CN111166870A - 艾塞那肽在制备滴眼治疗眼部缺血疾病、改善眼部血液循环的药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医药技术领域,具体涉及艾塞那肽在制备滴眼治疗眼部缺血疾病改善眼部血液循环的药物中的应用,艾塞那肽可用于治疗急性青光眼发作等眼部缺血疾病、改善眼部血液循环。本发明通过建立急性缺血再灌注模型、模拟急性青光眼发作损害,证明Exendin‑4的滴眼液制剂可以改善视网膜血管内皮功能、舒张视网膜毛细血管、恢复眼底血液循环,从而有效减轻急性青光眼等眼部缺血性疾病造成的眼底血供受损。同时证明新的药物剂型(滴眼制剂)可以在避免全身作用的前提下达到有效的局部作用。本发明可用于治疗急性青光眼、早产儿视网膜病变和视网膜血管阻塞性疾病等眼底血供不足类疾病,挽救视功能。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域,具体地说,是艾塞那肽在制备滴眼治疗眼部缺血疾病改善眼部血液循环的药物中的应用。
背景技术
眼底视网膜对血氧供应的需求极大,高效的供给保证了眼底视神经代谢的正常运作,而视网膜血流的减少,往往会导致视神经细胞的损害[1]。缺血再灌注可存在于多种眼内疾病状态,包括急性青光眼发作、早产儿视网膜病变、视网膜血管阻塞性疾病等[2]。其中,急性闭角型青光眼大发作的病人,其眼压往往急剧升高,甚至可达到60mmHg以上,此时眼底血流明显减少,眼压越高、持续时间越久,对视神经的损害就越重。然而当穿刺放液等方式降低眼压、恢复血液供应后,眼底组织可能会进一步发生“缺血再灌注”导致的损害。在一项针对大发作病人患眼眼底血流的研究中也发现,大发作1月后视乳头旁毛细血管血流灌注和血管密度较对侧健眼显著减少[3]。因此,寻找可能改善疾病状态下血流供应的有效方法具有重要意义。然而目前针对改善眼底血供的治疗及研究仍较少,临床使用上以银杏叶提取物为主,难以满足临床需要,亟待更有效更安全的治疗方法。Exendin-4目前已广泛应用于临床治疗二型糖尿病(商品名艾塞那肽,Exenatide),其本质是胰高血糖素样肽-1的受体激动剂(GLP-1RA),通过皮下射射给药用于降低血糖。但已有研究发现GLP-1RA类药物具有血管活性调节功能[4-10]。
一方面,目前临床上应用Exendin-4是通过皮下注射降低血糖,皮下注射是有创治疗,而且作为全身给药的方式会对眼部以外的其他组织或器官发挥作用。另外,尽管目前科研上,Exendin-4在眼科已有部分研究,但集中于眼部神经病变或血眼屏障等方向[11-14],而对眼底血管舒缩调节及能否影响血流供应还未有相关研究。同时,滴眼液制剂作为无创、且对全身影响较少的局部用药方法,目前也尚未有将其应用于改善眼部血流的研究。另一方面,从目前已有的临床改善眼底血供的药物来看,临床上以银杏叶提取物为主,治疗手段相对单一,临床效果并不很理想。
Exendin-4,作为GLP-1RA类主要的临床应用药物之一,临床疗效及安全性都已得到了广泛证实,通过“老药新用”、将临床降糖药以更加安全无创的方式用于改善眼底血液循环,从而减轻如急性青光眼发作等眼部缺血性疾病造成的眼部血供损害。
关于本发明艾塞那肽在制备滴眼治疗眼部缺血疾病改善眼部血液循环的药物中的应用目前还未见报道。
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发明内容
本发明的第一个目的是针对现有技术的不足,提供艾塞那肽的新用途。
本发明的第二个目的是针对现有技术的不足,提供一种预防和/或治疗眼部缺血疾病的药物。
为实现上述第一个目的,本发明采取的技术方案是:
艾塞那肽在制备滴眼预防和/或治疗眼部缺血疾病的药物中的应用。
优选地,所述眼部缺血疾病选自下组:急性青光眼、早产儿视网膜病变和视网膜血管阻塞性疾病。
艾塞那肽在制备改善视网膜血管内皮功能的药物中的应用。
艾塞那肽在制备舒张视网膜毛细血管的药物中的应用。
艾塞那肽在制备改善视网膜组织eNOS的mRNA及蛋白表达的药物中的应用。
优选地,所述的药物按照药物常规制备方法制备成临床上可接受的药物制剂。
优选地,所述药物制剂选自下组:溶液、乳膏、洗液、软膏、乳液和悬浮液。
优选地,所述药物制剂为滴眼剂溶液。
为实现上述第二个目的,本发明采取的技术方案是:
一种预防和/或治疗眼部缺血疾病的药物,所述的药物是由上所述的艾塞那肽和药学上可接受的赋形剂和/或载体组成,所述的眼部缺血疾病选自下组:急性青光眼、早产儿视网膜病变和视网膜血管阻塞性疾病。
优选地,所述的药物为滴眼剂溶液。
本发明优点在于:
拓宽了降糖药物的研究领域,并对目前exendin-4的心血管作用及其机制研究作了重要的补充。相对于GLP-1RA类药物传统的皮下注射的给药方式,首先,眼部局部给药因为其局部浓度高,可以节省总的用药量。其次滴眼的方式是通过逐步渗透而非直接进入人体血液循环,因而大大降低了其可能引起的全身副作用,相对来讲更加安全而有效。另外,滴眼给药的方式,相对于皮下注射或玻璃体腔内注射更为方便而且无创、无痛,可以减少使用者的恐惧心理,大大提高了使用的依从性,对全身的影响较少,为未来向眼科临床方向的转化提供了更大的可能。
另外,本发明通过在体离体等一系列实验(急性缺血再灌注模型,在专业上被认为是急性青光眼、视网膜血管阻塞疾病的经典模型)证明,Exendin-4的滴眼液制剂可以通过改善视网膜血管内皮功能、恢复眼底血液循环,从而有效减轻急性青光眼等眼部缺血性疾病造成的眼部血供损害,其适应症包括:急性青光眼发作、早产儿视网膜病变、视网膜血管阻塞性疾病等眼部缺血性疾病。
综上,本发明证明Exendin-4的滴眼液制剂可以通过改善视网膜血管内皮功能、恢复眼底血液循环,从而有效减轻如急性青光眼发作、早产儿视网膜病变、视网膜血管阻塞性疾病等眼部缺血性疾病造成的眼部血供损害,将临床上已证明安全性可靠的药物引入新的适应症,为包括急性青光眼发作、早产儿视网膜病变、视网膜血管阻塞性疾病等眼部缺血性疾病等疾病在内的眼底血供不足类疾病提供了更多的治疗选择,且有利于exendin-4这一糖尿病领域的老药在眼科及血管保护研究领域焕发新的光彩。
附图说明
附图1是exendin-4对NA预收缩后的大鼠视网膜毛细血管的舒张作用;
图A:DIC下同一根血管分别依次在正常ACSF(CSF)、加入NA的ACSF(NA,6mM)以及6mM NA+20μM exendin-4的ACSF中灌流的毛细血管反应图,红色横线为毛细血管直径,黄色箭头为标示周细胞胞体所在位置,标尺为10μm长度;
图B:相对于未收缩状态的大鼠视网膜毛细血管标准化管径直径图;
图C:相对于未收缩状态的大鼠视网膜毛细血管周细胞标准化胞体直径图;
柱状图内数字为所测量毛细血管直径数量。*,p<0.05;**,p<0.01;***,p<0.001。
附图2是不同剂型给予exendin-4对大鼠血糖的影响;纵坐标为给药前后的血糖变化百分比,横坐标为不同给药方式及浓度,依次为PBS对照组、皮下注射组(低剂量组、高剂量组)、玻璃体腔注射组(低剂量组、高剂量组)、滴眼给药组(低剂量组、高剂量组)。
附图3是缺血再灌注模型下外源性exendin-4给药对eNOS蛋白及基因表达的改变;
图A:Protein Western显示大鼠视网膜组织蛋白表达量变化,各组依次为正常对照组(C)、缺血再灌注模型下PBS对照组(Hp+PBS)、皮下注射组(10μg EX4/Kg,Hp+EX4sc.)、玻璃体腔注射组(1μg/μl,Hp+EX4iv.)、以及滴眼给药组(1μg/μl,Hp+EX4OD);
图B:大鼠视网膜组织eNOSmRNA表达变化;
图C、D:柱形图显示大鼠视网膜蛋白表达量变化,*,与正常对照组相比较p<0.05;#,与缺血再灌注模型下PBS对照组相比较p<0.05。**、##,p<0.01。
具体实施方式
下面结合具体实施方式,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解,在阅读了本发明记载的内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1动物实验
1实验材料
药物选用Exendin-4和去甲肾上腺素(NA),均购自MedChemExpress公司(美国)。动物选用购买自上海西普尔-必凯实验动物有限公司的成年雄性Sprague Dawley(SD)清洁级大鼠,体重200-250g,饲养于常温(22-25摄氏度)环境,食物及饮用水充足。所有动物实验流程及操作均符合ARVO实验动物护理与使用规范,经过复旦大学附属眼耳鼻喉科医院伦理委员会批准。
2实验方法
2.1组织的选取
使用10%的水合氯醛腹腔注射将SD大鼠麻醉,剂量为0.4ml/100g体重,待大鼠深度麻醉后,局部滴奥布卡因滴眼液进行表麻,利用弯镊将眼球夹起,用眼科剪将眼球剪下剜除,剪下的眼球迅速放入充氧的人工脑脊液中。利用1号针头在角巩膜缘戳一切口,一手拿弯镊固定大鼠眼球,另一只手利用显微剪从切口处进入,沿角巩膜缘环剪一圈。剔除角膜、虹膜、晶体等前节组织后,用显微镊小心、轻轻分离视网膜与脉络膜使其分离,小心分离后部视乳头连接处将视网膜取下,沿水平及垂直轴将周边部视网膜呈花瓣状切开。
2.2人工脑脊液配置
人工脑脊液(ACSF)使用均为超滤水,每次现用现配,使用时需要持续通入95%的氧气及5%二氧化碳,使用前需保证已通气30分钟以上。其成分及含量为葡萄糖15mmol/L,氯化钠125mmol/L,氯化钾3mmol/L,,氯化钙2mmol/L,氯化镁2mmol/L,碳酸氢钠26mmol/L,碳酸氢二钠1.25mmol/L,pH值调为7.4。
2.3DIC观测大鼠视网膜毛细血管
将已切开的整片视网膜用移液管小心移入DIC灌流槽中,用显微镊小心展平在槽底尼龙丝网上,并用U型铂金丝网进行固定,调节细准焦及粗准焦螺旋,最终在40倍水镜下找到视野下局部清晰的毛细血管(直径小于10微米且未见平滑肌组织),打开显示器及视频采集软件(Open Broadcaster Software,22.0)进行录制。实验全程操作均在有充氧的ACSF灌流基础上,灌流速度约为5-10ml/min。ACSF灌流5分钟左右,视网膜毛细血管状态稳定以后,换用含去甲肾上腺素6mM(NA)的ACSF进行灌流,待收缩保持稳定后(后期实验结果显示2-4分钟即可达到收缩稳定状态)换用含有NA及exendin-4的ACSF进行灌流观察。因为血管中周细胞对NA的收缩反应能力不同,为防止对后续实验的观察仅选用毛细血管收缩直径小于原直径80%的进行分析。
2.4大鼠视网膜急性青光眼模型制备
2.4.1使用10%的水合氯醛将SD大鼠麻醉,剂量为0.4mg/100g体重,待大鼠深度麻醉后,将大鼠平铺于桌面,右侧向上,下方垫柔软的桌布,注意老鼠的保温,右眼局部滴托吡卡胺滴眼液进行扩瞳,5分钟后滴盐酸奥布卡因滴眼液进行表麻。待大鼠瞳孔扩大后,将静脉留置针头从大鼠角膜缘进针,注意防止戳到虹膜及晶状体,金属针芯进入前房后,将其缓慢抽出,留下软针头在前房内,针头后方与装有生理盐水的静脉输液器相连,其中生理盐水瓶内最高水位与大鼠眼球位置垂直相差约95cm(压力差大约为70mmHg)。手术显微镜下通过眼底透镜可看见眼底血管极细,几近断流,此时测量眼压范围一般在70-79mmHg。维持高压灌注1小时后,每2分钟下降生理盐水瓶15-20cm高度,梯度降低灌注压防止出现脉络膜爆发性出血。将老鼠放置在温暖干净的环境中2小时(经预实验摸索后确认为2小时,预实验摸索中设置血流再灌注时间分别为0、2、4、15小时)完成眼底血流再灌注后,采用水合氯醛过量注射处死动物。高压灌注前、灌注后5min、30min及处死动物前均用TonoLab回弹式眼压计测定大鼠眼压。
2.4.2视网膜组织分离与第一部分相同:利用弯镊将眼球夹起,同时用眼科剪将眼球剪下剜除,剪下的眼球迅速放入充氧的人工脑脊液中。利用1号针头在角巩膜缘戳一切口,一手拿弯镊固定大鼠眼球,另一只手利用显微剪从切口处进入,沿角巩膜缘环剪一圈。剔除角膜、虹膜、晶体等前节组织后,用显微镊小心、轻轻分离视网膜与脉络膜使其分离,小心夹断后极视神经后将视网膜取下。将取下后的视网膜组织剥离掉多余的玻璃体残留后放入标记好的EP管,迅速放进-80度极低温冰箱保存以备下一步实验。
2.4.3实验分组如下:
1)正常对照组。
2)高眼压组+PBS组。
3)高眼压+exendin-4组,其中按照给药方式及浓度不同分为以下,
a.高眼压+exendin-4皮下注射低剂量组(1μg/Kg体重;溶于0.9%生理盐水;溶液总体积0.6ml);
b.高眼压+exendin-4皮下注射高剂量组(10μg/Kg体重;溶于0.9%生理盐水;溶液总体积0.6ml);
c.高眼压+exendin-4玻璃体腔注射低剂量组(1μg/Kg体重;溶于0.9%生理盐水;浓度0.1μg/μl);
d.高眼压+exendin-4玻璃体腔注射高剂量组(10μg/Kg体重;溶于0.9%生理盐水;浓度1μg/μl);
e.高眼压+exendin-4滴眼给药低剂量组(2.5μg/Kg体重;溶于0.9%生理盐水;浓度0.1μg/μl);
f.高眼压+exendin-4滴眼给药高剂量组(25μg/Kg体重;溶于0.9%生理盐水;浓度1μg/μl)。
2.5皮下注射、玻璃体腔注射及滴眼局部给药
所有大鼠均在表麻后、高压灌注(正常对照组根据同批次时间点)之前进行皮下注射、玻璃体腔注射及滴眼途径,根据实验分组决定给予exendin-4或是PBS。
皮下注射给药:用1ml针管抽取0.6ml药物或PBS,提起大鼠背部颈侧上方的皮肤,由皮肤进针推入,注射完毕后针头在内停留10秒钟左右,缓慢抽出针头。
玻璃体腔注射:大鼠瞳孔扩大后,在上方放置橡胶圈,滴一滴清水此刻因为表面张力缘故橡胶圈成为了一个简易透镜。在手术显微镜下可以观察到血管等眼底组织,使用细针头在角巩膜缘偏下方刺入一点,利用微量注射器抽取药物或PBS后沿着针点进入玻璃体腔,缓慢推注,停针10秒左右抽出微量注射器。
滴眼给药:用移液枪抽取药物或PBS,撑开大鼠眼睑,令药物滴入大鼠眼睑内,等待10秒左右停止固定其眼睑。
2.6Wes法测定大鼠视网膜组织eNOS的蛋白表达及磷酸化水平
所有操作于冰上进行。使用厂家配备的standard Pack 1里的试剂,按照说明依次配置DTT溶液、Ladder及5×Master Mix(loading buffer)。每个孔按4.5μl的体积进行配置,其中包含5×Master Mix0.9μl,样品原液根据所测得实际浓度最终配制为终浓度为2μg/μl。最后用0.1×Sample Buffer补齐到4.5μl的体积。一抗反应液:由一抗及厂家自带的Antibody Diluent II进行稀释后使用。抗体浓度为:β-actin(CST,1:200),eNOS(Abcam,1:50),p-eNOS(CST,1:50)。二抗反应液由厂家试剂盒自带,包括兔抗和小鼠抗两种二抗。发光液:取200μl的Lumino-S和Peroxide进行充分混合。根据反应板要求使用液相反吸法加样,注意杜绝出现气泡。最后在孔板的前三大行中加入每孔500μl的Wash Buffer。将加样后样品板放入离心机中,注意提前配平及保持离心机内22℃左右的温度,3000rpm离心7分钟。离心后检测确认没有气泡,撕去样品板下方封膜放入机器中,同时将对应的毛细管板架置于机器上方卡槽中,设置机器参数后运行。
2.7数据分析与统计
毛细血管直径及周细胞胞体横径的测量使用ImageJ软件,每个数值测量三遍取平均值。统计软件使用SPSS22.0,连续型数据使用平均值±标准误进行表示,组间血管直径的变化使用随机区组ANOVA分析,两两比较使用LSD检验进行。两两相关的分析使用Pearson相关进行统计。P值小于0.05认为差异有统计学意义。
3实验结果
3.1离体实验发现Exendin-4可舒张NA处理后预收缩的大鼠视网膜毛细血管
如图1,NA预收缩后直径为原直径大小的56.21±2.39%,exendin-4舒张后直径为原直径大小的90.59±3.09%。相对于未收缩状态的大鼠视网膜毛细血管周细胞标准化胞体直径图,NA预收缩后胞体横径为原胞体横径大小的130.8±3.94%,exendin-4舒张后胞体横径为原胞体横径大小的99.98±3.55%。
3.2外源性给予Exendin-4不影响大鼠随机血糖
通过皮下注射、玻璃体腔注射以及滴眼的方法外源性给予急性青光眼模型大鼠exendin-4,实验前后两次测量尾静脉血糖,并与给予PBS的对照组相比较。结果如图2,对照组、皮下注射低剂量组、皮下注射高剂量组、玻璃体腔注射低剂量组、玻璃体腔注射高剂量组、滴眼给药低剂量组以及滴眼给药高剂量组,其血糖给药前后变化百分比分别为7.143±11.90%、-2.452±10.14%、2.670±5.11%、-1.757±7.61%、2.950±7.53%、10.419±6.73%和14.493±12.36%,给药各组与PBS对照组之间无统计学差异(p>0.05)。
3.3大鼠急性青光眼模型下外源性滴眼给予exendin-4可改善eNOS表达
在缺血再灌注病理条件下,大鼠视网膜组织eNOS的mRNA表达量、蛋白表达量及其蛋白磷酸化水平都发生显著下降。应用qPCR结果显示疾病模型组大鼠视网膜eNOS的mRNA转录水平相比正常组降低(0.21±0.00vs1.001±0.0004,p<0.01),对疾病模型组老鼠通过不同途径给予exendin-4后,皮下注射低剂量组、皮下注射高剂量组、玻璃体腔注射低剂量组、玻璃体腔注射高剂量组、滴眼给药低剂量组以及滴眼给药高剂量组,其mRNA相比未给药组没有明显升高(p>0.05,图3B)。
应用ProteinWestern对大鼠视网膜组织eNOS及p-eNOS进行测量发现(图3A,C,D),eNOS蛋白表达水平在各组之间没有显著差别(p>0.05)。eNOS的磷酸化水平(p-eNOS)在疾病模型组大鼠视网膜中,相对于正常组明显下降(0.43±0.06vs0.97±0.04,p<0.001);皮下注射组、玻璃体腔注射组、以及滴眼给药组,其p-eNOS的蛋白表达水平分别为0.53±0.10、0.87±0.11及0.75±0.05,其中I/R模型下exendin-4玻璃体腔注射组及滴眼给药组相对于I/R未给药组均有明显升高(p<0.05)。
4结论
本发明通过建立急性缺血再灌注模型(在专业上被认为是急性青光眼、视网膜血管阻塞疾病的经典模型)证明,Exendin-4的滴眼液制剂可以通过改善视网膜血管内皮功能、恢复眼底血液循环,从而有效减轻急性青光眼等眼部缺血性疾病造成的眼部血供损害,其适应症包括:急性青光眼发作、早产儿视网膜病变、视网膜血管阻塞性疾病等眼部缺血性疾病。另外,相对于GLP-1RA类药物传统的皮下注射的给药方式,首先,眼部局部给药因为其局部浓度高,可以节省总的用药量。其次滴眼的方式是通过逐步渗透而非直接进入人体血液循环,因而大大降低了其可能引起的全身副作用,相对来讲更加安全而有效。另外,滴眼给药的方式,相对于皮下注射或玻璃体腔内注射更为方便而且无创、无痛,可以减少使用者的恐惧心理,大大提高了使用的依从性,对全身的影响较少,为未来向眼科临床方向的转化提供了更大的可能。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和补充,这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.艾塞那肽在制备滴眼预防和/或治疗眼部缺血疾病的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述眼部缺血疾病选自下组:急性青光眼、早产儿视网膜病变和视网膜血管阻塞性疾病。
3.艾塞那肽在制备改善视网膜血管内皮功能的药物中的应用。
4.艾塞那肽在制备舒张视网膜毛细血管的药物中的应用。
5.艾塞那肽在制备改善视网膜组织eNOS的mRNA及蛋白表达的药物中的应用。
6.根据权利要求1-5任一所述的应用,其特征在于,所述的药物按照药物常规制备方法制备成临床上可接受的药物制剂。
7.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,所述药物制剂选自下组:溶液、乳膏、洗液、软膏、乳液和悬浮液。
8.根据权利要求7所述的应用,其特征在于,所述药物制剂为滴眼剂溶液。
9.一种预防和/或治疗眼部缺血疾病的药物,其特征在于,所述的药物是由权利要求1所述的艾塞那肽和药学上可接受的赋形剂和/或载体组成,所述的眼部缺血疾病选自下组:急性青光眼、早产儿视网膜病变和视网膜血管阻塞性疾病。
10.根据权利要求9所述的药物,其特征在于,所述的药物为滴眼剂溶液。
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