CN111157722A - 生物标志物的用途 - Google Patents
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Abstract
生物标志物的用途，本发明涉及一种生物标志物，具体来说，是一种痛风肠道微生物标志物，本发明提供一种如下的技术方案：一种能够结合或者特异性识别生物标志物的配体在制备试剂盒中的用途，所述的生物标志物为：Species层面的：另枝菌属Alistipes Onderdonkii、另枝菌属Alistipes Shahii、单形拟杆菌、死亡梭杆菌；和strain层面的：单形拟杆菌、GCF000210555、GCF000210575和GCF000374505。本发明的有益效果在于：该发明提供早期非侵入性诊断痛风疾病状态的方法及生物标志物。根据受检者肠道菌群的不同，可应用于制备痛风治疗药品及平衡肠道菌群微环境稳态。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物标志物，具体来说，是一种痛风肠道微生物标志物，属于生物技术领域。
背景技术
痛风是一种体内嘌呤代谢紊乱导致单钠尿酸盐沉积在关节或结缔组织的代谢风湿性疾病，表现为关节的红肿疼痛，严重者可导致痛风石的出现、关节的活动障碍甚至肾脏的损伤。其不仅可造成关节的变形及肾脏的损伤，甚至与高血压、高血脂、冠心病等疾病紧密关联。因此，把握体内嘌呤的代谢显得尤为重要。体内嘌呤有2个来源：1)外源性的，主要是食物；2)内源性的，主要是体内合成。因为外源嘌呤的可控制性，所以在临床中痛风患者预防痛风发作的一个重要手段是饮食的控制。食物的消化吸收器官主要是肠道，其过程是肠道内的微生物将食物分解为单糖，后者被小肠上皮细胞吸收入血。因此，肠道菌群在嘌呤代谢中发挥重要的作用。
健康人尿酸的排泄方式主要有两种：70％的尿酸通过肾脏排泄，剩下的30％通过肠道排泄或由肠道菌群分解，因此，原发性痛风可能与肠道菌群密切相关。从痛风的发病机制以及肠道菌群在代谢紊乱中的作用来看，肠道的不平衡可能在痛风的发病过程中起着重要作用。由于对痛风与肠道菌群关系的研究很少，因此分析肠道菌群与痛风发生发展的关系具有重要意义。
发明内容
为决绝上述提到的问题本发明提供一种如下的技术方案：
一种能够结合或者特异性识别生物标志物的配体在制备试剂盒中的用途，所述的生物标志物为：
Species层面的：另枝菌属Alistipes Onderdonkii、另枝菌属Alistipes Shahii、单形拟杆菌、死亡梭杆菌；和
strain层面的：单形拟杆菌、GCF000210555、GCF000210575和GCF000374505。
进一步的，所述的试剂盒于根据标志物的丰度变化对个体患痛风概率进行诊断和/或监测。
进一步的，对标志物的丰度变化检测通过如下方法实现：
(1)提取待检测个体的样本中的标志物；
(2)对标志物的丰度和正常对照组的丰度进行比较，根据比较结果确定个体的状态。
进一步的，所述的样本是指粪便。
本发明还提供一种生物标志物或者特异性结合该生物标志物的抗体或者抗体片段在准备1)用于治疗痛风的药物；2)用于预防或者缓解痛风的功能性食品的用途；所述的生物标志物为：
Species层面的：另枝菌属Alistipes Onderdonkii、另枝菌属Alistipes Shahii、单形拟杆菌、死亡梭杆菌；和
strain层面的：单形拟杆菌、GCF000210555、GCF000210575和GCF000374505。
本发明还提供一种能结合或者特异性识别生物标志物的配体在制备试剂盒的用途，所述的试剂盒用于监测治疗痛风过程中使用的药物或者治疗方法的有效性，包括有检测和/或量化来自患者样本中所述的标志物，所述的标志物是
Species层面的：另枝菌属Alistipes Onderdonkii、另枝菌属Alistipes Shahii、单形拟杆菌、死亡梭杆菌；和
strain层面的：单形拟杆菌、GCF000210555、GCF000210575和GCF000374505。
本发明还在于一种益生菌微囊，所述的益生菌微囊用于调节痛风患者体内如下的标志物：
Species层面的：另枝菌属Alistipes Onderdonkii、另枝菌属Alistipes Shahii、单形拟杆菌、死亡梭杆菌；和
strain层面的：单形拟杆菌、GCF000210555、GCF000210575和GCF000374505。
本发明的有益效果在于：该发明提供早期非侵入性诊断痛风疾病状态的方法及生物标志物。根据受检者肠道菌群的不同，可应用于制备痛风治疗药品及平衡肠道菌群微环境稳态。
附图说明
图1为各样本中Alistipes Onderdonkii的丰度；
图2为Gout和HC组中Alistipes Onderdonkii的差异比较；
图3为各样本中Alistipes Shahii的丰度；
图4为Gout组和HC组中Alistipes Shahii的差异比较；
图5为各样本中Bacteroides uniformis的丰度；
图6为Gout组和HC组中Bacteroides uniformis的差异比较；
图7为各样本中Fusobacterium mortiferum的丰度；
图8为Gout组和HC组中Fusobacterium mortiferum的差异比；
图9为各样本中Bacteroides uniformis的丰度；
图10为Gout组和HC组中Bacteroides uniformis的差异比较；
图11为各样本中GCF 000210555的丰度；
图12为Gout组和HC组中GCF 000210555的差异比较；
图13为各样本中GCF 000210575的丰度；
图14为Gout组和HC组中GCF 000210575的差异比较
图15为各样本中GCF 000210505的丰度；
图16为Gout组和HC组中GCF 000210505的差异比较。
具体实施方式
实施例1痛风患者和健康对照者肠道菌群差异物种分析
采用的分析方法如下：
1.测序数据的获取
1.1样本收集和DNA提取
样本收集需要器械包括：坐便器、粪便样本采集器；
收集痛风患者的新鲜粪便样品，置于4℃冰盒中2小时内输送至实验室分装到EP管中，每份200mg/份，共5份，立即-80℃冰箱冷冻保存。
利用市面在售粪便微生物DNA提取试剂盒，按照说明书步骤提取微生物DNA，-80℃保存。
1.2构建文库及测序
DNA建库按仪器制造商(Illuminate)的16SrRNA基因扩增子测序操作指南进行。利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和浓，取适量的样品于离心管中，使用无菌水稀释样品至1ng/μl，以稀释后的基因组DNA为模板，选取带有Barcode的细菌16S rRNA基因高可变区V4区特异性引物(515F,5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’,and 806R，5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)，New England Biolabs公司的
High-Fidelity PCR Master Mix with GCBuffer，和高效高保真酶进行PCR；PCR产物使用2％浓度的琼脂糖凝胶进行电泳检测；根据PCR产物浓度进行等量混样，充分混匀后使用2％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，对目的条带使用qiagen公司提供的胶回收试剂盒回收产物。
使用
DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建库试剂盒进行文库构建，构建好的文库经过Qubit和Q-PCR定量，文库合格后，使用HiSeq2500 PE250进行上机测序。
2.生物标志物的鉴定
2.1测序数据的基本处理
利用扩增子测序技术进行测序，得到高质量读段(reads)根据Barcode序列将下机数据拆分为不同样品数据，并截去Barcode序列和PCR扩增引物。此后按照高标准进行reads拼接、过滤、去除嵌合体序列等质控步骤，得到有效读段(effective reads)用于微生物物种鉴定。Effective reads通过与SILVA数据库比对注释进行物种鉴定。
2.2物种丰度分析
1)OTU聚类：使用Uparse软件(Uparse v7.0.1001，(http://drive5.com/uparse/))对所有样品的全部Effective Tags序列进行97％和95％的一致性(Identity)两个等级聚类，形成OTU；
2)OTU注释：选取OTU代表序列，使用Qiime中的assign_taxonomy.py脚本和RDPClassifier方法，Silva数据库进行比对获得物种注释信息(置信度阈值默认为0.8以上)；
3)使用R软件进行OUT各个分类等级的注释比例和各个分类等级物种相对丰度的统计。
2.3差异物种筛选
基于均一化的物种的丰度表，同时使用R软件进行组间物种的差异显著分析，使用Fisher精确检验并进行FDR校正。
根据标准筛选出差异菌群丰度＞1*e^(-4)和p值<0.05差异物种用STAMP2.1.3(选取two group，采用welch’s t-test方法，双侧检验，p<0.05为有统计学意义)软件对界、门、纲、目、科、属、种各层进行痛风患者和健康对照者肠道菌群差异物种分析，结果在种(species)和株(strain)共找到8个差异物种，其中species层的差异菌株是另枝菌属(Alistipes Onderdonkii)、另枝菌属(Alistipes Shahii)、单形拟杆菌(Bacteroidesuniformis)和死亡梭杆菌(Fusobacterium mortiferum)；strain层的差异菌株为：单形拟杆菌(Bacteroides uniformis)、GCF000210555、GCF000210575和GCF000374505。
其中species层面的4种差异菌株包括有：另枝菌属Alistipes Onderdonkii、另枝菌属Alistipes Shahii、单形拟杆菌Bacteroides uniformis、死亡梭杆菌Fusobacteriummortiferum，如图1-8所示所述：
图1为各样本(实验用无菌粪便样本采集器采集了15例中国汉族痛风患者和15例健康人的新鲜粪便样品，置于4℃冰盒中2小时内输送至实验室分装到EP管中，每份200mg/份，共5份，立即-80℃冰箱冷冻保存。利用市面在售粪便微生物DNA提取试剂盒按照说明书步骤提取微生物DNA，-80℃保存。)中Alistipes Onderdonkii的丰度，图2为Gout和HC组(无痛风健康人)中Alistipes Onderdonkii的差异比较，可以看出，Alistipes Onderdonkii的丰度Gout组明显低于HC组(p＝0.032)。
图3为各样本中Alistipes Shahii的丰度，图4为Gout组和HC组中AlistipesShahii的差异比较，可以看出Alistipes Shahii的含量Gout组均明显低于HC组(p＝0.023)。
图5为各样本中Bacteroides uniformis的丰度，图6为Gout组和HC组中Bacteroides uniformis的差异比较，可以看出Bacteroides uniformis的含量Gout组均明显低于HC组(p＝0.020)。
图7为各样本中Fusobacterium mortiferum的丰度，图8为Gout组和HC组中Fusobacterium mortiferum的差异比，可以看出Fusobacterium mortiferum的含量Gout组均明显高于HC组(p＝0.032)。
也就是说，Species层的四种差异菌株中另枝菌属(Alistipes Onderdonkii)、另枝菌属(Alistipes Shahii)和单形拟杆菌(Bacteroides uniformis)三种菌株的肠道菌群含量Gout组均明显低于HC组(p<0.05)；死亡梭杆菌(Fusobacterium mortiferum)的含量Gout组明显高于HC组(p<0.05)。
另外，strain层面的差异菌株为：单形拟杆菌(Bacteroides uniformis)、GCF000210555、GCF000210575和GCF000374505，分别如图9-16所示:
图9为各样本中Bacteroides uniformis的丰度，图10为Gout组和HC组中Bacteroides uniformis的差异比较，可以看出Bacteroides uniformis肠道菌群含量Gout组均明显低于HC组(p＝0.029)。
图11为各样本中GCF 000210555的丰度，图12为Gout组和HC组中GCF 000210555的差异比较，可以看出GCF 000210555肠道菌群含量Gout组均明显低于HC组(p＝0.040)。
图13为各样本中GCF 000210575的丰度，图14为Gout组和HC组中GCF 000210575的差异比较，可以看出GCF 000210575肠道菌群含量Gout组均明显低于HC组(p＝0.024)。
图15为各样本中GCF 000210505的丰度，图16为Gout组和HC组中GCF 000210505的差异比较，可以看出GCF 000210505肠道菌群含量Gout组均明显低于HC组(p＝0.026)。
因此，Strain层的四种差异菌株单形拟杆菌(Bacteroides uniformis)、GCF000210555、GCF000210575和GCF000374505的肠道菌群含量Gout组均明显低于HC组(p<0.05)。
实施例2制备益生菌微囊
制作包含另枝菌属(Alistipes Onderdonkii)、另枝菌属(Alistipes Shahii)、单形拟杆菌(Bacteroides uniformis)、死亡梭杆菌(Fusobacterium mortiferum)、单形拟杆菌(Bacteroides uniformis)、GCF000210555、GCF000210575、GCF000374505的益生菌微囊。粒子大小通常为5～400gm，囊壁的厚度为0.2～10gm。复凝聚法制备微胶囊流程制备原胶液→加入菌悬液→乳化剂→搅拌混匀→调节pH至酸性→加入固化剂→搅拌→调节pH至碱性→离心→洗涤→收集微胶囊。
Claims (7)
1.一种能够结合或者特异性识别生物标志物的配体在制备试剂盒中的用途，其特征在于，所述的生物标志物为：
Species层面的：另枝菌属Alistipes Onderdonkii、另枝菌属Alistipes Shahii、单形拟杆菌、死亡梭杆菌；和
strain层面的：单形拟杆菌、GCF000210555、GCF000210575和GCF000374505。
2.如权利要求1所述的能够结合或者特异性识别生物标志物的配体在制备试剂盒中的用途，其特征在于，所述的试剂盒于根据标志物的丰度变化对个体患痛风概率进行诊断和/或监测。
3.如权利要求2所述的能够结合或者特异性识别生物标志物的配体在制备试剂盒中的用途，其特征在于，对标志物的丰度变化检测通过如下方法实现：
(1)提取待检测个体的样本中的标志物；
(2)对标志物的丰度和正常对照组的丰度进行比较，根据比较结果确定个体的状态。
4.如权利要求3所述的能够结合或者特异性识别生物标志物的配体在制备试剂盒中的用途，其特征在于，所述的样本是指粪便。
5.一种生物标志物或者特异性结合该生物标志物的抗体或者抗体片段在准备1)用于治疗痛风的药物；2)用于预防或者缓解痛风的功能性食品的用途；其特征在于，所述的生物标志物为：
Species层面的：另枝菌属Alistipes Onderdonkii、另枝菌属Alistipes Shahii、单形拟杆菌、死亡梭杆菌；和
strain层面的：单形拟杆菌、GCF000210555、GCF000210575和GCF000374505。
6.能结合或者特异性识别生物标志物的配体在制备试剂盒的用途，所述的试剂盒用于监测治疗痛风过程中使用的药物或者治疗方法的有效性，包括有检测和/或量化来自患者样本中所述的标志物，所述的标志物是
Species层面的：另枝菌属Alistipes Onderdonkii、另枝菌属Alistipes Shahii、单形拟杆菌、死亡梭杆菌；和
strain层面的：单形拟杆菌、GCF000210555、GCF000210575和GCF000374505。
7.一种益生菌微囊，其特征在，所述的益生菌微囊用于调节痛风患者体内如下的标志物：
Species层面的：另枝菌属Alistipes Onderdonkii、另枝菌属Alistipes Shahii、单形拟杆菌、死亡梭杆菌；和
strain层面的：单形拟杆菌、GCF000210555、GCF000210575和GCF000374505。
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