线绘制界面将计算出的荧光值绘制成曲线，横坐标为循环数，纵坐标为荧光强度；数据分享界面调用第三方地图软件，显示每次实验的地理位置以及保存的实验结果。
5.根据权利要求2或3所述的一种基于智能手机的集成核酸提取扩增检测的分析装置，其特征在于：所述微控制单元是一块基于STM32的电路板，微控制单元包括：电源转换模块、蓝牙通信模块、温度采集和控制模块、LED灯控制模块、步进电机控制模块、蠕动泵和电磁阀控制模块，电源控制模块将24V的输入电压依次转换为12V、5V、3.3V，蓝牙通信模块与智能手机通信，蠕动泵和电磁阀控制模块控制微流体驱动单元，温度采集和控制模块控制温度控制单元，LED灯控制模块以及步进电机控制模块控制荧光检测单元；微控制单元内存储有蓝牙串口通信算法，步进电机运动控制算法，温度传感器电信号和温度的转换算法，半导体温控片的PID控制和Bang-Bang控制算法，温度补偿算法。
6.根据权利要求2所述的一种基于智能手机的集成核酸提取扩增检测的分析装置，其特征在于：所述微流体驱动单元由蠕动泵、电磁阀和数字步进电机驱动器组成，微流体驱动单元用于实现微流控芯片内的核酸提取，用导气管将蠕动泵和电磁阀分别接到微流控芯片的气阀上，数字步进电机驱动器控制蠕动泵转动，推吸空气，改变气路中的气体压强，驱动微流控芯片里的反应液流动；电磁阀控制气路通断，气路的通断影响反应液的流动方向，通过精确控制蠕动泵的转动速度和方向以及电磁阀导通方向，实现微流控芯片内的核酸提取。
7.根据权利要求2所述的一种基于智能手机的集成核酸提取扩增检测的分析装置，其特征在于：所述温度控制单元由半导体温控片、银质热沉片、温度传感器、铜质鳍片散热器和风扇组成；半导体温控片改变微流控芯片反应腔的温度，银质热沉片提高传热和温度均匀性，温度传感器置于银质热沉片内部中心处，检测微流控芯片的温度并将温度转换为电信号，通过预先存储在微控制单元内的电信号和温度之间的相互关系，确定微流控芯片反应腔的温度并通过PID算法对半导体温控片进行反馈控制，实现高精度的温度控制；铜质鳍片散热器和风扇用于微流控芯片反应腔降温时散热；温度控制单元的装置结构呈层状分布，从上到下，分别为装有温度传感器的银质热沉片、半导体温控片、铜质鳍片散热器和风扇；微流控芯片放在银质热沉片上，温度传感器实时采集微流控芯片反应腔中的温度，根据采集的温度对半导体温控片进行控制，达到升降温的目的；此外，微控制单元内存储的Bang-Bang控制算法可以提高温度控制单元的升降温速率，温度补偿算法可以提高温度控制单元的温度均匀性。
8.根据权利要求2所述的一种基于智能手机的集成核酸提取扩增检测的分析装置，其特征在于：所述荧光检测单元由激发光源、准直光路、六色荧光转台、步进电机、数字步进电机驱动器和智能手机组成；激发光源使用大功率白光LED灯，以满足多波段的荧光激发；准直光路由六块平凸透镜组成，用于激发光的匀光和准直；六色荧光转台采用共聚焦式的荧光激发光路，使用FAM、HEX、ROX、TAMRA、CY5、CY5.5这六个不同激发波段的荧光激发模块；荧光激发模块由激发滤光片、二向色镜和发射滤光片组成，六组荧光激发模块分别使用了不同光学参数的激发滤光片、二向色镜和发射滤光片，每组荧光激发模块的镜片都固定在相同尺寸的金属盒内，六个金属盒固定在一个水平的金属圆盘上，围着圆心排成一个圆，激发滤光片所在的面向外，发射滤光片所在的面向上，二向色镜放在金属盒的对角上，激发滤光片和发射滤光片在二向色镜镜面的两边；步进电机用于支撑金属圆盘，并带动金属圆盘转动，进行荧光切换；数字步进电机驱动器用来对步进电机的旋转角度进行精确控制；智能手机的相机拍摄荧光图像，由激发光源发出的白光，经过准直光路变为准直光，再经过激发滤光片变为单色光，经二向色镜反射后，照射微流控芯片反应腔内反应液的荧光染料或荧光探针，使荧光染料或荧光探针受激发产生荧光；激发出的荧光透过二向色镜，再经发射滤光片滤光，被智能手机的相机接收；智能手机将荧光图像拍摄并保存；使用多种荧光染料或荧光探针时，微控制单元首先通过光电开关对六色荧光转台进行位置校准，让FAM通道的荧光镜片组正对准直光路，然后通过步进电机驱动器精确控制步进电机的旋转角度，带动六色荧光转台旋转，使六色荧光转台每次旋转60°，进行精确的荧光通道切换，实现核酸的多重荧光检测。
9.一种基于智能手机的集成核酸提取扩增检测的分析方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)核酸提取
将微流体驱动单元和核酸提取芯片用导气管连接，在芯片内加入样品、磁珠和提取试剂，智能手机通过蓝牙与微控制单元进行通信，在自制软件模块的电机控制界面控制蠕动泵和电磁阀的工作状态，实现反应液在芯片内的震荡混合和转移，按照磁珠法提取核酸的操作步骤在芯片上完成核酸提取；
(2)体系配置
将提取的核酸和扩增试剂按照体系配比，配制成扩增反应液；
(3)体系加载
将扩增反应液加载到微流控芯片内，其中PCR扩增反应液加载到四腔芯片内，等温扩增反应液加载到点样后的树形芯片内；
(4)温度设置
将完成反应液加载的芯片放到温度控制单元的热沉片上，在自制软件模块的温度控制界面设置温度控制单元的工作模式，通过调用微控制单元内存储的程序，可以实现等温扩增温度控制和PCR扩增温度控制；
(5)图像采集
在自制软件模块的电机控制界面，控制步进电机位置校准，使FAM通道的荧光镜片组正对准直光路，然后控制步进电机旋转选择需要的荧光通道。在图像采集界面，手动设置相机的焦距、增益和曝光时间，并调节智能手机的位置，使图像采集界面的中心位置可以看到清晰且对比度高的荧光图像，设置拍照参数，其中等温扩增反应使用手动拍照的方式采集反应开始前和反应结束后的荧光图像；qPCR根据温度控制单元设置的温度条件对拍照温度点和拍照时间进行设置，在每个PCR循环内，到达拍照温度点后，经过拍照时间的延时，自动打开LED并拍摄一张荧光图像，拍照结束后关闭LED灯；Multiplex PCR根据温度控制单元设置的温度条件对拍照温度点、拍照时间和拍照间隔进行设置，在每个PCR循环内，到达拍照温度点后，经过拍照时间的延时，自动打开LED并拍摄一张荧光图像，拍照结束后经过拍照间隔再次进行拍照，在拍照间隔内，步进电机将切换荧光通道，在每个PCR循环内，六个荧光通道各拍摄一张图片，拍照完成后关闭LED灯，步进电机将荧光通道切换到初始通道；
(6)图像处理
在自制软件模块的图像处理界面，将拍摄的荧光图像加载到界面上，其中qPCR加载最后一个循环的荧光图像，使用图像处理界面上的框选工具对荧光图像上的荧光区域进行手动框选，在曲线绘制界面，软件模块内部的算法程序会自动计算出框选区域的荧光强度值，然后绘制出荧光强度曲线；Multiplex PCR拍摄的荧光图像会按照单个PCR循环内的拍照顺序进行分类，使同一荧光通道拍摄的荧光图像放在一起，然后按照qPCR的方法对每个通道进行单独分析；
(7)结果保存和分享
将绘制的荧光强度曲线进行重命名并保存在本地，软件模块内部程序会自动保存当前的地理位置，在数据分享界面，调用第三方地图软件，在界面上可以看到所有重命名后的实验以及对应的地理位置，点击实验名称查看实验结果，然后通过网络传输将数据分享给其他人。
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