CN105999272A - 胰高血糖素样肽-1受体激动剂制备治疗肺动脉高压药物的应用 - Google Patents

Abstract

本发明首次发现胰高血糖素样肽‑1受体激动剂治疗肺动脉高压的新用途。本发明用多种实验证实该类药物能够有效地降低细胞糖酵解水平，抑制肺血管细胞的异常增生，显著减轻肺血管重构，从而降低肺血管阻力和肺动脉压力,治疗肺动脉高压。

Description

胰高血糖素样肽-1受体激动剂制备治疗肺动脉高压药物的 应用

本申请针对申请号为201510428001.0申请日为2015年7月20日的中国专利申请提出优先权请求。

技术领域：

本发明涉及胰高血糖素样肽-1受体激动剂的新用途，特别涉及其在制备肺动脉高压治疗药物方面的应用。

背景技术：

胰高血糖素样肽-1(以下亦简称GLP-1)是小肠L-细胞在肠腔内营养物质的刺激下所分泌产生的内源性激素。

现有技术中的报道中，GLP-1主要是对糖代谢的作用，包括刺激胰岛素释放，阻止胰高血糖素分泌，减慢胃排空，以及增加饱腹感等，这些效应的产生是通过GLP-1受体实现的。GLP-1受体属于G蛋白偶联受体，分布于胰岛、肾脏、脑、心脏、胃肠道和肺血管等组织或器官。内源性GLP-1作用时间有限，迅速被DDP-4酶降解。因此，人工合成的能够抵抗DDP-4降解的GLP-1类似物先后被研发出来，作为GLP-1受体激动剂用于2型糖尿病的治疗，如：艾塞那肽、利拉鲁肽和利西拉来等。此外，利拉鲁肽近期还被美国食品和药品管理局(FDA)批准用于肥胖症治疗。

肺动脉高压指由各种原因引起的肺血管床结构和/或功能的改变，导致以肺血管阻力进行性升高为特点的临床综合征。在肺动脉高压的形成和发展机制中，致死性、难治性的进行性肺血管重构具有极为重要的作用。肺血管重构以平滑肌细胞增殖和内皮细胞功能障碍为主要特征，可以导致肺动脉血管闭塞，引起肺血管阻力和肺动脉压力明显增高，进而可诱发右心室功能不全。

肺动脉高压预后较差，平均存活时间仅为2.8年，其早期诊断和治疗仍然是目前面临的临床难题。肺动脉高压药物治疗十分困难，目前临床用药，其治疗机制主要是通过扩张肺血管来降低肺血管阻力和肺动脉压力，如：钙通道阻滞剂、前列环素、磷酸二酯酶-5抑制剂等，上述药物仅缓解压力，但对于抑制细胞增殖和血管重构没有明确的作用。

尽管已知利拉鲁肽等GLP-1受体激动剂对糖代谢的调节作用可通过激活AMPK通路实现，而AMPK作为机体调节代谢的核心分子被激活可促进分解代谢，下调合成代谢，恢复能量代谢平衡，同时可降低HIF-1α表达，抑制糖酵解水平的异常升高。但目前并未见到GLP-1受体激动剂用于肺高压治疗的研究报道。

发明内容

本发明的最终目的是提供一种肺动脉高压治疗药物，直接目的是发现GLP-1受体激动剂的新的功能——用于肺动脉高压的治疗，特别是在有效抑制异常的细胞增生，减轻肺血管重构方面的作用。

发明人基于以下认识和分析，设计了本发明的技术方案：

肺血管平滑肌细胞异常增殖与糖代谢异常有着密切的关系。对于肺动脉高压患者，由于缺氧诱导因子HIF-1α的表达和活化异常增强，会引起一系列与糖代谢有关的酶，如葡萄糖转运体、己糖激酶、乳酸脱氢酶A、丙酮酸脱氢酶激酶和丙酮酸脱氢酶等的改变，从而导致肺血管细胞的葡萄糖代谢方式从正常的线粒体有氧氧化向异常的糖酵解转化，糖酵解不断增强，糖酵解的中间代谢产物可为细胞增殖合成DNA等提供大量底物，而且，细胞氧耗与能量合成平衡被打破，能量代谢效率下降，线粒体功能障碍，从而破坏了肺血管平滑肌细胞的增殖与凋亡之间的动态平衡，导致或促进肺血管重构和肺动脉高压的形成。

本发明人认为，如果能应用GLP-1受体激动剂，通过其对细胞糖代谢的调节作用，抑制细胞糖酵解，促进线粒体功能，恢复细胞代谢效率，就有可能控制或逆转肺血管平滑肌细胞和内皮细胞的异常增殖，从而延缓甚至逆转肺血管重构，达到治疗肺动脉高压的目的。

因此，推测这类药物有可能用于肺动脉高压的治疗。

本发明用动物实验、体外分子生物学实验等多方实验验证了上述设想，首次证实GLP-1受体激动剂可以作为肺动脉高压治疗药物，特别是能够有效地抑制异常的细胞增生，减轻肺血管重构。

所述实验如下：

动物实验

经典大鼠肺高压模型证明，与不用药的对照组相比，GLP-1受体激动剂治疗组可明显降低肺高压动物模型的肺动脉压力，并明显降低肺血管阻力和右心肥厚程度；

体外分子生物学实验

大鼠肺组织切片染色表明，与不用药的对照组相比，GLP-1受体激动剂治疗组可明显减轻肺血管肌化程度和炎性细胞浸润程度，提示肺高压典型病理表现肺血管重构减轻；大鼠肺组织碳酸酐酶免疫组化染色，治疗组大鼠肺组织碳酸酐酶水平较不用药对照组相比显著下降，提示组织缺氧程度减轻；

大鼠肺组织蛋白印记检测显示，治疗组较不用药对照组葡萄糖转运体蛋白1(Glut-1)表达下降，pAMPK/AMPK比例明显升高；且表皮生长因子刺激人肺血管平滑肌细胞模拟重构肺血管细胞模型证明，GLP-1受体激动剂可显著抑制人肺血管平滑肌细胞增生、降低细胞葡萄糖摄取以及糖酵解终产物乳酸的产生，提示GLP-1受体激动剂可有效干预细胞代谢，抑制糖酵解。

上述各项实验均证实：GLP-1受体激动剂能够通过对细胞糖代谢方式进行调节。其药理机制是：有效地降低细胞糖酵解水平，抑制肺血管细胞的异常增生，显著减轻肺血管重构，从而降低肺血管阻力和肺动脉压力，能够达到治疗肺动脉高压的目的。

而现有技术中治疗肺动脉高压的药物主要是通过扩张肺血管来降低肺血管阻力和肺动脉压力，对于抑制细胞增殖和血管重构没有明确的作用。而本发明的药物从根本上解决了问题。

本发明所述的GLP-1受体激动剂包括但不限于艾塞那肽(exenatide)、利拉鲁肽(liraglutide)和利西拉来(lixisenatide)，阿必鲁肽(albiglutide)，杜拉鲁肽(dulaglutide)。

通过本发明给予的启示，本领域技术人员可以预见：能够对细胞糖代谢进行调节的GLP-1受体激动剂，都可以达到本发明的目的。

附图说明

图1大鼠健康对照组、肺高压模型未用药组和利拉鲁肽治疗组肺动脉压力测定结果的比较，显示利拉鲁肽治疗组的肺动脉压力明显低于肺高压模型未用药组。

图2大鼠健康对照组、肺高压模型未用药组和利拉鲁肽治疗组肺血管阻力测定结果的比较，显示利拉鲁肽治疗组的肺血管阻力明显低于肺高压模型未用药组。

图3大鼠健康对照组、肺高压模型未用药组和利拉鲁肽治疗组右心肥厚指数测定结果的比较，显示利拉鲁肽治疗组右心肥厚程度明显低于肺高压模型未用药组。

图4大鼠肺高压模型组和利拉鲁肽治疗组分别进行肺组织弹性纤维EVG染色，检测肺血管肌化程度。结果显示：箭头所指为重构的弹性纤维层，利拉鲁肽治疗组肺血管肌化程度较肺高压模型组明显减轻。

图5大鼠肺高压模型组和利拉鲁肽治疗组分别进行肺组织CD68染色，检测炎性细胞浸润程度。结果显示：箭头所指为CD68阳性的细胞，即浸润在肺血管周围的炎性细胞，利拉鲁肽治疗组炎性细胞浸润程度较肺高压模型组明显减轻。

图6 Glut-1、pAMPK/AMPK表达蛋白印记检测，结果显示：利拉鲁肽治疗组较肺高压组大鼠肺组织pAMPK/AMPK比例明显升高，提示AMPK磷酸化程度增高，Glut-1表达显著减少。

图7肺组织碳酸酐酶免疫组化染色，结果显示：箭头所指为碳酸酐酶免疫组化染色阳性的肺血管组织，利拉鲁肽治疗组较肺高压组大鼠肺组织碳酸酐酶水平显著下降。

图8大鼠健康对照组、肺高压模型未用药组和艾塞那肽治疗组肺动脉压力测定结果的比较，显示艾塞那肽治疗组的肺动脉压力明显低于肺高压模型未用药组。

图9大鼠健康对照组、肺高压模型未用药组和艾塞那肽治疗组肺血管阻力测定结果的比较，显示艾塞那肽治疗组的肺血管阻力明显低于肺高压模型未用药组。

图10大鼠健康对照组、肺高压模型未用药组和艾塞那肽治疗组右心肥厚指数测定结果的比较，显示艾塞那肽治疗组右心肥厚程度明显低于肺高压模型未用药组。

具体实施方式

以下实施例所用的药物仅用于举例说明本发明，并不限定本发明所称的GLP-1受体激动剂的范围。

实施例1 GLP-1受体激动剂利拉鲁肽对肺高压动物的治疗作用

1、实验目的

通过建立肺高压动物模型，并利用GLP-1受体激动剂利拉鲁肽进行治疗，通过对大鼠肺动脉血流动力学和右心肥厚指标的检测，观察利拉鲁肽的疗效。

2、实验动物和实验方法

选择体重为220-230g的雄性SD大鼠随机分为三组，分别为健康对照组、肺动脉高压模型未用药组和药物治疗组，每组6只。健康对照组仅皮下注射生理盐水。未用药组和药物治疗组均皮下注射野百合碱(Sigma公司)诱导肺动脉高压形成，野百合碱单次注射，注射剂量为60mg/Kg。药物治疗组于野百合碱注射后7天开始，再连续14天每日腹腔注射利拉鲁肽(Novo Nordisk公司)治疗，剂量为0.4mg/Kg。

野百合碱单次注射后三周，利用右心导管测量各组大鼠的右心和肺动脉血流动力学指标。大鼠经腹腔注射氯胺酮/美托咪唑混合液2mL/Kg麻醉后，将预制导管连接压力测量仪，经右颈外静脉插管，经上腔静脉到达右房、右室、肺动脉，分别记录右心房、右心室、肺动脉压力完毕后，将导管退入至右心室，固定。取左心导管经颈动脉插管，测量体循环动脉压，进入左心室，测量左心压力，记录完毕后撤出左心导管，再经相同路径插入温度测量导管，进行热稀释法心输出量测量。从右心导管注入固定体积冰盐水三次，记录每次注入生理盐水的体积和温度，并记录左心室内温度变化。根据平均肺动脉压、心输出量计算肺血管阻力。

血流动力学指标测量完毕后，撤出导管，解剖大鼠，取材。仔细分离左右心室并称重，并计算右心肥厚指数，右心肥厚指数＝右心质量/左心和室间隔质量之和。

3、实验结果

1)健康对照组大鼠平均肺动脉压力为18.78±3.60mmHg，未用药组和药物治疗组的平均肺动脉压分别为44.90±11.57mmHg和30.86±4.85mmHg，未用药组压力较健康对照组明显升高，而药物治疗组明显低于未用药组，两组间有显著的统计学差异(P<0.001，图1)；

2)健康对照组大鼠肺血管阻力为0.19±0.09mmHg/mL/min，未用药组和药物治疗组的肺血管阻力分别为0.40±0.02mmHg/mL/min和0.31±0.03mmHg/mL/min，未用药组阻力较健康对照组明显升高，药物治疗组明显低于未用药组，两组间同样有显著的统计学差异(P<0.05，图2)。

3)健康对照组、未用药组和药物治疗组的体循环动脉压分别为113.56±26.38mmHg、103.24±3.93mmHg和109.16±9.15mmHg，心输出量分别为94.47±19.53mL/min、89.85±4.48mL/min和91.54±10.77mL/min，三组间均无明显的统计学差异(均为P>0.05)。

4)此外，健康对照组、未用药组和药物治疗组的右心肥厚指数分别为0.26±0.01、0.44±0.10和0.34±0.04，未用药组右心明显肥厚，而药物治疗组右心肥厚程度明显低于未用药组，有显著的统计学差异(P<0.01，图3)。

4、实验结论

对比未用药的肺高压模型组，利拉鲁肽能够明显降低平均肺动脉压和肺血管阻力，而体循环动脉压、心输出量未受到影响。且能够明显减轻右心肥厚程度。

表1 各实验组血流动力学指标和右心肥厚指标的比较

实施例2 GLP-1受体激动剂艾塞那肽对肺高压动物的治疗作用

1、实验目的

通过建立肺高压动物模型，并利用GLP-1受体激动剂艾塞那肽进行治疗，通过对大鼠肺动脉血流动力学和右心肥厚指标的检测，观察艾塞那肽的疗效。

2、实验动物和实验方法

选择体重为220-230g的雄性SD大鼠随机分为三组，分别为健康对照组、肺动脉高压模型未用药组和药物治疗组，每组6只。健康对照组仅皮下注射生理盐水。未用药组和药物治疗组均皮下注射野百合碱(Sigma公司)诱导肺动脉高压形成，野百合碱单次注射，注射剂量为60mg/Kg。药物治疗组于野百合碱注射后7天开始，再连续14天每日腹腔注射艾塞那肽(AstraZeneca公司)治疗，剂量为10μg/Kg。

野百合碱单次注射后三周，利用右心导管测量各组大鼠的右心和肺动脉血流动力学指标。大鼠经腹腔注射氯胺酮/美托咪唑混合液2mL/Kg麻醉后，将预制导管连接压力测量仪，经右颈外静脉插管，经上腔静脉到达右房、右室、肺动脉，分别记录右心房、右心室、肺动脉压力完毕后，将导管退入至右心室，固定。取左心导管经颈动脉插管，测量体循环动脉压，进入左心室，测量左心压力，记录完毕后撤出左心导管，再经相同路径插入温度测量导管，进行热稀释法心输出量测量。从右心导管注入固定体积冰盐水三次，记录每次注入生理盐水的体积和温度，并记录左心室内温度变化。根据平均肺动脉压、心输出量计算肺血管阻力。

血流动力学指标测量完毕后，撤出导管，解剖大鼠，取材。仔细分离左右心室并称重，并计算右心肥厚指数，右心肥厚指数＝右心质量/左心和室间隔质量之和。

3、实验结果

1)健康对照组大鼠平均肺动脉压力为14.83±3.27mmHg，未用药组和药物治疗组的平均肺动脉压分别为36.37±5.61mmHg和30.11±2.17mmHg，未用药组压力较健康对照组明显升高，而药物治疗组明显低于未用药组，两组间有显著的统计学差异(P<0.01，图8)；

2)健康对照组大鼠肺血管阻力为0.16±0.03mmHg/mL/min，未用药组和药物治疗组的肺血管阻力分别为0.39±0.05mmHg/mL/min和0.31±0.01mmHg/mL/min，未用药组阻力较健康对照组明显升高，药物治疗组明显低于未用药组，两组间同样有显著的统计学差异(P<0.001，图9)。

3)健康对照组、未用药组和药物治疗组的体循环动脉压分别为102.33±9.02mmHg、98.31±10.76mmHg和98.60±9.91mmHg，心输出量分别为95.20±4.56mL/min、92.20±7.49mL/min和96.08±8.12mL/min，三组间均无明显的统计学差异(均为P>0.05)。

4)此外，健康对照组、未用药组和药物治疗组的右心肥厚指数分别为0.27±0.03、0.43±0.07和0.33±0.04，未用药组右心明显肥厚，而药物治疗组右心肥厚程度明显低于未用药组，有显著的统计学差异(P<0.01，图10)。

4、实验结论

对比未用药的肺高压模型组，艾塞那肽能够明显降低平均肺动脉压和肺血管阻力，而体循环动脉压、心输出量未受到影响。且能够明显减轻右心肥厚程度。

表2 各实验组血流动力学指标和右心肥厚指标的比较

实施例3 GLP-1受体激动剂对肺血管重构的影响

1、实验目的

体外组织检测评价利拉鲁肽治疗对肺血管重构的影响。

2、实验方法

上述各组大鼠处死后，取出新鲜肺组织浸泡在10％福尔马林溶液中过夜，然后换70％乙醇保存，石蜡包埋切片，进行弹性纤维EVG染色测量肺血管肌化程度和CD68染色测量炎性细胞浸润程度。

3、实验结果

肺高压模型未用药组和药物治疗组的肺血管肌化程度分别为66.96±6.28％和49.78±4.83％，利拉鲁肽治疗后肺血管肌化程度明显减低，两组有显著的统计学差异(P<0.001，图4)；未用药组和药物治疗组的CD68阳性细胞数分别为20.01±2.51个/mm²和9.28±5.93个/mm²，利拉鲁肽治疗后，炎性细胞浸润明显减轻，有显著的统计学差异(P<0.05，图5)。

4、实验结论

对比肺高压模型组，利拉鲁肽治疗后肺血管肌化和炎性细胞浸润等肺血管重构病理变化明显减轻。

实施例4 GLP-1受体激动剂对细胞增生的影响

1、实验目的

通过进行体外细胞增殖实验(BrdU染色)评价利拉鲁肽对肺血管平滑肌细胞增生的影响。

2、实验方法

平底透明96孔板培养人肺血管平滑肌细胞(第三至五代)(LONZA公司)，细胞密度约5000个/mL，每孔体积100μl，普通10％牛血清培养液，37摄氏度、5％CO₂培养过夜。第二日，移除陈旧培养液，换成0.05％牛血清细胞培养液培养24小时，使其生长速率均一化。

24小时后，用含10％牛血清无生长因子的培养液配制浓度为50ng/ml的表皮生长因子(PDGF)溶液、PDGF(50ng/ml)+利拉鲁肽(20μM)溶液和PDGF(50ng/ml)+利拉鲁肽(50μM)溶液分别作为培养液，将人肺血管平滑肌细胞分成对照组、PDGF组和利拉鲁肽治疗组(PDGF+利拉鲁肽)，每组n＝6，37摄氏度、5％CO₂培养。48小时后向各组加入BrdU继续培养24小时至实验终点72小时。移除培养液，加入细胞固定液固定细胞30分钟后，移除固定液加入抗体室温孵育1小时，洗一次，加入二抗室温孵育30分钟后洗两次，加入100μl反应底物，暗室室温孵育30分钟后加入反应终止溶液100μl，使用多功能微孔板检测仪(Promega公司)，450nm吸收峰读数。

3、实验结果

PDGF组细胞增生速率为对照组细胞1.5倍，而20μM和50μM利拉鲁肽治疗组细胞增生速率仅分别是对照组细胞1.27倍和1.26倍，利拉鲁肽治疗组较PDGF组细胞增生速率显著下降，其差异均有显著的统计学意义(P<0.05)。

另外，为了研究利拉鲁肽治疗在正常条件下对健康细胞增生有无影响，在相同细胞条件下，无PDGF刺激，进行细胞增生BrdU染色，20μM和50μM利拉鲁肽治疗72小时，和对照组细胞相比，细胞增生速率差异无显著统计学意义(P>0.05)。

4、实验结论

利拉鲁肽能够显著降低PDGF诱导的肺血管平滑肌细胞增生，而对正常条件下的健康细胞无明显的影响。

实施例5 GLP-1受体激动剂对体外细胞葡萄糖摄取的作用

1、实验目的

通过荧光标记2-N-[7-硝基苯-2-乙二酸-3,4-二羟氨基]-2-脱氧葡萄糖(2-NBDG)摄取实验测定GLP-1受体激动剂对肺血管平滑肌细胞葡萄糖摄取的影响

2、实验方法

平底黑色96孔板培养人肺血管平滑肌细胞(第三至五代)(LONZA公司)，细胞密度约5000个/mL，每孔100μl，普通10％牛血清培养液，37摄氏度，5％CO₂培养过夜。移除陈旧培养液，用含10％牛血清无生长因子的培养液配置PDGF(50ng/ml)和PDGF(50ng/ml)+利拉鲁肽(50μM)溶液分别作为培养液，

将细胞分成对照组、表皮生长因子(PDGF)组及治疗组(PDGF+利拉鲁肽)，每组n＝6，37摄氏度、5％CO₂培养。72小时实验终点前3小时，向各组加入100μl 2-NBDG(CaymanChemical公司)，最终浓度100μg/ml，孵育3小时后离心96孔板(400xg，室温5分钟)，小心吸去上清，磷酸盐缓冲液洗三次后，加入100μl分析缓冲液，使用多功能微孔板检测仪(Promega公司)，激发波长485nm，发射波长535nm，荧光读数获取荧光强度。用细胞质量校正结果。

3、实验结果

对照组、PDGF组、利拉鲁肽治疗组人肺血管平滑肌细胞葡萄糖摄取水平校正荧光强度分别为3225.86±787.93、6190.32±980.76和3868.20±1434.26。72小时PDGF刺激诱导肺血管平滑肌细胞葡萄糖摄取增加，而利拉鲁肽显著减少了人肺血管平滑肌细胞葡萄糖摄取(P<0.05)

4、实验结论

人肺血管平滑肌细胞葡萄糖摄取经治疗后显著减低，表示利拉鲁肽可调节细胞葡萄糖代谢，进而有可能抑制肺血管增生、改善肺血管重构。

实施例6GLP-1受体激动剂对细胞糖酵解水平的作用

1、实验目的

通过测量细胞外环境乳酸水平，检测对细胞糖酵解水平的影响。

说明：乳酸为细胞糖酵解过程终产物，并被释放至细胞外环境，被分泌至细胞外环境的乳酸水平与细胞糖酵解水平呈正相关，因此，采用对利拉鲁肽治疗后的人肺血管平滑肌细胞外环境乳酸水平的检测，可以研究利拉鲁肽对细胞糖酵解过程以及肺血管重构的影响。

2、实验方法

平底透明96孔板培养人肺血管平滑肌细胞(第三至五代)(LONZA公司)，细胞密度约5000个/mL，每孔100μl，普通10％牛血清培养液，37摄氏度、5％CO₂培养过夜。移除陈旧培养液，用含10％牛血清无生长因子的培养液配置PDGF(50ng/ml)，PDGF(50ng/ml)+利拉鲁肽(50μM)溶液分别作为培养液，细胞分成对照组、表皮生长因子(PDGF)组及治疗组(PDGF+利拉鲁肽)，每组n＝6，37摄氏度、5％CO₂培养72小时。实验终点离心96孔板(1000rpm，室温5分钟)，每孔分别取5μl上清测量各组细胞乳酸水平。依照厂家提供试剂及实验方法步骤，另取一空96孔板，分别放入不同浓度梯度的乳酸标准样品(Cayman Chemical公司)及相对应组别每孔5μl细胞上清液，向所有各孔加入100μl反应液后，将96孔板置于摇床室温缓慢反应30分钟。反应30分钟结束后，使用多功能微孔板检测仪(Promega公司)，490nm吸收峰读数。根据乳酸脱氢酶催化氧化乳酸反应生成丙酮酸过程中形成NADH还原底物，利用乳酸标准样品，测量吸收峰490nm强度计算相应乳酸水平。

3、实验结果

经利拉鲁肽治疗后的人肺血管平滑肌细胞外环境的乳酸水平为2.47±0.32mM，较PDGF刺激增生的人肺血管平滑肌细胞外乳酸水平(3.12±0.54mM)显著降低(P<0.05)。

4、实验结论

利拉鲁肽降低人肺血管平滑肌细胞糖酵解水平，表示利拉鲁肽可调节肺血管的糖代谢失衡，促进葡萄糖代谢效率，进而改善肺血管重构。

实施例7 GLP-1受体激动剂分子生物学实验检测

1、实验目的和方法

为验证上述利拉鲁肽对肺动脉高压的疗效，以及对细胞增生以及葡萄糖代谢的影响是否与AMPK通路激活并影响下游缺氧诱导因子及葡萄糖转运体有关，分别应用蛋白质印记和免疫组织化学染色实验检测AMPK磷酸化水平、缺氧诱导因子直接相关的细胞缺氧标记物碳酸酐酶和葡萄糖转运体蛋白1(以下亦简称Glut-1)。

(1)Glut-1、pAMPK/AMPK表达蛋白印记检测

新鲜肺组织取出后立即放入液氮保存，利用磷酸盐裂解液(含100mM磷酸根，其中磷酸氢二钾：磷酸二氢钾＝3：1，1mM EDTA，1mM二硫苏糖醇，蛋白酶抑制剂)，电动低温匀浆，12000xg，4摄氏度离心20分钟后保留上清液，并进行蛋白定量后，可根据蛋白印记基本实验步骤进行目的蛋白表达检测。其中，一抗磷酸化AMPK及AMPK抗体(Cell Signalling公司)稀释浓度为1:1000，一抗葡萄糖转运体蛋白1抗体(Abcam公司)稀释浓度为1:1000，一抗均于4摄氏度孵育过夜；二抗为辣根过氧化氢酶标记抗兔抗体(sigma公司)，稀释浓度为1:2000，室温孵育1小时。抗体孵育结束漂洗后，利用辣根过氧化氢酶化学发光法，采用高灵敏度化学发光成像仪显影(Chemidoc，Bio-Rad公司)，经过Image J软件分析图像获得数据。

(2)碳酸酐酶免疫组化染色(CA9)

取出各组大鼠新鲜肺组织，浸泡在10％福尔马林溶液中过夜，然后换70％乙醇保存，石蜡包埋切片，根据免疫组织化学染色基本方法进行碳酸酐酶肺组织切片染色。碳酸酐酶一抗(Novus公司)稀释浓度为1:100，4摄氏度孵育过夜；二抗为辣根过氧化氢酶标记抗兔抗体(Sigma公司)，稀释浓度为1:200，室温孵育1小时。抗体孵育结束后，经辣根过氧化氢酶-二氨基联苯胺显色，苏木精伊红染色后，酒精二甲苯脱水固定后封片。

2、实验结果和结论

蛋白印记实验结果发现：利拉鲁肽治疗组较肺高压组大鼠肺组织Glut-1表达有显著减少，pAMPK/AMPK比例明显升高，提示AMPK磷酸化程度增高，AMPK通路被激活，且下游葡萄糖转运蛋白表达下降。

免疫组化实验结果发现：碳酸酐酶在利拉鲁肽治疗组有显著下降，提示利拉鲁肽治疗后，AMPK通路下游缺氧诱导因子下调，组织缺氧程度减轻(图6，图7)。

以上实验结论表明，利拉鲁肽能够激活机体能量代谢核心通路AMPK，平衡肺血管葡萄糖代谢，减轻细胞组织缺氧，从而改善肺高压肺血管重构病变，治疗肺动脉高压。

Claims (10)

1.胰高血糖素样肽-1受体激动剂在制备治疗肺动脉高压药物中的应用。

2.权利要求1所述的应用，所述治疗肺动脉高压，是减轻肺血管重构。

3.权利要求1所述的应用，所述治疗肺动脉高压，是抑制异常的细胞增生。

4.权利要求3所述的应用，所述抑制异常的细胞增生是抑制肺血管平滑肌细胞增生。

5.权利要求1所述的应用，所述治疗肺动脉高压，是降低细胞糖酵解水平。

6.权利要求1所述的应用，所述胰高血糖素样肽-1受体激动剂，是具有对肺动脉细胞糖代谢进行调节功能的胰高血糖素样肽-1受体激动剂。

7.权利要求6所述的应用，所述胰高血糖素样肽-1受体激动剂选自艾塞那肽(exenatide)、利拉鲁肽(liraglutide)、利西拉来(lixisenatide)，阿必鲁肽(albiglutide)，或杜拉鲁肽(dulaglutide)。

8.一种治疗肺动脉高压的药物，其特征是，其活性成分是胰高血糖素样肽-1受体激动剂。

9.权利要求8所述的药物，所述治疗肺动脉高压，是抑制肺血管平滑肌细胞增生并减轻肺血管重构。

10.权利要求8所述的药物，所述胰高血糖素样肽-1受体激动剂选自艾塞那肽(exenatide)、利拉鲁肽(liraglutide)、利西拉来(lixisenatide)，阿必鲁肽(albiglutide)，或杜拉鲁肽(dulaglutide)。