CN111154829A - 一种促多巴胺成分的单一菌的筛选方法 - Google Patents

一种促多巴胺成分的单一菌的筛选方法 Download PDF

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
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Abstract

本发明公开一种促多巴胺成分的单一菌的筛选方法。本发明方法包括样品采集、条件性初步筛选、抗逆性复筛的步骤；其制备方法，包括菌株活化及扩培、厌氧发酵、菌体收集。本发明实施促多巴胺成分的单一菌，具有高活性、在常温或高温货架期内能显著提高稳定性、并且在室外具有良好的耐酸、耐盐碱及对种植作物根系良好的粘附性。

Description

一种促多巴胺成分的单一菌的筛选方法
技术领域
本发明涉及微生物领域，具体地说是一种促多巴胺成分的单一菌的筛选方法。
背景技术
放线菌与人类的生产和生活关系极为密切，广泛应用的抗生素约70％是各种放线菌所产生。一些种类的放线菌还能产生各种酶制剂(蛋白酶、淀粉酶、和纤维素酶等)、维生素(B12)和有机酸等。放线菌在自然界分布广泛，主要以孢子或菌丝状态存在于土壤、空气和水中，尤其是含水量低、有机物丰富、呈中性或微碱性的土壤中数量最多。放线菌只是形态上的分类，属于细菌界放线菌门。土壤特有的泥腥味，主要是放线菌的代谢产物所致。
多巴胺(Dopamine)(C6H3(OH)2-CH2-CH2-NH2)由脑内分泌，可影响一个人的情绪。它正式的化学名称为4-(2-乙胺基)苯-1,2-二醇，简称「DA」。本品为体内合成肾上腺素的前体，具有β受体激动作用，也有一定的受体激动作用。能增强心肌收缩力，增加排血量，加快心率作用较轻微(不如异丙肾上腺素明显)；对周围血管有轻度收缩作用，升高动脉压，对内脏血管(肾、肠系膜、冠状动脉)则使之扩张，增加血流量；使肾血流量及肾小球滤过率均增加，从而促使尿量及钠排泄量增多。
由于多巴胺的特性，亟待一种适应多巴胺环境培养的微生物菌剂。促多巴胺成分菌剂的研究已成为益生菌菌株研发的热点。然而，促多巴胺成分菌剂的开发，关键技术在于菌种的筛选，从什么途径、用什么方法筛选出这种菌株。现有技术的筛选方法，多根据其所具有的生物学和功能特征，这些方法可对其进行初步筛选，但是筛选工作繁重、周期长，且筛选准确性较低。
发明内容
本发明的目的在于提出一种促多巴胺成分的单一菌的筛选方法，提供一种简单、高效且准确性高的促多巴胺成分的单一菌的筛选方法。
为实现上述目的本发明所述一种促多巴胺成分的单一菌的筛选方法，实现步骤如下：
S1、样品采集；将含放线菌的样品溶于无菌水中，55-65℃水浴处理5-10min，得到混合菌种水溶液；
S2、条件性初步筛选：样品混合均匀梯度稀释后，移液至筛选培养基上涂布分离，厌氧恒温25-45℃培养12-72h；然后挑选边缘光滑、呈乳白色隆起的菌落，反复划线镜检出菌体呈杆状、呈分叉状的革兰氏阳性菌落，反复纯化后继续厌氧恒温45℃-50℃培养30-36h；
S3、抗逆性复筛：将菌泥加入稀释液混合均匀，然后置于40-80℃恒温水浴锅进行热激，计时热激5-30min，完成热激后迅速使用冷却水降温于20℃以下，将热激后含菌稀释液进行涂布或划线进行分离，挑选其中生长饱满且大小适中菌落于SC培养基中扩培，重复将扩培后的发酵液进行离心、稀释、热激、涂布、筛选一系列循环，循环次数30-50次，通过检测其热激前后细胞存活率达到 20-40％以上可完成条件初筛，得到促多巴胺成分的单一菌，随后进行保藏。
所述促多巴胺成分的单一菌在45℃条件下保温30min存活率达到50％以上。
所述样品采集自种植田园土壤。
步骤S2中，样品置于生理盐水中混合均匀梯度稀释。
步骤S2中，所述筛选培养基包括多巴胺1-20ug/L、葡萄糖10-20g/L、蛋白胨5-20g/L、酵母浸膏10-20g/L、无水乙酸钠3-5g/L、磷酸氢二钾1-3g/L、柠檬酸氢二铵1-3g/L、莫匹罗星锂盐5ml/L，调节pH至6.8。
步骤S3中，所述稀释液包括氯化钠0.05-0.1g/L、酪蛋白胨0.005-0.01g/L、磷酸氢二钠0.4-0.8g/L、磷酸二氢钾0.2-0.4g/L、多巴胺0.001-0.02ug/L。
步骤S3中，所述扩培中菌株的接种量为体积百分比1-10％，培养温度为 25-45℃，培养时间为12-72h。
本发明所述一种促多巴胺成分的单一菌的筛选方法，其有益效果在于：
1)存活率高、稳定性好；菌悬液在45℃条件下保温30min，存活率可达到 50％以上；
2)在常温18个月及高温3个月内具有高稳定性；
3)在室外模拟pH 5-7环境条件下存活良好；
4)在室外模拟盐碱环境条件下有良好耐受能力；
5)在模拟植物根系粘附性实验中，对根系粘附性达40％；
6)无毒、无致病性，安全性高，生产制备简便、周期短、发酵活力高，菌体离心收集率高。
本发明所筛选菌株用于微生态种植环境，并且赋予产品在货架期内能具有高稳定性价值，延长保质期或降低贮存条件，减少微生态产品在生产制造过程中成本费用。
本发明所述的菌株筛选方法及制备方案有效应用于大部分微生物活性食品、保健品生产线，主要优点在于筛选周期短、目的菌株离心率高收，产品活菌数3000-8000亿cfu/g，在常温180天内活菌数稳定性优异，下降趋势迟缓且平稳本发明方法为简单、高效且准确性高的促多巴胺成分的单一菌的筛选方法。
具体实施方式
本发明所述一种促多巴胺成分的单一菌的筛选方法，实现步骤如下：
S1、样品采集；将含放线菌的样品溶于无菌水中，55℃水浴处理5min，得到混合菌种水溶液；
S2、条件性初步筛选：样品混合均匀梯度稀释后，移液至筛选培养基上涂布分离，厌氧恒温25℃培养12h；然后挑选边缘光滑、呈乳白色隆起的菌落，反复划线镜检出菌体呈杆状、呈分叉状的革兰氏阳性菌落，反复纯化后继续厌氧恒温45℃培养30h；
S3、抗逆性复筛：将菌泥加入稀释液混合均匀，然后置于40℃恒温水浴锅进行热激，计时热激5min，完成热激后迅速使用冷却水降温于20℃以下，将热激后含菌稀释液进行涂布或划线进行分离，挑选其中生长饱满且大小适中菌落于SC培养基中扩培，重复将扩培后的发酵液进行离心、稀释、热激、涂布、筛选一系列循环，循环次数30次，通过检测其热激前后细胞存活率达到20％以上可完成条件初筛，得到促多巴胺成分的单一菌，随后进行保藏。
所述促多巴胺成分的单一菌在45℃条件下保温30min存活率达到50％以上。
所述样品采集自种植田园土壤。
步骤S2中，样品置于生理盐水中混合均匀梯度稀释。
步骤S2中，所述筛选培养基包括多巴胺1ug/L、葡萄糖10g/L、蛋白胨5g/L、酵母浸膏10g/L、无水乙酸钠3g/L、磷酸氢二钾1g/L、柠檬酸氢二铵1g/L、莫匹罗星锂盐5ml/L，调节pH至6.8。
步骤S3中，所述稀释液包括氯化钠0.05g/L、酪蛋白胨0.005g/L、磷酸氢二钠0.4g/L、磷酸二氢钾0.2g/L、多巴胺0.001ug/L。
步骤S3中，所述扩培中菌株的接种量为体积百分比1％，培养温度为25℃，培养时间为12h。
实施例2
本发明所述一种促多巴胺成分的单一菌的筛选方法，实现步骤如下：
S1、样品采集；将含放线菌的样品溶于无菌水中，65℃水浴处理10min，得到混合菌种水溶液；
S2、条件性初步筛选：样品混合均匀梯度稀释后，移液至筛选培养基上涂布分离，厌氧恒温45℃培养72h；然后挑选边缘光滑、呈乳白色隆起的菌落，反复划线镜检出菌体呈杆状、呈分叉状的革兰氏阳性菌落，反复纯化后继续厌氧恒温50℃培养36h；
S3、抗逆性复筛：将菌泥加入稀释液混合均匀，然后置于80℃恒温水浴锅进行热激，计时热激30min，完成热激后迅速使用冷却水降温于20℃以下，将热激后含菌稀释液进行涂布或划线进行分离，挑选其中生长饱满且大小适中菌落于SC培养基中扩培，重复将扩培后的发酵液进行离心、稀释、热激、涂布、筛选一系列循环，循环次数50次，通过检测其热激前后细胞存活率达到20-40％以上可完成条件初筛，得到促多巴胺成分的单一菌，随后进行保藏。
所述促多巴胺成分的单一菌在45℃条件下保温30min存活率达到50％以上。
所述样品采集自种植田园土壤。
步骤S2中，样品置于生理盐水中混合均匀梯度稀释。
步骤S2中，所述筛选培养基包括多巴胺20ug/L、葡萄糖20g/L、蛋白胨 20g/L、酵母浸膏20g/L、无水乙酸钠5g/L、磷酸氢二钾3g/L、柠檬酸氢二铵 3g/L、莫匹罗星锂盐5ml/L，调节pH至6.8。
步骤S3中，所述稀释液包括氯化钠0.1g/L、酪蛋白胨0.01g/L、磷酸氢二钠0.8g/L、磷酸二氢钾0.4g/L、多巴胺0.02ug/L。
步骤S3中，所述扩培中菌株的接种量为体积百分比10％，培养温度为45℃，培养时间为72h。
实施例3
本发明所述一种促多巴胺成分的单一菌的筛选方法，实现步骤如下：
S1、样品采集；将含放线菌的样品溶于无菌水中，60℃水浴处理8min，得到混合菌种水溶液；
S2、条件性初步筛选：样品混合均匀梯度稀释后，移液至筛选培养基上涂布分离，厌氧恒温35℃培养50h；然后挑选边缘光滑、呈乳白色隆起的菌落，反复划线镜检出菌体呈杆状、呈分叉状的革兰氏阳性菌落，反复纯化后继续厌氧恒温48℃培养32h；
S3、抗逆性复筛：将菌泥加入稀释液混合均匀，然后置于60℃恒温水浴锅进行热激，计时热激15min，完成热激后迅速使用冷却水降温于20℃以下，将热激后含菌稀释液进行涂布或划线进行分离，挑选其中生长饱满且大小适中菌落于SC培养基中扩培，重复将扩培后的发酵液进行离心、稀释、热激、涂布、筛选一系列循环，循环次数40次，通过检测其热激前后细胞存活率达到30％以上可完成条件初筛，得到促多巴胺成分的单一菌，随后进行保藏。
所述促多巴胺成分的单一菌在45℃条件下保温30min存活率达到50％以上。所述样品采集自种植田园土壤。
步骤S2中，样品置于生理盐水中混合均匀梯度稀释。
步骤S2中，所述筛选培养基包括多巴胺15ug/L、葡萄糖15g/L、蛋白胨 15g/L、酵母浸膏15g/L、无水乙酸钠4g/L、磷酸氢二钾1g/L、柠檬酸氢二铵 1g/L、莫匹罗星锂盐5ml/L，调节pH至6.8。
步骤S3中，所述稀释液包括氯化钠0.05g/L、酪蛋白胨0.005g/L、磷酸氢二钠0.4g/L、磷酸二氢钾0.2g/L、多巴胺0.001ug/L。
步骤S3中，所述扩培中菌株的接种量为体积百分比1％，培养温度为25℃，培养时间为12h。

Claims (7)

1.一种促多巴胺成分的单一菌的筛选方法，其特征在于：
S1、样品采集；将含放线菌的样品溶于无菌水中，55-65℃水浴处理5-10min，得到混合菌种水溶液；
S2、条件性初步筛选：样品混合均匀梯度稀释后，移液至筛选培养基上涂布分离，厌氧恒温25-45℃培养12-72h；然后挑选边缘光滑、呈乳白色隆起的菌落，反复划线镜检出菌体呈杆状、呈分叉状的革兰氏阳性菌落，反复纯化后继续厌氧恒温45℃-50℃培养30-36h；
S3、抗逆性复筛：将菌泥加入稀释液混合均匀，然后置于40-80℃恒温水浴锅进行热激，计时热激5-30min，完成热激后迅速使用冷却水降温于20℃以下，将热激后含菌稀释液进行涂布或划线进行分离，挑选其中生长饱满且大小适中菌落于SC培养基中扩培，重复将扩培后的发酵液进行离心、稀释、热激、涂布、筛选一系列循环，循环次数30-50次，通过检测其热激前后细胞存活率达到20-40％以上可完成条件初筛，得到促多巴胺成分的单一菌，随后进行保藏。
2.如权利要求1所述的促多巴胺成分的单一菌的筛选方法，其特征在于：所述促多巴胺成分的单一菌在45℃条件下保温30min存活率达到50％以上。
3.如权利要求2所述的促多巴胺成分的单一菌的筛选方法，其特征在于：所述样品采集自种植田园土壤。
4.如权利要求2所述的促多巴胺成分的单一菌的筛选方法，其特征在于：步骤S2中，样品置于生理盐水中混合均匀梯度稀释。
5.如权利要求2所述的促多巴胺成分的单一菌的筛选方法，其特征在于：步骤S2中，所述筛选培养基包括多巴胺1-20ug/L、葡萄糖10-20g/L、蛋白胨5-20g/L、酵母浸膏10-20g/L、无水乙酸钠3-5g/L、磷酸氢二钾1-3g/L、柠檬酸氢二铵1-3g/L、莫匹罗星锂盐5ml/L，调节pH至6.8。
6.如权利要求2所述的促多巴胺成分的单一菌的筛选方法，其特征在于：步骤S3中，所述稀释液包括氯化钠0.05-0.1g/L、酪蛋白胨0.005-0.01g/L、磷酸氢二钠0.4-0.8g/L、磷酸二氢钾0.2-0.4g/L、多巴胺0.001-0.02ug/L。
7.如权利要求2所述的促多巴胺成分的单一菌的筛选方法，其特征在于：步骤S3中，所述扩培中菌株的接种量为体积百分比1-10％，培养温度为25-45℃，培养时间为12-72h。
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