CN111164485A - 用于光学检查多个显微样品的方法和装置 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于光学检查多个显微的样品(1)的方法，其中，所述样品(1)从多个样品中以通道传输并相继借助在至少一个通流通道(3)中的流体导引，所述样品在所述通流通道中沿流动方向(23)前进。所述样品(1)被照明，由样品(1)发出的光被探测和分析。本发明还涉及一种用于执行所述方法的设备。按照本发明对所述样品(1)照明，方式是带有光片平面(22)的至少一个光片(19)对准所述至少一个通流通道(3)，其中所述光片(19)如此定向，使得光片在相交区域(20)中与至少一个通流通道(3)相交，并且所述光片平面(22)的法向(21)与流动方向(23)在所述相交区域(20)中围成不同于零的角。由所述样本(1)发射的光由成像的探测光学器件(10)记录，所述探测光学器件(10)的焦面位于所述相交区域(20)中。

Description

用于光学检查多个显微样品的方法和装置

技术领域

本发明涉及一种用于光学检查，尤其用于操作，用于成像和用于分析多个显微(或微观)的、尤其生物的样品的方法，其中，所述样品从多个样品中通道传输并相继借助在至少一个通流通道中的流体导引，并且样品在通流通道中沿预先规定的流动方向前进。样品在通流通道中被照亮并且探测和分析从样品发射(或者说反射)的光。

本发明还涉及一种用于光学检查多个显微样品的设备，所述设备尤其适于执行前述方法。这样的设备包括用于通道传输样品和用于把样本相继输送到至少一个通流通道的通道传输装置，样本在该通流通道中沿着例如通过泵送和排放设备预先规定的流动方向前进。该设备还包括照明器件，其用于照明在通流通道中的样品以发射探测光；该设备还包括用于探测由样品发射的探测光的探测器件和用于分析所述探测光的分析器件。

背景技术

在过去的五十年中，流式细胞分析已成为检查大量细胞群体以获取有关细胞类型和数量的定量信息的重要的测量方法之一。在此，细胞以比较大的速度基本上单个地导引经过用于照明的光束或者用于样品操作的器件、例如电压。取决于细胞的特性，例如细胞的结构，形状或例如用荧光标记物的染色，操作导致不同的结果，该结果被探测到并允许得出关于细胞特性的结论。在此，术语“操作”除了理解为机械或例如借助光镊的准机械介入外，还应理解为由于外部介入导致的样品特性变化。如果例如用荧光标记物标记样品并通过光束激发以发出荧光，则光束也可以操作样品。在此，在传统的流式细胞分析中只探测信号，但是不能收集二维或三维图像信息，这对于更精确的分析和/或更进一步的多样化分类是期望的。

在流式细胞分析中，借助通道传输装置从样品总量中分离出样品并且通常借助所谓鞘流在微通道中转向，样品总量通常在载液中包含多个显微样品，其以下理解为单独的对象，例如细胞。例如分离可以借助必要时在直径方面可调节的漏斗形的通向微通道的开口进行。目前通常在微流体芯片上设计的微通道通常具有直径，该直径选择得如此大，以至于典型尺寸、介于1μm至30μm之间的细胞不会被卡在其中，并且另一方面如此小，以至于所有通过微通道的细胞若在与激光束的相交线上的通道中没有流体技术上的聚焦，也会被操作介质、例如激光束检测。若激光束的频率与标记物相匹配，则用该荧光标记物标记的样品在通过该激光束时会被激发以发出荧光信号，该荧光信号由定向到在激光束和通流通道之间的相交区域的探测器记录。在此，通常简单的光电探测器就足够了，因为对于定量分析来说利用成像的光具组进行成像是不需要的。对于未用荧光标记物标记的样品或者相对于荧光额外地，可记录所述样品沿不同方向的散射光。

在分析单元中评估探测到的测量值，并获得有关每个被分析细胞的定量的信息。每秒可分析的样本数量在10⁴的数量级内，因此可以在最短的时间内获得关于各单个样本的代表性信息，例如在多个样本中出现的细胞群体。在此，可以将分别发射不同波长的光的多个激光器定位在通流通道处并且可以将其与相应的探测器耦连，从而允许分析多个不同的样本。除分析荧光信号外，还可以选择分析散射光。

借助分选装置的分选与流式细胞分析测量相连接。根据分析结果将样品分选到不同的通道中。若这在分析之前还没有进行，则例如借助沿通流方向布置在照明器件后方的振动器分离样品并且接着进行静电分选，在激发荧光的情况下，所述照明器件也称为激发器件，所述振动器将液体流分成通常仅包含一个细胞的小液滴。关于包括分选机制在内的流式细胞分析方法的概述例如在C.W.Shields IV等人的文章“Microfluidic CellSorting:A Review of the Advances in the Separation of Cells from Debulking toRare Cell Isolation”中，发表于Lab Chip.15(5)，1230-1249页，2015年。

尽管使用这些方法可以实现高样品通过量，但由于不能在该速度中进行聚焦，所以通常不进行成像。一种解决方案是使用具有固定焦距和小孔径的光具组，这导致景深增加，而也导致更暗的图像。通过专门的图像处理至少部分地又弥补了该缺点。然而这种所谓“扩展景深技术”“Extended-Depth-of-Field”(EDOF)增大了技术耗费并且以此增大了成本，此外由于孔径很小所以在图像中可实现的分辨率也很小。具有组合成像的流式细胞仪例如是Merck KGaA公司的ImageStreamX Mark II Imaging Flow Zytometer。

现代的流式细胞分析仪通常使用“芯片实验室”“lab on chip”方法，在此是微流体系统，其中使用专门的样本载体，该样本载体配设有微结构化的通道，其具有入流和出流。按照应用可以不同地设计微结构化的通道。例如为了产生反应，多个微结构化的通道可以交叉，针对简单的流式细胞分析，简单的通道就足够了。具有微结构化通道的样品载体(也称为通道载体)可以布置在倒置显微镜的相应样品架或样品台上，以便也可以借助倒置显微镜观察通道，例如在F.-U.Gast等人的文章“The microscopy cell(MicCell),aversatile modular flowthrough System for cell biology,biomaterial research,and nanotechnology”Microfluid Nanofluid 2,21-36页2006年中所述。该观察大多是共焦地进行的，因此仅限于小范围。

此外，现有技术中在此期间已经建立了用于生物样品检查的光片显微方法和设备。在此，用光片进行样品的照明，即基本上仅在一个平面中，即光片平面。所述光片与探测方向围成不同于零的、大多直角的角度，所述探测方向通常与探测物镜的光轴一致。利用这种也称为平面光显微镜(SPIMSelective Plane Illumination Microscopy)的技术，可以以比较短的时间产生甚至较厚的样品的空间的记录。基于光学截面结合样品在垂直于截面平面的方向上的相对运动，可以利用光片显微方法实现样品的图像式的，空间上扩展的呈现。

SPIM技术优选用在荧光显微镜中，在此其也被称为光片荧光显微镜(LSFM，LightSheet Fluorescence Microscopy)。相比其他已建立的方法、例如共焦激光扫描显微或双光子显微镜，LSFM技术具有许多优势。由于可以在广角中进行探测，因此可以更快地检测更大的样本区域。尽管分辨率比共焦激光扫描显微略低，但由于穿透深度较大，对于静态样品可以使用LSFM技术分析较厚的样品。此外，在该方法中样品的光负载最低，这降低了褪色的风险并且主要降低了样品的光损伤，因为样品仅由薄的光片以相对于探测方向非零的角度照射。

所述光片既静态地产生，例如借助于柱面透镜，也可以准静态地产生，方式是借助于一个光束在一平面内快速扫描样品。光片式照明被产生，方式是光束承受相对于被观察的样品的非常快速的相对运动，并且在此在时间上先后相继多次相互排成行。用于形成光片由各种方法，可以使用所谓Sinc³光片，基于Mathieu射线或者Bessel射线产生的光片，或者甚至借助格栅产生的光片，例如在文献中US 2013/286181A1中所述。

在使用准静态光片时，这样选择所连接的照相机的积分时间(在该照相机的传感器上最终对样本成像)，以便在积分时间内结束扫描。代替具有二维传感器的照相机，还可以在探测光学器件中使用行式传感器结合重新扫描。现在在文献中反复描述了SPIM技术，例如在DE 102 57 423A1和以此为基础的WO 102/053558A1中，或在J.Huisken等的综述文章“Selective Plane Illumination Microscopy Techniques in DevelopmentalBiology”中，2009年，杂志Development Bd136，,1963页及其后。在文献WO 2012/1 10488A2和WO 2012/122027A2中说明了一种结构，其中，照明物镜和探测物镜彼此垂直，并且分别以45°的角度从上方指向样品。样品例如位于培养皿中。在现有技术中也已知倒置光片显微的装置，例如文献DE 10 2013 107 297A1、DE 10 2013 107 298A1、DE 10 2013 112 596A1或DE 10 2013 112 600A1。由于在具有倒置布局的光片显微镜中，光倾斜地穿过样品载体，因此需要使用校正元件，以便借助校正元件补偿由倾斜光穿过引起的像差，如上述文献中所述。

发明内容

本发明要解决的技术问题是改进开头所述类型的方法和设备，使得一方面与现有技术中已知的流式细胞分析方法和设备相比，灵敏度和灵活性更高，并且另一方面同时提供尽可能详细的图像信息。

对于开头所述类型的方法，上述技术问题以此解决，对样品照明，方式是带有光片平面的至少一个光片对准至少一个通流通道，并且所述光片如此定向，使得光片在相交区域中与至少一个通流通道相交，并且光片平面的法向与流动方向在相交区域中围成不同于零的角。由样本发射的光由成像的(即图像式的和平面地探测的)探测光学器件记录或者说检测，所述探测光学器件的焦面位于相交区域中。

所述发射的光例如指的是散射光或者反射的光，在此情况中样品被动地发射光，而并没有为此被激发。特别优选的是该方法也可以用于这些样品，它们在检查前用荧光标记物标记，这使得例如细胞的识别更容易。这些样品通过所述至少一个光片激发以便发出荧光信号，该荧光信号被探测光学器件记录。在此情况中，样品主动发射光。

因此，在此不是借助简单的激光束进行对带有荧光标记物的样品的照射或者激发，而是借助同样由激光产生的光片进行，所述光片定向为，该光片在相交区域中与至少一个通流通道相交。在此，术语“相交区域”应理解为：在沿光片平面的法向的方向具有无限小厚度的理想光片中，相交区域是在光片平面中的二维的相交面，该相交面由通流通道的体积对光片的相交产生，所述相交面通过通道边缘限界。然而在现实中，光片沿光片平面的法向具有有限的维度，光片厚度的上限在5μm至30μm之间，该维度尽管相较于在光片平面中的维度明显更小，但是实现的是，相交区域是相交体积，其沿光片平面的法向的厚度在聚焦最好的区域中是约0.4μm-3μm，包括该数值。在相应聚焦时，使用光片的重要优点是其平面式的维度，当例如使用带有多个平行地布置的通流通道的通道载体时，这实现了甚至多个通道也能被同时分析，

原则上，如果仅需要定量分析，则光片为了照明和尤其为了产生荧光信号也可以相对于流动方向垂直定向，荧光信号就可以以通常的方式例如借助光电探测器，即非成像探测光学器件探测和分析，其中相对于使用单个激光束有利的是多个通流通道能同时被分析。从而SPIM装置仅承担光片，而取消成像的、即产生图像的探测光学器件。

然而本发明的特别有利的方面在于光片的倾斜的定向，意味着光片平面的法向与流动方向围成不为零的角度。在此，在通常基本上管形的通流通道中流动方向沿通道的纵向维度定向，即垂直于其横截面并且此外根据通流通道沿哪个方向通流。流动方向和尤其流动速度的值可以从外部例如用相应的泵设备口控制。

通过不为零的角度实现的是，探测光学器件如其在光片显微中通常使用的那样装入和如此定位，使得焦面(或者说焦平面)位于相交区域中，理想的是直接在光片平面中或者至少与其平行，使得通流通道在相交区域中的整个倾斜的横截面位于焦面中。因为检测通流通道的整个横截面，所以可以使用更大的通道，就是说通道尺寸可以与样品尺寸无关地选择。以这种方式可以以瞬间拍摄记录对于光片显微典型的、样品在相交区域中的相交图像，就是说通过相交区域的样品的二维的图像。除了覆盖通流通道的较大的或者甚至整个倾斜的横截面，光片相对于流动方向倾斜的定向在微流体中有利地允许使用具有较大数值孔径和较小工作间距的物镜。所述探测物镜不仅能用于产生图像，而且能用于针对定量分析来记录荧光信号，如其在流式细胞分析实验中进行的那样，不需要额外的探测装置。因此成像的探测物镜不仅记录荧光信号，而且也同时把穿过焦面中的相交区域的样品至少以瞬间拍摄方式成像到相应的面式传感器上，使得可以在穿过相交区域时产生样品的至少一个二维的记录。

由于光片相对于流动方向倾斜的定向，甚至针对瞬间拍摄得到穿过整个样品的截面图像。然而结合流动速度和流动方向可以在时间上连续地记录由流过相交区域的样品的单个图像构成的图像栈，图像栈的单个图像可以可选地组成空间上的视图。

此外，探测光学器件无需其他措施总是聚焦在光片平面或相交区域中的平面上，因此可以省去额外的措施，例如用于增加景深(EDOF)的措施。在使用激光束进行流式细胞分析时，通常激光束仅覆盖通流通道的部分区域，并且必须借助相应的流聚焦将粒子聚焦在该部分区域上，与此相对地，光片通常在横截面或相交区域中覆盖整个通流通道，或者至少大部分，使得在此可以省去粒子聚焦。原则上，由于成像，因此也可以在具有较大的横截面的通流通道中操作和分析多个样本、尤其细胞，这些样本在瞬间拍摄中同时位于相交区域中。与传统的流式细胞分析相反，激发性的激光束不必为了生成最大信号而聚焦，这在那里使得粒子聚焦是必须的，因为通流通道的直径不能减小到聚焦的激光束的直径。

在现有技术中流式细胞分析中的成像只能通过扩展景深方法(EDOF方法)实现，这使得需要使用小孔径用于成像，而在使用光片显微装置用于照明和探测时可以省去这些措施：探测物镜聚焦到光片平面上，景深对应于沿光片平面法线方向的相交区域厚度并且基本上小于样本的维度。因此可行的是，在探测光学器件中使用具有大孔径角(或视角)的物镜，这实现了高分辨能力，分辨能力基本上随着物镜的孔径角而增大。通过使用浸没介质，可以进一步增加物镜的数值孔径，并可以进一步提高分辨率。

所述方法甚至可以与遮盖的或离轴照明(倾斜照明)方法结合以增加对比度。在此，离轴照明例如以另外的颜色耦合到照明物镜中，替选地也可以使用分开的物镜。以此方式可以建立样品的对比记录，为此使用光谱上分离的通道用于照明和探测。图像数据可以合并成样品的具有更高对比度的总体图像。

在根据这些信号分析荧光信号之后，可以使用在现有技术中已知的措施对样品进行分选。

因为相较于通流通道用于微流体的直径，光片可以覆盖明显更大的区域，所以可以直接定向光片，使得光片与多个通流通道相交。以此可以明显提高通过量，提高用于流式细胞测量和成像分析方法的效率。

此外，还可以用多个光片照明样品，其中，多个光片平面优选彼此平行。在此，例如可以沿流动方向先后相继地布置多个同样的光片，这实现重复观察同一对象，即从样品总量中分离出的样品。也可以使用具有不同光谱特性的多个光片，用于例如观察多色激发。这些光片也可以彼此叠加，多色激发就同时进行。在将同样的或者不同的光片先后相继布置时，也可以以时间进程观察光学的操作。例如第一光片进行操作，该操作在样品中导致反应。第二光片用于观察第一特性，必要时可以使用另外的光片用于观察另外的特性，它们甚至也可以叠加。通过例如经由阀门设置流动速度，可以设置样品用于在第一和第二光片之间的位移所需的时间。

根据待检查的特性，第二光片或者必要时的另外的光片可以相互叠加或者沿流动方向彼此分隔地布置。在第一和第二光片之间有空间距离。此外在相应设计至少一个通流通道时可以实现，光片在相交区域中多次与至少一个通流通道相交，以此可以检查样品的时间上的特性。这例如可以通过曲折状通流通道实现，甚至通流通道弧形的布置也是可以想到的。

此外，在使用多个通流通道时，可以给所有平行的通道或者通道组配设个性化的光谱特性，方式是使用专门的过滤装置或者过程发射过滤器。

此外，上述技术问题针对开始所述类型的设备以此解决，即照明器件包括用于产生至少一个带有光平面的光片的照明光学器件，其中，所述光片相对于通流通道如此定向，使得光片在相交区域中与通流通道相交并且光片平面的法线与流动方向在相交区域中围成不为零的角度，以此在相交平面中照明样品。探测装置包括成像的探测光学器件，所述探测光学器件的焦面位于相交区域中。

基于设备特征的描述在这些特征方面类似地适用于相应方法，而方法特征相应地表示所描述的设备的功能特征。

适宜的是，照明器件设计为发射专门的波长或者波长范围的光用于激发用荧光标记物标记的样品，该样品然后发射荧光信号。该荧光信号然后由成像的探测光学器件平面地探测。但是该探测器件也可以包括另外的探测器，例如纯光电探测器，若重点是定量的分析，就利用它们探测荧光信号和/或散射光。

有利的是，在按照本发明的设备中，至少一个通流通道设计在可更换通道载体上，例如微流体芯片上。这实现了对不同样品和分析方法的针对性调整。例如，在通道载体上可以布置多个平行的通流通道，它们与光片相交，即所有通流通道都具有与光片的相交区域。这由于平行化而实现了更大的样品通过量并且能尤其在应分析多个样品并且重点不是成像地呈现时使用，而这可以同样直接与面式探测器集成：使用探测光学器件和与其连接的摄像机，可以在摄像机的面面式探测器上分别把探测器上确定的区域明确分配确定的通道，使得所有通流通道都能被分开评估。若只是定量分析，则在通道载体上的全部通流通道可以具有共同的输入线路和共同的排出线路。然而同样可行的是，根据待进行的分析，针对所有通道配设自己的输入线路和/或输出线路，或者将通道成组地合并。

在至少一个通流通道中可以沿流动方向在光片后方布置分选单元，利用所述分选单元根据分析的结果将样品导引至与通流通道邻接的多个分支通道之一上。可以使用现有技术中已知的方法进行所述分选，例如以光学、声学或电泳方式。

为了观察标记或操作的样品的时间上的表现，需要多次观察样品。因此在本发明的优选设计方案中，照明器件包括一个照明光学器件或多个照明光学器件，其用于产生多个光片。多个光片以其光片平面彼此平行。按照实验种类，照明光学器件产生分别彼此不同颜色的光片，或者相同颜色的光片。多种颜色的光片甚至可以为了在至少一个通流通道中产生多重激发而叠合地设计。在其他情况下，在第一光片与至少一个通流通道的相交区域中进行操作，例如产生反应或者激发荧光，其用第二光片观察。在特别优选的设计方案中，多个光片由相同的照明光学器件产生。针对两个光片，这例如可以借助被控制的扫描器进行，该扫描器在两个平行布置的光片平面之间切换。在此，扫描器通过控制器与切换设备耦连，该切换设备确保在切换过程期间将光片关闭。

替代地或附加地可行的是，如此设计在通道载体上的通流通道，使得通流通道与光片形成多个相交区域，这例如可以通过之字形地设计至少一个通流通道进行。若光片的光谱范围对于激发和探测是同样适合的，在此情况中为了观察反应的时间顺序只需要一个光片，在其他情况下叠加不同颜色的多个光片。

在其他的设计方案中，通流通道设计为沿流动方向其直径是变化的，这实现了样品在变形意义上的机械操作。然后例如在变形之前观察一次样品和在变形状态期间观察一次样品，为此若流动方向不变则使用两个光片，或者若至少一个通流通道设计为流动方向相对于上级坐标系统改变，则使用单个光片，如其在曲折状设计通流通道的情况中那样。

有利的是甚至可以借助速度调节装置可变地设置在至少一个通流通道中流动速度的值，并且适配于实验条件。速度例如可以通过在输入线路和/或排出线路上的阀门调节。

此外，若从对象内部在不同位置的至少三个图像生成图像栈，则可以借助所谓的相位恢复算法，例如强度传播方程(TIE)确定相对于探测到的光的相位信息。由于样品、对象随流动通过探测光学器件的焦面，仅需以合适的时间间隔记录至少3个图像，这与常规显微不同，常规显微中样品或物镜必须沿光轴移动。此外，所述设备可以与另外的探测设备和摄像机组合，例如法向的反射光显微镜或其他光片显微镜装置。

当然，上述特征和下文还会阐述的特征不仅能以所记载的组合应用，而且能以其他组合或者单独应用，而不脱离本发明范围。

附图说明

下面例如根据公开了本发明基本特征的附图进一步阐述本发明。其中：

图1示出用于光学处理多个样本的设备的示意性结构，

图2示出通道载体和光片位置的细节，

图3示出这种设备的第二设计方式，

图4示出这种设备的第三设计方式，

图5示出通道载体的设计，

图6示出通道载体的第二设计方式，

图7示出通道载体的第三设计方式，

图8a、b示出通道载体的两个另外的设计方案。

具体实施方式

图1首先示出用于光学操作多个生物的、用荧光标记物标记的样品1的设备的基本构造。首先制备例如源自组织样品的多个不同细胞的通常以样品总量存在于载液中的样品1，即用荧光标记物标记，然后输送到通道传输装置2中，其中样品1被通道传输并被输送到至少一个通流通道3。通道传输装置2也被称为分离装置，它可以例如向通流通道3的方向上具有漏斗形的开口，开口的尺寸使样品只能单个地通过。这可以利用流体技术的措施来辅助，其中，有利的是开口的直径甚至也可以改变。典型的样品是通常具有1μm至30μm尺寸的细胞，至少一个通常管状构造的通流通道3的直径与这些细胞尺寸匹配，并且通常仅略大于待检查样品1的最大直径，使得它们不堵塞通流通道3。在此，若通过相应措施确保样品1尽可能一个接一个地进入至少一个通流通道3，则具有较大直径(例如40μm和更大)的通流通道3也可用于具有小于5μm直径的较小的样品，这例如可以通过在从通道传输装置2至通流通道3的过渡部处的进入开口的可变尺寸实现。但是由于专门的照明和探测(下面更详细的说明)，所以若多个样本1同时或并排地位于通流通道3中也是可以的。此外，至少一个通流通道3与此处未示出的泵装置耦连，该泵装置用于产生流动，在此通过流动方向23表示。通过相应控制和借助阀门，可以根据待进行的分析改变流动速度和/或甚至流动方向。

至少一个通流通道3设计在通道载体4上或者通道载体中，其中它例如可以是微流体芯片。这些微流体芯片可以针对多个分析和/或实验而针对性配置或者生产，因此通道载体4优选是可更换的。通流通道3通过软管5与通道传输装置2连接，在通道载体4中的通流通道3的另一个端部上也可以安装用于排放样品1的软管5，样品可以必要时被分选、输送至进一步分析或者实验，或者备选地被处理掉。

通道载体4能沿所有三个空间方向移动，为此，通道载体在此布置在相应移动的样品台6上，该样品台额外地在通过样品台6的支承面7定义的平面中能转动。在至少一个通流通道3中的流动方向23至少在其中进行分析的区域中也位于该平面中。

在至少一个通流通道3中，样品1沿流动方向23以平均矢量流动速度在输入线路和排出线路之间流动，其中不排除样品1在短时间内在操控速度时停在原地。在通流通道3具有管形横截面时，流动方向23在所有情况中都沿通道，即平行于管形通道的纵轴线。

为了执行分析，所述设备具有照明器件，利用该照明器件照明样品1，并且其在此优选地也设计为激发器件，用于激发在至少一个通流通道3中样品1以发出荧光信号。样品发射探测光，其可以被动地以散射光的形式进行，但是也可以主动地以发射的荧光信号的形式。探测光利用同样是所述设备一部分的探测器件探测。该设备此外具有分析器件用于分析探测到的探测光，例如探测到的荧光信号。在此，例如可以是相应地编程的计算机作为评估单元，带有输出单元，例如屏幕。

在图1所示设备中，照明器件或者说激发器件和探测器件通过光片显微镜8实现，光片显微镜在此以倒置的形态示出。若在样品台6上方的构造例如由于软管5和连接软管的仪器需要太多空间，这种倒置的形态是有利的，可以但非强制地想到，光片显微镜布置在通道载体4上方。在此示出的光片显微镜8包括照明光学器件9和探测光学器件10。照明光学器件9在图1左侧示出。源自激光模块11的光(在此例如设置不同波长的多个激光器或者可以在不同波长之间选择，其中甚至可以同时选择多个波长)通过光线成形模块12和扫描模块13(例如用于产生准静态光片和/或用于角度设置)转向到照明物镜14上，照明物镜14将光片成像到光片平面中进入通道载体4和通流通道3，其在此与照明物镜14的光轴一致。照明物镜14的焦点，即光片具有最窄延展尺寸的位置，可以借助驱动装置控制，例如借助压电驱动装置15控制，使得焦点例如在使用仅一个通流通道的情况下位于通流通道中。备选地或者额作为补充地，样品台6可以调节。

在右侧示出示例性探测光学器件10，其包括探测物镜16，探测物镜16类似于照明物镜14借助驱动装置，在此同样借助压电驱动装置17调节。探测物镜16的光轴与光片平面围成不为零、在此直角的角度，照明物镜14的光轴位于光片平面中。然而这不是强制需要的：为了运行所述方法，在光片的平面和探测物镜16的光轴之间不为零的角度就足够了。然而，将物镜的两个光轴相对于彼此以90°角布置的优点在于，检测物镜16的焦面于是与光片平面相同，因此光片平面的整个区域若被探测物镜16检测就能清晰地成像，在此即穿过通流通道3的整个的、倾斜的横截面。从样本1发出的检测光，例如在相应激发之后从样本发出的荧光由探测物镜16转向到探测18上，在此可以借助于光束分裂器使用多个探测模块。在用包括多个波长的光片同时或准同时照明样品时，则例如可以根据波长不同地进行探测。平面式探测器通常处于探测模块18中，平面式探测器记录强度以及必要时记录颜色并转换为相应的电信号，电信号然后传输到分析单元和图像处理单元上并在那里处理。

图2详细示出通道载体4。至少一个通流通道3设计在通道载体4、例如微流体芯片中，在此，它通常是透明的、板形的主体，带有两个相互平行的大表面部和边缘表面部，边缘表面部将两个大表面部连接。至少一个通流通道3设计为在透明的板形主体中向两个侧面开口的空腔。在所示设备中，光片19被如此定向，使得光片与至少一个通流通道3在相交区域20中相交，并且光片平面22的法线21与流动方向23在相交区域20中围成不为零的角度，在相交区域20中，样品1在此例如被激发以发出荧光信号。通道载体4的透明的材料位于相交区域20和照明物镜14或者说探测物镜16之间，并且由于选择的布局，探测物镜16和照明物镜14的光轴相对于通道载体4和通流通道3之间的界面和在通道载体4的底侧面和处于其下方的介质之间的界面不以直角，而是倾斜地布置。这导致像差。为了校正这些像差，光片显微镜8可以具有不同的、在图1中示例性示出的校正器件，其可以单独或组合使用。例如，物镜前方可以连接专门的透镜，所谓的“虚拟中继器，virtuelle Relays”。在此，它是自由变形透镜，其被设计用于在通道载体4厚度(在此在通流通道3和通道载体4的底部，即底侧面之间)预先规定的情况下和在位于自由变形透镜和通道载体之间的介质(例如空气或者浸没介质)预先规定的情况下校正像差。借助弯月形透镜可以校正由浸没介质引起的像差，其中，在此利用弯月形透镜根据设计也能进行用于多个浸没介质的校正。然而利用弯月形透镜不能纠正基于光歪斜地在通道载体4的底侧面和通流通道3之间穿过通道载体4引起的像差。最后，可以使用波前操作器，所谓的Alvarez板用于校正两种像差。借助波前操作器可以例如扩展虚拟中继器的厚度范围。

在此所示设计方案中，一方面在照明物镜14和探测物镜16中例如分别布置有可设置的波前操作器24。另一方面虚拟中继器25位于光片显微镜8的物镜和通道载体4之间，虚拟中继器25在此显示为一个透镜，但是也可以包括多个透镜。例如空气26或者浸没液体27作为介质位于虚拟中继器25和通道载体4的底侧面之间。校正器件(虚拟中继器25或者弯月形透镜28和波前操作器24)可以结合地，也可以单个使用，必要时根据处于通道载体4的底侧面上的介质使用。此外，当然也可以使用另外的校正机制，例如其他前置透镜或者自由变形透镜，它们集成在物镜中。

样品1在至少一个通流通道3中沿流动方向23如图2所示地前进，样品1若事先被相应地标记，就在相交区域20中由光片19激发荧光。相交区域19是较小的体积，因为光片在最大聚焦的区域中、垂直于光片平面也具有有限的维度，然而该维度相较于光片在平面中的维度明显更小，相对于其可以忽略。然而为了清楚表示，相交区域在此略微放大地示出。荧光信号由探测光学器件10探测并且通过未示出的分析器件定量评估，如现有技术中常见的那样。然而相对于荧光信号额外地，也可以记录或者说拍摄样品1的完整图像，此外也可以记录图像栈，而不必机械地移动部件，因为样品1沿流动方向23基于流动速度穿过探测物镜16的焦面，所述焦面通常与光片平面22一致。被记录的图像数据，例如形状、形态、空间结构在此以比现有技术中可实现的更大的分辨率存在，这些图像数据可以相对于荧光额外地用于进一步分析和必要时甚至用于根据另外的参数对样品相应的分选。不需要单独对样品的聚焦。甚至样品也不必在流动技术上在通流通道3中聚焦，因为光片19在通流通道的横截面上覆盖通流通道3。这具有的优点是，甚至可以使用更大的通流通道3并且可以测量更大的细胞密度，尤其当需要空间成像时。

所述设备与另外的探测装置的结合是可行的，为此的示例在图3和图4中示出。相对于在此简化示出的光片显微镜8额外地，图3示出传统地布置的显微物镜29，其与摄像机30连接。它相对于通流通道3或者透明的、板形通道载体4这样定向，使得它垂直于界面地朝向，使得在此不需要校正入射光倾斜产生的像差。借助能引入光路中的并且还能从中去除的用于提高景深的元件(EDOF元件)31，以这种方式还可以产生带有更低分辨率的二维图像。相对于倒置的光片显微镜8额外地，图4示出布置在通流通道3上方的另外的光片显微镜32，这些光片相交。对于两个光片显微镜8、32可以使用相同的配置，但是完全可行的是使用不同的配置。在此情况中区别在于校正器件和在物镜和通流通道3之间的介质。光片19可以具有不同颜色，这可以以不同方式产生。例如可行的是，使用借助柱面透镜产生的静态光片，或者基于其他形式的光片，所谓Sinc3光片、借助Mathieu射线或者Bessel射线产生的光片、或者甚至借助格栅产生的格栅光片。

下面说明不同的通道载体或者微流体芯片，其尤其适用于与面式扩展的光片照明使用。这种通道载体在图5-8中示出。

由于光片在平面中具有比通流通道3的直径更大的维度(根据选择的照明光学器件具有例如400μm和更大的宽度以及在20μm至200μm范围中的长度)，并且由于探测物镜16的焦面位于光片平面22中，所以可以使用通道载体4，多个平行的通流通道3布置在该通道载体上。这种示例在图5中示出。在此，若样品1都源自唯一一组样品时，通流通道3可以包括共同的输入线路和排放线路。但是同样可行的是，通流通道3组合成多个组，其中，所述组本身具有相同的输入和排放线路，然而每个组都具有自己的输入和排放线路。这实现了源自不同样品总量的样品1的平行的检查。此外在所有通流通道3上可以配设自己的输入线路和自己的排放线路。甚至用于所有通流通道3的排放线路可以是共同的，即使当它们是不同地分组的，例如对于样品1接着不再被使用的而是应输送至共同的处理容器的情况。

光片19可以是多色的光片，这在下述情况是尤其有利的，若源自不同的被不一样标记的样品总量的样品1应平行地检查时，或者若单个样品1、例如细胞用多个颜料标记，其根据激发波长在不同的波长中发出荧光；也可以将同样的或者不同颜色的光片以预先规定的相互距离彼此平行地布置，它们可以在相应设计中用共同的探测光学器件探测。

由探测光学器件10探测的数据的分析的结果可以用于在样品穿过光片之后将样品1接着借助分选单元分选。用于这种通道载体4的示例在图6中示出。分选单元包括分选机构33和分支通道34。分选机构33可以以现有技术中已知的方式设计，它例如可以以电泳、声学或者光学的方式操作样品1或者将样品从其流动方向偏转，使得样品转向到多个分支通道34的一个中。这甚至也可以针对多个通道同时地进行，因为光片具有较大的面积。

光片相较于通道横截面具有较大的面式维度或者说延展尺寸，该事实可以用于检查样片1的时间上的行为，若例如使用通道载体4，该通道载体具有曲折的通流通道3，该通流通道与光片19多次相交，使得在通流通道3中产生一定数量的沿流动方向23先后布置的相交区域20。这例如在图7中示出。相交区域20带有阴影。通道载体4的这种设计方案结合上述设备特别适用于研究样品在操作后的表现的时间上的进程。为此有利的是，将不同颜色的光片叠加和必要时在时间上控制，若根据实验的方式或者分析的方式是需要的。在图7所示结构中，样品1首先从左侧进入通流通道3并且经过相交区域20中的第一个。在那里进行操作，该操作例如可以简单地是荧光发射的激发。其他可行的操作方法例如是光活化(即将样品1转换到能发荧光的状态)以及光释放(Uncaging)，光转化(样品1从发射第一波长的荧光信号的状态转换到发射第二波长荧光信号的状态)，或者FRAP(荧光漂白恢复技术)。在此在样品1内部，例如细胞内部，局部高强度照射，这在局部在该位置触发相对于荧光的光漂白过程。之后不久，在另外的位置上较弱地激发并且记录图像，该图像被分析荧光通过局部扩散又以何种程度建立。必要时可以用另外的、叠加的光片触发另外的反应。样品1又离开该相交区域20并且又通过流动继续在通流通道3中导引，直至其到达下一个相交区域20。在那里，可以借助该光片或者其他光片进行初次观察或者另外的操作。在另外的相交区域20中，必要时可以再利用其他光片进行另外的观察。基本上可行的是，所有叠加颜色的光片永久性连接，根据流动速度和通流通道3的部段的长度在每两个相交区域20之间可以进行光片的时间上的控制，使得在样品1穿过相交区域20的时刻只有在那里需要的光片被接通。这种方法尤其在研究较少样品时使用，所述较少样品以不太高的速度流过通流通道3。

两个针对通道载体4的另外的设计方案在图8a和8b中示出。在此，至少一个通流通道3沿流动方向23改变其直径，在此变窄。这种收窄可以用于将样品1尤其细胞机械地变形。通过光片的相应定位(例如在图8a中所示)，可以记录样品在变形前的图像和在变形期间的图像，通过流动在此可以直接产生变形的细胞的空间图像。替选的是，通流通道3在收窄部之后转向并且导回，使得变形的样品再次经过同一光片。通流通道3再次变宽，可以记录另外的图像，以此可以分析是否出现永久性变形。

上述设备可以用于在较短时间光学操作和分析生物的、用荧光标记物标记的样品，尤其用于多个样品。相对于定量分析额外可行的是，不仅以二维而且以空间的呈现以高分辨率生成图像数据，使得甚至提供用于详细分析的高分辨率的图像。以此可行的是，生成另外的用于样品的可能的分选的参数。在此不仅针对分析而且也针对所有单个样品的详细分析实现高样品通过量。

附图标记列表

1 样品

2 通道传输装置

3 通流通道

4 通道载体

5 软管

6 样品台

7 支承面

8 光片显微镜

9 照明光学器件

10 探测光学器件

11 激光模块

12 射线成形模块

13 扫描模块

14 照明物镜

15 压电驱动装置

16 探测物镜

17 压电驱动装置

18 探测模块

19 光片

20 相交区域

21 光片平面的法线

22 光片

23 流动方向

24 波前操作器

25 虚拟中继器

26 空气

27 浸没液体

28 弯月形透镜

29 显微镜物镜

30 摄像机

31 EDOF元件

32 另外的光片显微镜

33 分选机构

34 分支通道。

Claims (16)

1.一种用于光学检查多个显微的样品(1)的方法，其中，

-所述样品(1)从多个样品中以通道传输并相继借助在至少一个通流通道(3)中的流体导引，所述样品在所述通流通道中沿预先规定的流动方向(23)前进，

-对所述样品(1)照明，

-探测和分析从所述样品(1)发出的光，其特征在于，

-对所述样品(1)照明，方式是带有光片平面(22)的至少一个光片(19)对准所述至少一个通流通道(3)，并且所述光片(19)如此定向，使得光片在相交区域(20)中与至少一个通流通道(3)相交，并且所述光片平面(22)的法向(21)与流动方向(23)在所述相交区域(20)中围成不同于零的角，并且

-由所述样本(1)发射的光由成像的探测光学器件(10)记录，所述探测光学器件的焦面位于所述相交区域(20)中。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，所述探测光学器件(10)探测流动穿过所述相交区域(20)的各个样品(1)的图像，或者在时间上连续地探测由流动穿过所述相交区域(20)的各个样品(1)的单个图像构成的图像栈。

3.按照权利要求2所述的方法，其特征在于，所述图像栈的单个图像组成空间上的显示。

4.按照权利要求1至3之一所述的方法，其特征在于，所述样品(1)在所述检查前用荧光标记物标记，所述样品通过所述至少一个光片(19)激发以便发出荧光信号，并且探测和分析所述荧光信号。

5.按照上述权利要求之一所述的方法，其特征在于，根据对由探测光学器件探测到的光的所述分析，必要时根据图像的信息和/或荧光信号进行所述样品(1)的分选。

6.按照上述权利要求之一所述的方法，其特征在于，为了检查所述样品的时间上的特性，所述至少一个光片(19)多次与至少一个通流通道(3)在多个相交区域(20)中相交。

7.按照上述权利要求之一所述的方法，其特征在于，所述至少一个光片(19)与多个通流通道(3)相交。

8.按照上述权利要求之一所述的方法，其特征在于，所述样品(1)用优选不同波长的多个光片(19)照明。

9.一种用于光学检查多个显微样品(1)的设备，其包括

-用于以通道传输样品和用于把样品(1)相继输送到至少一个通流通道(3)的通道传输装置(2)，所述样品(1)在所述通流通道中沿预先规定的流动方向前进，

-照明器件，所述照明器件用于照明在所述至少一个通流通道(3)中的样品(1)以发射探测光，

-用于探测由样品(1)发射的探测光的探测器件，

-用于分析所述探测光的分析器件，其特征在于，

-所述照明器件包括用于产生至少一个带有光平面(22)的光片(19)的照明光学器件(9)，其中，所述光片(19)相对于所述通流通道(3)如此定向，使得所述光片在相交区域(20)中与所述通流通道(3)相交并且所述光片平面(22)的法线(21)与流动方向(23)在所述相交区域(20)中围成不为零的角度，以此在相交平面(20)中照明所述样品(1)，并且

-所述探测器件包括成像的探测光学器件(10)，所述探测光学器件的焦面位于所述相交区域(20)中。

10.按照权利要求9所述的设备，其特征在于，所述至少一个通流通道(3)设计在可替换的通道载体(4)上。

11.按照权利要求9或10所述的设备，其特征在于，在所述通道载体(4)上布置有多个平行的通流通道(3)，所述通流通道(3)优选具有相互分离的输入线路和/或排放线路和分别具有与所述光片(19)的相交区域(20)。

12.按照权利要求9至11之一所述的设备，其特征在于，沿流动方向(23)在光片(19)后方布置有分选单元，和/或在光片(19)前方或者后方布置有操作单元。

13.按照权利要求9至12之一所述的设备，其特征在于，所述照明器件设计为发射用于激发用荧光标记物标记的样品(1)以发出荧光信号的光。

14.按照权利要求9至13之一所述的设备，其特征在于，所述探测器件包括另外的探测器，用于探测荧光信号和/或散射光。

15.按照权利要求9至14之一所述的设备，其特征在于，所述照明器件包括一个照明光学器件(9)或者用于产生多个光片(19)的多个照明光学器件(9)，所述光片的光片平面相互平行，其中优选所有光片具有不同的颜色。

16.按照权利要求9至15之一所述的设备，其特征在于，所述至少一个通流通道(3)设计为沿流动方向(23)其直径是变化的，和/或相对于光片(19)的位置为了构成多个与光片的相交区域(20)而曲折状设计。

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