CN111154769B - 水稻叶片糖积累基因lsa1及其编码的蛋白和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种水稻叶片糖积累基因LSA1及其编码的蛋白和应用，与野生型相比水稻叶片糖积累基因LSA1的第365个碱基由A转换为G，并导致第122位的编码氨基酸由谷氨酸变异为甘氨酸。该基因突变后的水稻lsa1突变体，在lsa1源叶中积累大量的碳水化合物(淀粉和蔗糖)，苗期叶片呈现黄化以及早衰，并且伴随着生育期的延迟。通过杂交发现该性状为显性性状，因此能够利用此性状选育新品种和种子纯度鉴定，对水稻的遗传育种具有重要意义，可以为改善蔗糖的分配和提高水稻产量开辟新的途径。

Description

水稻叶片糖积累基因LSA1及其编码的蛋白和应用
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，涉及水稻叶片糖积累基因LSA1及其编码的蛋白和应用。
背景技术
光合产物的运输与分配对植物生长发育具有重要作用，是决定产量和品质形成的重要生理过程。糖作为一种重要的有机化合物，在体内可用于合成细胞化合物和产生能量。植物的绿色器官通过光合作用合成碳水化合物，并将其运输到各种库组织中储存，从而维持植物的生长和发育。主要的碳水化合物是蔗糖；包括水稻在内的大多数植物中的蔗糖是通过韧皮部运输的(Hayashi&Chino，1990；Thomas等，2008)。蔗糖的分配分为三个步骤：装载到源叶韧皮部，通过韧皮部进行长距离运输，以及从筛管(ST)系统卸载到非光合作用的组织或器官中(Braun等，2014)。到目前为止，新合成的蔗糖装载到韧皮部的方法有三种，包括质外体装载，共质体装载获和扩散(Rennie&Turgin，2009)。如果可供装载的蔗糖数量在某种程度上受到限制，这可能会改变源/汇关系。例如，ZmSUT1的功能是影响玉米叶片中韧皮部装载的蔗糖，所以ZmSUT1突变体在叶片中积累大量可溶性糖，导致源叶失绿和生长受到抑制(Slewinski等，2009)。类似的还有Ossac1突变体源叶片中糖和淀粉的过度积累，导致矮化表型和淡黄色叶片(zhu等，2018)。
胞间连丝(PD)促进韧皮部伴胞与筛管和周围薄壁细胞之间的连接。PD介导的共质体韧皮部的装载是水稻同化物运输的主要途径之一。PD连接相邻的植物细胞，并在大多数植物中建立细胞质和细胞膜的连续性(Eom et al.，2012；Farquharson，2015)。作为横向细胞壁通道，PD由相邻细胞之间的细胞质膜和内质网连丝微管组成(Maule，2008)。有证据表明，在PD颈部区域的胼胝质沉积减少了反式PD胞质通道的大小，从而限制了相邻细胞之间的共质体渗透性(Delmer等，1993；Zavaliev等，2011)。PD通透性的变化对蔗糖的转运有重要影响。例如，OsGSD1通过与水稻ACTIN1结合PDCB1的相互作用对PD通透性产生影响，然后在共质体途径调节光合同化物的转运中发挥作用(Gui等人，2014)。然而，调控光合同化物通过PD的共质体运输的分子机制仍然不清楚。
发明内容
有鉴于此，本发明的之一在于提供水稻叶片糖积累基因LSA1，该基因为苗期标记性状，并且对一些和产量相关的主要农艺性状有显著影响，为水稻转基因研究提供有力的工具，促进杂交稻育种研究；本发明的目的之二在于提供水稻叶片糖积累基因LSA1编码的蛋白质；本发明的目的之三在于提供水稻叶片糖积累基因LSA1的应用。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1、水稻叶片糖积累基因LSA1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2、上述水稻叶片糖积累基因LSA1编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3、上述水稻叶片糖积累基因LSA1在预测水稻叶片碳水化合物分配中的应用。
4、上述水稻叶片糖积累基因LSA1在水稻分子育种中的应用。
优选的，所述水稻品种为西农1B号。
5、抑制上述水稻叶片糖积累基因LSA1表达的抑制剂在水稻分子育种中的应用。
优选的，所述水稻品种为西农1B号。
6、一种调节水稻叶片碳水化合物分配的方法，抑制上述水稻叶片糖积累基因LSA1的表达或上述蛋白质的活性。
本发明的有益效果在于：
本发明公开了水稻叶片糖积累基因LSA1及其编码的蛋白和应用，与野生型相比水稻叶片糖积累基因LSA1的第365个碱基由A转换为G，并导致第122位的编码氨基酸由谷氨酸变异为甘氨酸。该基因突变后的水稻lsa1突变体，在lsa1源叶中积累大量的碳水化合物(淀粉和蔗糖)，苗期叶片呈现黄化以及早衰，并且伴随着生育期的延迟。通过杂交发现该性状为显性性状，因此能够利用此性状选育新品种和种子纯度鉴定，对水稻的遗传育种具有重要意义，可以为改善蔗糖的分配和提高水稻产量开辟新的途径。
本发明利用甲基磺酸乙酯(EMS)诱变西农1B号获得一个遗传稳定的水稻叶片糖积累突变体，在遗传分析和基因定位的基础上，先通过基因预测、同源搜索及基因序列差异比较，初步确定了水稻叶片糖积累由LSA1显性基因控制，LSA1基因编码一个未知功能蛋白(LOC_Os06g03380)。随后，本发明以水稻叶片糖积累突变体lsa1为材料，克隆了水稻叶片糖积累基因LSA1，具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，开放阅读框为2370bp，编码790个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。与野生型西农1B号相比，突变基因LSA1在第365碱基由A转换为G，并导致第122位的编码氨基酸序列由谷氨酸(Glu)转变为甘氨酸(Gly)。然后，将含有突变型基因LOC_Os06g03380的5980bp DNA片段转化到野生型中进行互补验证。在转基因植株中，其表型与突变体一致(图2中(B))。进一步确定水稻叶片糖积累性状由LSA1基因突变引起。
申请人通过研究发现，水稻是由于非光合作用器官(库叶)的胞间连丝通透性降低所致，同时也可能是和扩展蛋白相互作用协同调控胞间连丝的通透性从而影响库叶中糖的卸载，最终影响碳水化合物的分配。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为野生型(WT)和lsa1突变体的表型特征；
其中，(A)和(C)，野生型(左)和lsa1突变体(右)在苗期和分蘖期的植株比较。(B)和(D)，WT(左)和lsa1(右)分别对应(A)和(C)的植株叶片。(A和D)标尺＝5cm；(B)标尺＝1cm；(C)标尺＝20cm。(E，F)，野生型(WT)和lsa1突变体在苗期的碘/碘化钾染色。染色较深的lsa1叶片不仅在白天结束时(ED18：00)而且在晚上结束时(EN 6：00)比WT积累了更多的淀粉。(G，H)分别对应的是(E，F)中植株的叶片，从左到右依次是第一叶，第二叶和第三叶。(I-N)，透射电子显微镜(TEM)对WT叶和lsa1叶的细胞进行了观察，表明叶绿体被破坏并在lsa1突变体的细胞中积累了淀粉颗粒。(I和M)标尺＝2μm；(J，K和N)标尺＝500nm；(L)标尺＝5μm；(O-Q)，碳水化合物水平。(O)和(P)，WT和lsa1突变体源叶中的淀粉、蔗糖和葡萄糖含量；(Q)，WT和lsa1突变体的库叶中的蔗糖和葡萄糖含量。
图2为LSA1的图位克隆；
其中，(A)，LSA1基因的精细定位。LSA1定位在水稻6号染色体上S3和S6之间的71kb区域内；(B-D)，将突变体的LSA1基因导入WT进行互补验证；(B)，植株比较，标尺＝5cm；(C)，叶片比较，标尺＝1cm和(D)叶片的碘/碘化钾染色比较，标尺＝1cm。
图3为表达模式分析；
其中，(A)，LSA1在水稻原生质体中的亚细胞定位分析，标尺＝20μm；(B)，LSA1在烟草表皮细胞的亚细胞定位分析，标尺＝20μm；(C)，LSA1的表达模式分析；(D)，植株模式图。
图4为系统进化分析；
其中，(A)，LSA1蛋白的结构域示意图。LSA1蛋白含有四个可能的跨膜区(红框)和两个功能未知的保守结构域DUF4220和DUF594。LSA1由790个氨基酸组成；(B)，系统发育进化树分析。
图5为LSA1影响碳水化合物分配的分子机理分析
其中，(A)，LSA1截短蛋白的结构示意图；(B)，酵母中的相互作用结果；(C)，激光扫描共聚焦拍摄滴过CFDA的烟草叶片近轴面和远轴面，分别为mCherry株系(阴性对照)、LSA1E122G-mCherry株系、PDLP1-mCherry株系(阳性对照)，标尺＝200μm；(D)分别对三个株系的近轴面、远轴面荧光扩散面积进行统计，然后计算远轴面荧光扩散面积与近轴面的比值。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
本发明实施例中使用的材料：野生型水稻材料西农1B号(WT)和水稻叶片糖积累突变体lsa1，均由本实验室培育；本发明中使用的各种限制性内切酶和T4连接酶(D2011A)均购自大连TaKaRa生物工程有限公司；各种快速限制性内切酶、pEASY-Uni SeamlessCloning and Assembly重组酶及DNA Marker购自北京全式金生物技术有限公司；其他的化学试剂，如蔗糖、蛋白胨、酵母提取物、葡萄糖、氯化钙、CTAB、Tris-HCl、EDTA、氯化钠、丙烯酰胺、TEMED、琼脂粉、X-Glu主要购自于美国SIGMA公司和上海生工生物工程股份有限公司；通用型DNA纯化回收试剂盒(Universal DNA Purification Kit)，质粒提取试剂盒(TIANprep Mini Plasmid Kit)均购自天根生化科技(北京)有限公司，RNA提取试剂盒(Eastep Super总RNA提取试剂盒)和RNA反转录试剂盒(GoScript逆转录Mix,Oligo(dT))均购自美国Promega公司；实时定量PCR(SYBR Premix Dimer Eraser试剂盒)购自大连TaKaRa生物工程有限公司；引物合成和DNA测序由上海英俊生物技术有限公司完成；其它化学试剂购自北京鼎国生物技术有限责任公司；pTCK303、pAN580植物表达载体、大肠杆菌DH5α、农杆菌LBA4404在BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心购买。
实施例1、水稻叶片糖积累突变体lsa1的获得和形态学观察
利用甲基磺酸乙酯(EMS)诱变西农1B号(邢飞等."EMS诱变技术在水稻育种中的应用."南方农业6(2016):247-249.王彩芬,安永平,张文银,马静.水稻种子化学诱变剂EMS浓度筛选研究[J].宁夏农林科技(10):22-23.)，在后代突变群体中，发现一个遗传稳定的水稻叶片糖积累功能获得性(显性)突变体，经多代自交，遗传稳定，命名为leaf sucroseaccumulative1(lsa1)。
水稻叶片糖积累突变体lsa1，自苗期开始就呈现出叶片黄化并伴随早衰(图1中(A)-(D))。在早上和傍晚用分别对野生型WT和突变体lsa1脱色后，进行碘/碘化钾染色。染色结果显示，在傍晚时，WT和lsa1都积累了大量的淀粉；而早上的时候，由于WT晚上能够分解消耗白天的暂存性淀粉，所以叶片中基本没有积累淀粉，但是lsa1叶片中依然积累了大量的淀粉(图1中(E)-(H))。此外，透射电镜(TEM)观察发现，在lsa1叶片中积累了大量淀粉粒(图1中(I)-(N))。最后，在分蘖期时，对淀粉以及可溶性糖(蔗糖、葡萄糖)的含量进行了测定。结果发现，在源叶中，lsa1的淀粉及可溶性糖的含量均极显著高于WT(图1中(O)、(P))；而在库叶中，lsa1可溶性糖的含量是低于WT的(图1中(Q))。综上所述，lsa1是一个碳水化合物分配缺陷突变体。
实施例2、突变lsa1基因遗传分析与定位
以lsa1突变体为父本，籼稻品种西农1B(Xinong1B)为母本杂交获得F1代植株叶片表现为黄化，然后通过自交获得2828株F2代群体中，依据黄化叶性状分离出了突变叶片和正常叶片两种表型，分离出2135株突变单株，其余为正常株，可以看出突变株与正常株符合3：1的分离比例，表明该突变性状由一对显性单基因控制。
初步定位：采用BSA(混合分群分析)法进行。选取均匀分布于水稻12条染色体上Gramene、the Rice Genomic Research Program网站已公布的480对SSR引物，在亲本lsa1和56S间检测多态性，其中有128对引物显示多态性。选取F2代分离群体中的10株野生型和10株突变体单株叶片分别等量混合，分别提取正常池和突变池基因组DNA，用这128对引物在正常和突变基因池中进行基因连锁分析。经PCR扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染后，一般将具有母本带型的单株记为A，具有父本带型的单株记为B，具有双亲带型的单株记为H，经数据分析和作图并将重组率转化为遗传距离，筛选与基因LSA1连锁的SSR标记，发现LSA1与第6染色体短臂上RM508、RM587和RM7420连锁。用连锁标记分析136株lsa1突变体与56S杂交后的F2分离群体中的隐性突变单株，结果显示，基因LSA1与标记RM508、RM587和RM7420之间的遗传距离分别为6.43cM、8.57cM和13.57cM，位于RM508和RM587之间(图2中(A))。
精细定位：在RM508和RM587之间进一步在进一步筛选和开发标记，其中SSR标记RM19313、RM119297和SNP标记S1、S3、S6在亲本间表现多态性(RM19313、RM19297、S1、S3、S6引物序列见表1)。用这5对引物分析lsa1突变体与56S杂交后的所有F2分离群体中的693株隐性突变单株，标记S1、S3、RM19297、S6和RM19313与基因LSA1之间的重组子分别为6、1、0、3和18，S3重组子包含在S1重组子中，S6重组子包含在RM19313重组子中，表明LSA1位于标记S3和S6之间；在结合已公开的水稻基因组序列结果(http://rice.plantbiology.msu.edu/cgi-bin/gbrowse/rice/)，S3和S6之间物理距离为71.3-kb，包含10个注释基因。
表1. 5对具有多态性的SSR标记序列
Figure BDA0002377491290000061
测序分析显示，在lsa1突变体中MSU注释基因LOC_Os06g03380(http://rice.plantbiology.msu.edu/cgi-bin/gbrowse/rice/)第365个碱基由A到G的替换，导致编码的氨基酸由谷氨酸转变为甘氨酸(图2中(A))。
为了证明是否LOC_Os06g03380突变导致突变表型，我们通过将含有突变型基因LOC_Os06g03380的5923bp DNA片段转化到野生型中进行互补验证。具体方法为：以LSA1C-F：5′-TTCGAGCTCggtaccGAACTCCTGATGGATTTGCCAGTGGTTG-3′(SEQ ID NO.13)和LSA1C-R：5′-GACTCTAGAggatccCCACAAGGTTTAGTTTGCCAGATAGTCCGT-3′(SEQ ID NO.14)为引物，扩增突变型基因LOC_Os06g03380的5923bp DNA片段，扩增产物连入pCAMBIA1301载体(BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心购买)，获得互补重组表达载体，将获得的互补重组表达载体pCAMBIA1301-LOC_Os06g03380转化野生型，获得转基因植株，然后观察转基因植株的叶片性状，结果如图2所示。结果显示，转基因植株的表型与突变型一致(图2中(B)、(C))。进一步对互补植株的叶片进行碘/碘化钾染色，其染色结果与突变体一致均为深褐色(图2中(D))。即，LOC_Os06g03380基因就是LSA1基因。
实施例3、LSA1亚细胞定位及表达模式分析
为了确定LSA1蛋白的定位，分别在水稻原生质体和烟草叶片进行了瞬时表达。首先通过水稻原生质体瞬时表达系统来研究LSA1蛋白的定位。具体方法为：以LSA1pAN-F：5′-GCCtctagaATGGGCAGCGGTGGTGACT-3′(SEQ ID NO.15)和LSA1pAN-R：5′-GCCggatccAGCTAGATTTTCGACCGGGATT-3′(SEQ ID NO.16)为引物，扩增野生型基因LOC_Os06g03380的CDS片段，扩增产物连接到了35S：GFP-NOS(pAN580)表达载体(BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心购买)中，构建LSA1-GFP融合表达蛋白。然后将GFP和LSA1-GFP、内质网maker的质粒转入水稻原生质体中，28℃避光过夜孵化，用蔡司激光扫描共焦显微镜来观察GFP和RFP的荧光。其次通过烟草叶片瞬时表达系统来研究LSA1蛋白的定位。具体方法为：以LSA1pC-F：5′-AGAGAACACGGGGGACGAGCTCATGGGCAGCGGTGGTGAC-3′(SEQ ID NO.17)和LSA1pC-R：5′-GCTCACCATGTCGACTCTAGAAGCTAGATTTTCGACCGGGATT-3′(SEQ ID NO.18)为引物，扩增野生型基因LOC_Os06g03380的CDS片段，扩增产物连接到了pCAMBIA1300表达载体(BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心购买)中，构建LSA1-GFP融合表达蛋白。然后将LSA1-GFP、胞间连丝maker(PDLP1-mCherry)转入烟草叶片中，28℃暗培养48h后，用蔡司激光扫描共焦显微镜来观察GFP和RFP的荧光。
LSA1-GFP、内质网maker蛋白和单独GFP蛋白在水稻原生质体中瞬时表达后，表达LSA1-GFP融合蛋白的细胞检测到的绿色荧光可以很好的和内质网maker的红色荧光相吻合，表达GFP蛋白的细胞在整个细胞中均检测到绿色荧光。此结果暗示LSA1定位于内质网(图3中(A))。
LSA1-GFP和胞间连丝maker(PDLP1-mCherry)在烟草叶片中瞬时表达后，表达LSA1-GFP融合蛋白的细胞检测到的绿色荧光可以很好的和胞间连丝maker(PDLP1-mCherry)的红色荧光相吻合。此结果暗示LSA1定位于胞间连丝(图3中(B))。
为了确定LSA1的表达模式，利用表2的引物进行实时荧光定量分析。以UBIQUITIN为内参反应体系为：在25μL的反应体系中加入2μL的cDNA模板，2μL引物，12.5μL SYBRGreen荧光染料和8.5μL RNase-free H2O，在Bio-rad荧光定量PCR仪上进行荧光定量扩增；扩增条件为：94℃预变性2分钟；94℃变性30秒，56℃复性30秒，72℃延伸1分钟，40个循环；最后72℃延伸10分钟，然后利用CFX-Manager软件进行数据的收集与处理，结果如图3所示。由图3可知，LSA1在各组织均表达，但主要在库叶中表达(图3中(C)、(D))。
表2.引物序列
Figure BDA0002377491290000071
实施例4、LSA1编码蛋白的序列和生物信息学分析
蛋白序列在PHYTOZOME网站通过BLAST获得，使用10-5阈值(http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#！search？show＝BLAST)。利用MEGA5.0进行进化分析。进化树的构建使用最大似然法，采用Jones–Taylor–Thornton matrix-based model，Bootstrap值为500次重复。
LSA1蛋白被预测为编码未知功能蛋白。蛋白结构用PSIPRED进行预测(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)。LSA1包含两个未知功能结构域DUF4220和DUF594(图4中(A))。进化树分析表明，LSA1仅在少数禾本科植物(玉米、高粱、柳枝稷)中具有同源基因，而且这些同源基因到目前为止都未见相关报道(图4中(B))。
实施例5、LSA1调控糖积累的分子机理分析
为了揭示LSA1调控碳水化合物分配的分子机理，本研究通过泛素化系统的酵母文库筛选。筛选到了一个扩展蛋白EXPB4，接着利用酵母双杂交试验验证了这一结果。利用表3扩增LSA1基因的两个结构域和EXPB4基因的编码区，并分别连接到酵母表达载体pGBKT7(Clontech)和pGADT7(Clontech)中获得pGBKT7-LSA1(DUF4220)、pGBKT7-LSA1(DUF594)和pGADT7-EXPB4载体。将pGBKT7-LSA1(DUF4220)+pGADT7-EXPB4，pGBKT7-LSA1(DUF594)+pGADT7-EXPB4，pGBKT7-53+pGADT7-T(阳性对照)和pGBKT7-Lam+pGADT7-T(阴性对照)(Clontech公司的酵母双杂交系统自带的阳性系统和阴性系统。阳性对照是pGBKT7-53作为一个质粒编码一个小鼠p53蛋白和GAL4 DNA-BD的融合基因。阴性对照是pGBKT7-Lam编码一个人lamin C蛋白和GAL4 DNA-BD的融合基因)分别转到Y2Hgold酵母菌株中。转化株通过在SD/-Trp-Leu和SD/-Ade/-Leu/-His/-Trp平板中进行筛选(Ade为腺嘌呤硫酸盐，Leu为亮氨酸，His为组氨酸，Trp为色氨酸)。
结果显示，转入pGBKT7-LSA1(DUF4220)+pGADT7-EXPB4，pGBKT7-LSA1(DUF594)+pGADT7-EXPB4和阳性对照的Y2HGold细胞能在SD/-Ade/-Leu/-His/-Trp培养基中生长。而转入阴性对照的Y2HGold细胞不能在SD/-Ade/-Leu/-His/-Trp培养基中生长(图5中(A)、(B))。以上结果暗示LSA1的两个结构域都可以和扩展蛋白EXPB4发生相互作用。
最后，通过滴定观察的方法鉴定突变体蛋白影响了胞间连丝通透性。将突变体LSA1-mCherry、阴性对照mCherry和阳性对照PDLP1-mCherry分别在烟草叶片瞬时表达(引物见表3)。黑暗培养48h后，用2000目砂纸轻轻去除叶片正面的角质层，滴上1微升1mM的CFDA，静置5min后吸除。剪下叶片置于载玻片上，用激光扫描共聚焦显微镜观察正反面荧光染料扩散的面积。结果显示，瞬时表达了突变体LSA1E122G-mCherry的叶片和阳性对照PDLP1-mCherry类似，反面荧光扩散的面积都小于阴性对照mCherry的叶片(图5中(C))。统计发现，瞬时表达了突变体LSA1-mCherry的叶片和阳性对照PDLP1-mCherry反面扩散面积比率均极显著低于阴性对照mCherry的叶片(图5中(D))。以上结果暗示突变体蛋白影响了胞间连丝的通透性，所以导致叶片中的糖积累。
表3.引物序列
Figure BDA0002377491290000091
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 西南大学
<120> 水稻叶片糖积累基因LSA1及其编码的蛋白和应用
<130> 2019
<160> 36
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2575
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 1
ggtagctaag gtagctagca ggcgtagctt attagctaaa acccaaattc caaattaaga 60
tgggcagcgg tggtgactat gatacgtgca tagatatgat cttcgccaac tatgtccaaa 120
acctgacatc atcctatgcc aacaagagca atgagacctc cattgtggcc accttgtcca 180
tcatgttcat cctcgcctct ctcttcttca tcctcagcct cttcagccgc ttgtccgacg 240
tgagcgcggt gctcaacccc accgtccgct tgatcctctc cagctcactc tccctcttcc 300
tccccgtcat gtcctacctc ttctcggagg ccaagaacgg cgatgccacc gcgggtagtt 360
ccggccagca aacggagctc tcgttgcggg cacggacgat cctcacgtgg atgcttcttg 420
tggagctcct ccgcaacaag gtggagactg ctcttgtcag cgacactgga gcgaaaggat 480
acttgagcac cattcagcaa gctacccgcg ttgcttggca gggctacctc gtcttcttca 540
acctcaagag ctctggccag agggtagtct ttggcttctt atgggtgatc gctgcttccc 600
agctatttca gaggatcacc ataaatgagg ttctcaagtc ctcctatgcc tatggcaaga 660
acgcccaacg tctccactcc tacatggctc acatactgct acatcgtcgt cgtcaagatt 720
ccgatgaagg aggaggagga gcccagctgt tgaagctttg cgactacgcc gtgatgggag 780
aagaagagtt ggagatggag gctgggccgc cggaggacag cgagcttaat atccagaaga 840
tcatctctgc aagaaatact acggatcatg tcatcaccgt tggcaagata tggtccctgg 900
cggatgtgag agactctcct ctccagaaag accataggct caagaggctg tgcctctcct 960
ttgcactcca caagctgctg cgtcgtcgct ttgagaatct ccgcttcacc gatgcggagg 1020
ttcataactg ccgcgacctc atcttcagag gtctatgccg agacggcacg gacaaggaag 1080
ccatcgcggt tgcactgttc caagtgctaa gggacgagat acttttcgtc aatgagtact 1140
acaactctgt cctccccgtt gtgctctcaa gccccttctt cctcctagcc aactacttca 1200
tgtctcccat cctcgtattg gcattcttcc tcctcacctt cattgcttgc aacaatgggg 1260
actggtccta cgcgttgcag agtatcacga gtgacaacct acttctacat attggcatca 1320
tcaagacggt taaatgcctt ttccactaca ttagtacacc gccagcactc tacaccacgg 1380
tggaccttgc catcaccttt cttctagtgc tggctaacat ctatgaggag atttgggaat 1440
tcattgtctg catcctctct aactggttca tggtgtcttt gatccacctc tacgctagga 1500
acccacagag gagccgtcta agccccactt tcaaggccat catccggagg atcatatggg 1560
ttcggaacct aatgagccaa cctaggctcc agttcaacca gttgtccatg ctaggaggag 1620
gttttctccc ttgccgtcat cctttcttgc tgcaacccaa gattgtaccc aaggaggtga 1680
agaagtccat catggagtat ctgatgaacc acattgacgg ccatgcccca ctaagcaacg 1740
gatggtccac gatgcaagca aactaccccg agtaccactc taagctctca tggatgtgcc 1800
acaacgacaa cgtcacggag gtgatgctca cttggcacat cgccaccacc atattggagg 1860
ccaaattccc caagcagaca ggagcaacag cttcttctca agctcaccgc acggtggcga 1920
cgacactgtc caagtactgc gcatacctgg tggccttcaa gccagagcta ctccccagca 1980
acctagatgg gacacagaaa atgtatggag ccctgaagaa ggagctgaag gcgacactcg 2040
gatgctggcg ttactgcttc ccaaaggaga ttgtgggacg acgagttgca gtcgagaaat 2100
tgatgcaaga agaatcccaa gggaagctag aggggaagat gccattgatg tgcaagggtg 2160
ccagggctgg aaggattctc ttcgagaagg ctacgctcgt cgacaacgag gagcccgtgt 2220
gggaggtact ggctcacatc tggacggagc tcattgtgtt catagcgcca tcaggcgacg 2280
atgaggtgca ggtcaaggca catagggatg cattggggca agatgctggg gagttcatct 2340
ctgtgctctg ggcactcact acgcatacag gtgtgacacg cccgtgcgtt aagccgtggg 2400
cattaatccc ggtcgaaaat ctagcttgac gccaaggaca ccggccggcc tgtttgattt 2460
attggtttgg tttatgctag ctttaaccag aaatattgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg 2520
tgtgtgttta tatgttggat tgcttgtttc ttcataagta aagtttggtc attgc 2575
<210> 2
<211> 789
<212> PRT
<213> Artificial
<400> 2
Met Gly Ser Gly Gly Asp Tyr Asp Thr Cys Ile Asp Met Ile Phe Ala
1 5 10 15
Asn Tyr Val Gln Asn Leu Thr Ser Ser Tyr Ala Asn Lys Ser Asn Glu
20 25 30
Thr Ser Ile Val Ala Thr Leu Ser Ile Met Phe Ile Leu Ala Ser Leu
35 40 45
Phe Phe Ile Leu Ser Leu Phe Ser Arg Leu Ser Asp Val Ser Ala Val
50 55 60
Leu Asn Pro Thr Val Arg Leu Ile Leu Ser Ser Ser Leu Ser Leu Phe
65 70 75 80
Leu Pro Val Met Ser Tyr Leu Phe Ser Glu Ala Lys Asn Gly Asp Ala
85 90 95
Thr Ala Gly Ser Ser Gly Gln Gln Thr Glu Leu Ser Leu Arg Ala Arg
100 105 110
Thr Ile Leu Thr Trp Met Leu Leu Val Glu Leu Leu Arg Asn Lys Val
115 120 125
Glu Thr Ala Leu Val Ser Asp Thr Gly Ala Lys Gly Tyr Leu Ser Thr
130 135 140
Ile Gln Gln Ala Thr Arg Val Ala Trp Gln Gly Tyr Leu Val Phe Phe
145 150 155 160
Asn Leu Lys Ser Ser Gly Gln Arg Val Val Phe Gly Phe Leu Trp Val
165 170 175
Ile Ala Ala Ser Gln Leu Phe Gln Arg Ile Thr Ile Asn Glu Val Leu
180 185 190
Lys Ser Ser Tyr Ala Tyr Gly Lys Asn Ala Gln Arg Leu His Ser Tyr
195 200 205
Met Ala His Ile Leu Leu His Arg Arg Arg Gln Asp Ser Asp Glu Gly
210 215 220
Gly Gly Gly Ala Gln Leu Leu Lys Leu Cys Asp Tyr Ala Val Met Gly
225 230 235 240
Glu Glu Glu Leu Glu Met Glu Ala Gly Pro Pro Glu Asp Ser Glu Leu
245 250 255
Asn Ile Gln Lys Ile Ile Ser Ala Arg Asn Thr Thr Asp His Val Ile
260 265 270
Thr Val Gly Lys Ile Trp Ser Leu Ala Asp Val Arg Asp Ser Pro Leu
275 280 285
Gln Lys Asp His Arg Leu Lys Arg Leu Cys Leu Ser Phe Ala Leu His
290 295 300
Lys Leu Leu Arg Arg Arg Phe Glu Asn Leu Arg Phe Thr Asp Ala Glu
305 310 315 320
Val His Asn Cys Arg Asp Leu Ile Phe Arg Gly Leu Cys Arg Asp Gly
325 330 335
Thr Asp Lys Glu Ala Ile Ala Val Ala Leu Phe Gln Val Leu Arg Asp
340 345 350
Glu Ile Leu Phe Val Asn Glu Tyr Tyr Asn Ser Val Leu Pro Val Val
355 360 365
Leu Ser Ser Pro Phe Phe Leu Leu Ala Asn Tyr Phe Met Ser Pro Ile
370 375 380
Leu Val Leu Ala Phe Phe Leu Leu Thr Phe Ile Ala Cys Asn Asn Gly
385 390 395 400
Asp Trp Ser Tyr Ala Leu Gln Ser Ile Thr Ser Asp Asn Leu Leu Leu
405 410 415
His Ile Gly Ile Ile Lys Thr Val Lys Cys Leu Phe His Tyr Ile Ser
420 425 430
Thr Pro Pro Ala Leu Tyr Thr Thr Val Asp Leu Ala Ile Thr Phe Leu
435 440 445
Leu Val Leu Ala Asn Ile Tyr Glu Glu Ile Trp Glu Phe Ile Val Cys
450 455 460
Ile Leu Ser Asn Trp Phe Met Val Ser Leu Ile His Leu Tyr Ala Arg
465 470 475 480
Asn Pro Gln Arg Ser Arg Leu Ser Pro Thr Phe Lys Ala Ile Ile Arg
485 490 495
Arg Ile Ile Trp Val Arg Asn Leu Met Ser Gln Pro Arg Leu Gln Phe
500 505 510
Asn Gln Leu Ser Met Leu Gly Gly Gly Phe Leu Pro Cys Arg His Pro
515 520 525
Phe Leu Leu Gln Pro Lys Ile Val Pro Lys Glu Val Lys Lys Ser Ile
530 535 540
Met Glu Tyr Leu Met Asn His Ile Asp Gly His Ala Pro Leu Ser Asn
545 550 555 560
Gly Trp Ser Thr Met Gln Ala Asn Tyr Pro Glu Tyr His Ser Lys Leu
565 570 575
Ser Trp Met Cys His Asn Asp Asn Val Thr Glu Val Met Leu Thr Trp
580 585 590
His Ile Ala Thr Thr Ile Leu Glu Ala Lys Phe Pro Lys Gln Thr Gly
595 600 605
Ala Thr Ala Ser Ser Gln Ala His Arg Thr Val Ala Thr Thr Leu Ser
610 615 620
Lys Tyr Cys Ala Tyr Leu Val Ala Phe Lys Pro Glu Leu Leu Pro Ser
625 630 635 640
Asn Leu Asp Gly Thr Gln Lys Met Tyr Gly Ala Leu Lys Lys Glu Leu
645 650 655
Lys Ala Thr Leu Gly Cys Trp Arg Tyr Cys Phe Pro Lys Glu Ile Val
660 665 670
Gly Arg Arg Val Ala Val Glu Lys Leu Met Gln Glu Glu Ser Gln Gly
675 680 685
Lys Leu Glu Gly Lys Met Pro Leu Met Cys Lys Gly Ala Arg Ala Gly
690 695 700
Arg Ile Leu Phe Glu Lys Ala Thr Leu Val Asp Asn Glu Glu Pro Val
705 710 715 720
Trp Glu Val Leu Ala His Ile Trp Thr Glu Leu Ile Val Phe Ile Ala
725 730 735
Pro Ser Gly Asp Asp Glu Val Gln Val Lys Ala His Arg Asp Ala Leu
740 745 750
Gly Gln Asp Ala Gly Glu Phe Ile Ser Val Leu Trp Ala Leu Thr Thr
755 760 765
His Thr Gly Val Thr Arg Pro Cys Val Lys Pro Trp Ala Leu Ile Pro
770 775 780
Val Glu Asn Leu Ala
785
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 3
aaacaaagta ttgaaaagta ttgaatc 27
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 4
ttgattttag ggttttttca tc 22
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 5
attgtcacct ttgcatgagc ac 22
<210> 6
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 6
ggtatatttc ggtataacaa ctcttaa 27
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 7
atttgctccg cttccaaatc acc 23
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 8
agcggccaac agagacaact gg 22
<210> 9
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 9
atcattctac ctctctcaat tacaggg 27
<210> 10
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 10
tccatctatt gtacaaaaca tatatgc 27
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 11
tgccatctca taaacccact aacc 24
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 12
ctgagatacg ccaacgagat acc 23
<210> 13
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 13
ttcgagctcg gtaccgaact cctgatggat ttgccagtgg ttg 43
<210> 14
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 14
gactctagag gatccccaca aggtttagtt tgccagatag tccgt 45
<210> 15
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 15
gcctctagaa tgggcagcgg tggtgact 28
<210> 16
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 16
gccggatcca gctagatttt cgaccgggat t 31
<210> 17
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 17
agagaacacg ggggacgagc tcatgggcag cggtggtgac 40
<210> 18
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 18
gctcaccatg tcgactctag aagctagatt ttcgaccggg att 43
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 19
accacttcga ccgccactac t 21
<210> 20
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 20
acgcctaagc ctgctggtt 19
<210> 21
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 21
ctctcgttgc gggcacgg 18
<210> 22
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 22
gaagccaaag actaccctct ggcc 24
<210> 23
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 23
atatggccat ggaggccgaa ttcattcagc aagctacccg cg 42
<210> 24
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 24
gccgctgcag gtcgacggat ccttggctca ttaggttccg aacc 44
<210> 25
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 25
atatggccat ggaggccgaa ttcgacaacg aggagcccgt gtg 43
<210> 26
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 26
gccgctgcag gtcgacggat ccagctagat tttcgaccgg gatt 44
<210> 27
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 27
atggccatgg aggccagtga attcatgggc tcgctgtcct ctctcg 46
<210> 28
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 28
ctgcagctcg agctcgatgg atccgctgta ctggacgaag gagcggt 47
<210> 29
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 29
agagaacacg ggggactcta gaatgggcag cggtggtgac t 41
<210> 30
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 30
ctcgcccttg ctcaccatag ctagattttc gaccgggatt 40
<210> 31
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 31
aatcccggtc gaaaatctag ctatggtgag caagggcgag 40
<210> 32
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 32
tcggggaaat tcgggggatc ccagcttcga tctcttgtac agctcg 46
<210> 33
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 33
agagaacacg ggggactcta gaatgaaact cacctatcaa ttcttc 46
<210> 34
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 34
ctcgcccttg ctcaccatat aagcatcata tttattactc ttc 43
<210> 35
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 35
aataaatatg atgcttatat ggtgagcaag ggcgaggag 39
<210> 36
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 36
tcggggaaat tcgggggatc ccagcttcga tctcttgtac agctcg 46

Claims (2)

1.水稻叶片糖积累基因LSA1在水稻叶片碳水化合物分配中的应用，其中，水稻叶片糖积累基因LSA1编码的蛋白质，该蛋白质的氨基酸序列为在SEQ ID NO.2所示的基础上，该蛋白质的氨基酸序列中，第122位的谷氨酸突变为甘氨酸。
2.一种调节水稻叶片碳水化合物分配的方法，抑制水稻叶片糖积累基因LSA1的表达或水稻叶片糖积累基因LSA1编码的蛋白质的活性，其中，水稻叶片糖积累基因LSA1编码的蛋白质，该蛋白质的氨基酸序列为在SEQ ID NO.2所示的基础上，该蛋白质的氨基酸序列中，第122位的谷氨酸突变为甘氨酸。
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