CN111150847A - Trpa1的抑制剂在制备治疗炎症药物中的应用 - Google Patents

Trpa1的抑制剂在制备治疗炎症药物中的应用 Download PDF

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刘雨杰
汤凤
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Abstract

本发明公开了TRPA1的抑制剂在制备治疗炎症药物中的应用。本发明通过建立基于THP‑1来源巨噬细胞的细胞炎症模型，探究TRPA1与P2X7间的相互作用以及TRPA1参与ATP诱导的炎症反应。研究结果表明，TRPA1能够与P2X7间相互作用，TRPA1参与ATP或BzATP引起的THP‑1来源巨噬细胞钙离子内流，线粒体活性氧产生，线粒体膜电位降低，线粒体损伤，caspase‑1活化，IL‑1β的分泌，细胞活性降低以及细胞毒性增加。TRPA1的抑制剂对细胞质及线粒体的钙离子内流具有显著抑制作用，能显著抑制线粒体活性氧的生成，明显抑制线粒体膜电位降低的趋势，明显抑制线粒体损伤发生，显著抑制caspase‑1的活化和IL‑1β的分泌，能明显抑制巨噬细胞活性降低。因此可以使用TRPA1的抑制剂来治疗ATP诱导的炎症反应。

Description

TRPA1的抑制剂在制备治疗炎症药物中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及TRPA1的抑制剂在制备治疗炎症药物中的应用。
背景技术
腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)是动植物细胞线粒体内产生的重要能量物质，其能直接被细胞利用并为细胞提供代谢能量。当机体能量代谢发生紊乱或组织遭受损伤时，细胞膜发生破损，ATP从细胞内释放并进入血液。这些游离的ATP可作为信号分子，诱导免疫反应发生，促进巨噬细胞产生炎症发炎。有文献报道，当动脉粥样硬化或高血压发生时，机体血液中的ATP含量明显升高，当向疾病模型小鼠注射ATP时，会增加它们的疾病程度，这说明ATP可作为诱发动脉粥样硬化及高血压的重要刺激因素。ATP在细胞膜上的受体通常认为是嘌呤类受体家族(P2 receptor family)包括P2X及P2Y两大类，其中P2X是离子通道类受体，而P2Y则是G蛋白偶联受体(GPCR)。在炎症反应中，P2X7离子通道受体被发现广泛参与炎症反应，包括炎症因子IL-1β，IL-18的分泌以及细胞焦亡。同时，P2X7还促进单核细胞的迁移，从而促使动脉粥样硬化的发生。巨噬细胞是一类介导天然免疫反应的免疫细胞，其由单核细胞分化而来。当机体遭受病原微生物等外源物质刺激时，巨噬细胞会大量增殖，吞噬病原菌并呈递抗原并激活细胞免疫反应。同时，巨噬细胞还会分泌大量炎症因子，以引起更为广泛的炎症反应。
ATP是P2X7的重要刺激物，当ATP与P2X7结合后，P2X7介导钙离子内流，促使线粒体损伤以及线粒体活性氧的生成。同时，经脂多糖(LPS)诱导NLRP3炎症小体以及caspase-1和IL-1β前体转录翻译后，当巨噬细胞接受来自P2X7的信号时，NLRP3被激活并切割caspase-1和IL-1β前体，生成有活性的caspase-1和IL-1β。瞬时受体电位锚蛋白离子通道1(TRPA1)是瞬时受体电位超家族(TRP)的成员之一，其是一种非选择性阳离子通道，可以介导钙离子及钠离子内流。作为外源信号受体，TRPA1可以感受外界多种刺激物的刺激，包括活性氧，硫化氢等。
发明内容
本发明的目的是提供TRPA1的抑制剂在制备治疗炎症药物中的应用。
本发明通过免疫荧光检测P2X7及TRPA1在THP-1来源的巨噬细胞以及瞬时转染大鼠P2X7以及TRPA1质粒的HEK293T细胞株上的共定位；活细胞钙成像检测TRPA1参与介导P2X7激动剂BzATP诱导下的钙离子变化；进一步抑制TRPA1后发现，TRPA1的抑制剂对细胞质及线粒体的钙离子内流具有显著抑制作用，能显著抑制线粒体活性氧的生成，明显抑制线粒体膜电位降低的趋势，明显抑制线粒体损伤发生，显著抑制caspase-1的活化和IL-1β的分泌，能明显抑制巨噬细胞活性降低。推测ATP刺激P2X7，胞外钾离子水平升高，促进TRPA1通道开放，介导钙离子内流，从而引起线粒体活性氧产生，线粒体损伤增加，从而引起巨噬细胞产生炎症反应并促使其凋亡，从而造成相应的疾病产生。这些结果表明TRPA1在ATP诱导的炎症反应及相关疾病中具有重要作用，可作为治疗ATP引起的相关疾病的潜在靶标。
因此，本发明的第一个目的是提供TRPA1的抑制剂在制备治疗炎症药物中的应用。
本发明的第二个目的是提供一种治疗炎症药物，其包含TRPA1的抑制剂作为活性成分。
所述的治疗炎症药物是治疗ATP引起的炎症的药物。
所述的TRPA1的抑制剂为A967079、HC030031或AP-18。
本发明通过建立基于THP-1来源巨噬细胞的细胞炎症模型，探究TRPA1与P2X7间的相互作用以及TRPA1参与ATP诱导的炎症反应。研究结果表明，TRPA1能够与P2X7间相互作用，TRPA1参与ATP或BzATP引起的THP-1来源巨噬细胞钙离子内流，线粒体活性氧产生，线粒体膜电位降低，线粒体损伤，caspase-1活化，IL-1β的分泌，细胞活性降低以及细胞毒性增加。TRPA1的抑制剂对细胞质及线粒体的钙离子内流具有显著抑制作用，能显著抑制线粒体活性氧的生成，明显抑制线粒体膜电位降低的趋势，明显抑制线粒体损伤发生，显著抑制caspase-1的活化和IL-1β的分泌，能明显抑制巨噬细胞活性降低。因此可以使用TRPA1的抑制剂来治疗ATP诱导的炎症反应。
附图说明
图1A为TRPA1和P2X7在THP-1来源巨噬细胞上的共定位；图1B为对灰度图进行分析，TRPA1和P2X7在THP-1来源巨噬细胞上具有很好的共定位结果；图1C为TRPA1和P2X7在瞬时转染HEK293T细胞株上的共定位；图1D为TRPA1和P2X7在THP-1来源巨噬细胞上的三位共定位图；
图2A为TRPA1参与调控ATP诱导的胞质及线粒体钙离子内流；图2B为BzATP可显著促进胞质钙离子内流，阻断TRPA1能抑制胞质钙离子的增加；图2C为BzATP可显著促进线粒体钙离子内流，阻断TRPA1能抑制线粒体钙离子的增加；图2D为BzATP促进胞质钙离子内流及TRPA1阻断胞质钙离子内流的结果具有显著性(****p<0.0001)；图2E为BzATP促进线粒体钙离子内流及TRPA1阻断线粒体钙离子内流的结果具有显著性(****p<0.0001)；
图3A为TRPA1参与调控ATP诱导的THP-1来源巨噬细胞产生线粒体活性氧；图3B为ATP可显著促进THP-1来源的巨噬细胞产生线粒体活性氧，阻断TRPA1可显著抑制线粒体活性氧的产生(****p<0.0001)；
图4A为TRPA1参与调控BzATP诱导的THP-1来源巨噬细胞线粒体膜电位降低；图4B为BzATP可显著促进THP-1来源的巨噬细胞线粒体膜电位降低，阻断TRPA1可显著抑制线粒体膜电位降低的产生(**p<0.01，***p<0.001)；图4C为ATP促进线粒体膜电位降低的过程随刺激时间的增加而增强，阻断TRPA1可抑制这一过程；
图5为ATP可促进线粒体损伤并造成线粒体形态发生改变，阻断TRPA1可抑制ATP引起的线粒体损伤；
图6A为TRPA1参与调控ATP诱导的IL-1β的分泌(*p<0.05)；图6B为TRPA1参与调控BzATP诱导的IL-1β的分泌(**p<0.01)；图6C为TRPA1参与调控ATP诱导的caspase-1的活化以及IL-1β的分泌；
图7A为TRPA1参与调控ATP诱导的THP-1来源巨噬细胞活性的降低(*p<0.05，#p<0.05，##p<0.01；*versus ATP，#versus control group；NC表示no significance)；图7B为TRPA1参与调控BzATP诱导的THP-1来源巨噬细胞毒性增强(****p<0.0001)。
具体实施方式
下面结合具体实施方案对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
实施例1：TRPA1调控ATP诱导的THP-1来源巨噬细胞产生炎症反应
目的：本研究将通过建立THP-1来源巨噬细胞体外炎症细胞模型，探讨TRPA1与P2X7的相互作用以及TRPA1调控的ATP诱导钙离子内流，线粒体活性氧产生，线粒体损伤，炎症因子分泌以及细胞毒性变化，从而阐明TRPA1调控ATP诱导的THP-1来源巨噬细胞炎症反应的作用机制。
1材料
1.1主要的仪器和试剂
Figure BDA0002375011270000051
Figure BDA0002375011270000052
Figure BDA0002375011270000061
Figure BDA0002375011270000071
Figure BDA0002375011270000081
1.2主要细胞来源
人急性白血病单核细胞系(THP-1)，中国科学院广州生物医药与健康研究院李鹏实验室馈赠，也可以从商业公司购买到。
人胚胎肾细胞293T细胞系(HEK293T)，中国科学院广州生物医药与健康研究院再生医学重点实验室馈赠，也可以从商业公司购买到。
1.3主要质粒来源
大鼠P2X7质粒，中国科学院广州生物医药与健康研究院再生医学重点实验室馈赠，也可以从BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心购买到P2X7质粒。
大鼠TRPA1质粒，中国科学院上海药物研究所高召兵实验室馈赠，也可以从武汉淼灵生物科技有限公司购买到TRPA1质粒。
2方法
2.1THP-1细胞培养及巨噬细胞分化步骤
将THP-1细胞培养于含10％胎牛血清及2mM谷氨酰胺的RPMI 1640培养基中过夜，然后加入100nM佛波脂(PMA)处理48小时。当THP-1分化为巨噬细胞后，用PBS润洗3次，将培养基更换为含10％胎牛血清的DMEM完全培养基，进行后续实验。
2.2HEK293T细胞培养及转染
将HEK293T细胞培养于含10％胎牛血清的DMEM完全培养基中，待细胞汇合度达到65％时，将大鼠P2X7和大鼠TRPA1质粒同时瞬时转染HEK293T细胞，培养48小时后，进行后续实验。
2.3HEK293T细胞系胞质蛋白免疫荧光检测
1在24孔板中放入一片经多聚赖氨酸处理过的圆形爬片，用于细胞爬片，细胞量为7x105个。
2用PBS润洗5min。加入100μl 4％多聚甲醛，室温固定细胞20min。
3用PBS润洗3次，每次3min。加入0.5％TritonX-100(用PBS稀释)透膜5min。
4用PBS润洗3次，每次3min。加入10％的山羊血清(含0.5％TritonX-100)室温封闭30min。
5本实验所配置一抗为Rabbit anti-TRPA1(1:200)和Mouse anti-P2X7(1:50)，每孔加入200μl。于4℃孵育过夜。
6用PBS润洗3次，每次3min。用Alexa Fluor 488羊抗兔IgG(1:100)及Alexa Fluor594小鼠抗兔IgG(1:100)室温避光孵育1小时。
7去除二抗，加入500μl DAPI室温避光孵育5min。
8用PBS润洗3次，每次3min。从孔板中小心取出爬片，吸去液体，并置于载玻片上，用抗淬灭剂封片，共聚焦显微镜下观察。
2.4THP-1来源巨噬细胞胞膜蛋白免疫荧光检测
1将细胞接种于4格35mm共聚焦底皿中，细胞量为3x105个。
2用无血清的DMEM培养基润洗两次，用无血清DMEM培养基配置一抗Rabbit anti-TRPA1(1:200)和Mouse anti-P2X7(1:50)，于4℃孵育30min。
3用无血清的DMEM培养基润洗三次，用4％多聚甲醛于室温固定15min。
4PBS洗五遍后，用10％山羊血清于室温封闭45min。
5用1％山羊血清润洗1遍后，用Alexa Fluor 488羊抗兔IgG(1:100)及AlexaFluor 594小鼠抗兔IgG(1:100)避光室温孵育1h。
6用PBS润洗五次后，用抗淬灭剂封片，共聚焦显微镜下观察。
2.5钙离子成像检测
1将THP-1来源巨噬细胞接种于4格35mm共聚焦底皿中，细胞量为3x105个。
2用无钙D-Hank’s溶液润洗3次后，细胞同时在含2.5μM Fluo 4-AM及2.5μM Rhod2-AM的溶液中于37℃孵育40min。
3用无钙D-Hank’s溶液润洗3次后，将细胞孵育于含钙Hank’s溶液中30min，于共聚焦显微镜观察。
4配置100μM BzATP或分别将100μM BzATP与10μM A967079,10μM AP-18and 10μMA740003混合。
5先用共聚焦显微镜在不加激动剂时记录30s，再加入激动剂记录3min，每隔1s记录一次。图片用图像软件ImageJ处理。
2.6线粒体活性氧(mtROS)检测
1将THP-1来源巨噬细胞接种于4格35mm共聚焦底皿中，细胞量为3x105个。
2用100ng/mL脂多糖(LPS)处理18h，PBS润洗3次后，先加入10μM A967079,10μMHC030031或10μM A438079孵育30min，再加入5mM ATP孵育1h 20min。
3添加2.5μM mitoSOX于37℃孵育10min，用含钙Hank’s溶液润洗3次。
4细胞用Hoechst 33342溶液于37℃孵育30min，用PBS润洗3次，于共聚焦显微镜观察。图片使用图像软件ImageJ处理。
2.7JC-1检测线粒体膜电位
1将THP-1来源巨噬细胞接种于4格35mm共聚焦底皿中，细胞量为3x105个。
2用1mg/mL脂多糖(LPS)处理17h，PBS润洗3次后，先将10μM A740003小分子抑制剂,10μM HC030031小分子化合物或130mM KCl 100μM分别与BzATP孵育1h 30min。
3加入JC-1染料于细胞培养基中，于37℃孵育15min，用含钙Hank’s溶液润洗3次，于荧光显微镜观察。图片使用图像软件ImageJ处理。
2.8TMRM检测线粒体膜电位
1将THP-1来源巨噬细胞接种于4格35mm共聚焦底皿中，细胞量为3x105个。
2用100ng/mL脂多糖(LPS)处理8h，PBS润洗3次后，加入30nM TMRM于37℃孵育30min，用含钙Hank’s溶液润洗2次，同共聚焦显微镜进行活细胞观察。先在不加激动剂条件下记录30s的荧光变化，再加入5mM ATP或加入5mM ATP和10μM A967079(CAS No.:1170613-55-4)混合物记录19min 30s的荧光变化。
2.9流式细胞术
1将THP-1来源巨噬细胞接种于6孔板中，细胞量为1x106个。
2用100ng/mL脂多糖(LPS)处理14h，PBS润洗3次后，先加入10μM A967079,10μMHC030031(CAS No.:349085-38-7)或10μM A438079(CAS No.:899431-18-6)孵育30min，再加入5mM ATP孵育2h。
3用Accutase酶于37℃消化10min，离心收集细胞，用50nM MitoTracker Deep Red和50nM MitoTracker Green于室温避光处理15min，PBS润洗一遍后，用流式细胞仪检测。
2.10ELISA
1将THP-1分化巨噬细胞培养在96孔板中，细胞量为1x105个，培养基为含10％血清的DMEM完全培养基100μl，加入100ng/mL或1mg/mL LPS于培养基中于37℃孵育14到17h。PBS漂洗3次后，将培养基换为150μl不含FBS的DMEM完全培养基。对照组添加DMSO，实验组各组先加入5μM或10μM A967079，10μM AP-18(CAS No.:55224-94-7)培养30min，再加入100μMBzATP培养2h 30min或5mM ATP培养1小时。
2离心机300g/min离心10min。
3将ELISA所需试剂置于室温平衡。
4制作IL-1β标准曲线。将IL-1β标准品溶液以1:1的比例依次稀释6次，每次均需充分混匀。其浓度依次为250、125、62.5、31.25、15.63、7.81及3.91pg/mL，将不含血清的DMEM完全培养基设为标准曲线的基点。
5用1x洗液浸泡酶标板30sec，在吸水纸上拍干。
6加入IL-1β标准品溶液100μl，将100μl不含血清的DMEM完全培养基加入空白对照孔。
7向样本孔每孔加入100μl细胞上清。
8向各孔加入50μl 1:100稀释的IL-1β抗体。用封板膜封板，微孔板震荡仪振荡，室温震荡孵育2小时。
9加入300μl 1x洗液洗板6次，每次静置30s，然后用吸水纸拍干。
10向各孔加入100μl 1:100稀释的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，用新封板膜封板，微孔板震荡仪振荡，室温震荡孵育45min。
11重复步骤9。
12向各孔加入显色底物TMB 100μl，室温避光孵育30min。
13向各孔加入终止液终止反应。
14用多功能酶标仪分别测定450nm和570nm(参考波长)的吸光度值。各组OD值为450nm吸光度值减去570nm吸光度值再减去空白对照组中的OD值，通过标准曲线计算各组数值。
2.11THP-1来源巨噬细胞膜蛋白提取
1将THP-1来源巨噬细胞接种于6孔板中，细胞量为1x106个。
2用100ng/mL脂多糖(LPS)处理14h，PBS润洗3次后，先加入10μM A967079,10μMHC030031或10μM A438079孵育30min，再加入5mM ATP孵育2h。
3离心机400g/min离心5min，取一定体积细胞上清，加入相同体积无水甲醇以及一半体积三氯甲烷，充分混匀，于冰上静置5min。
4离心机21000g/min 4℃离心10min，液体分层，移去上层液体，将下层液体与甲醇混匀，提及同步骤3。
5离心机21000g/min 4℃离心15min，移去上清，将底物于空气中室温干燥15min。
6将得到的沉淀用细胞膜蛋白提取液重悬，-20℃保存，用于后续实验。
2.12THP-1来源巨噬细胞总蛋白提取
1将细胞接种于6孔板中，细胞量为1x106。
2用100ng/mL脂多糖(LPS)处理14h，PBS润洗3次后，先加入10μM A967079,10μMHC030031或10μM A438079孵育30min，再加入5mM ATP孵育2h。
3离心机400g/min离心5min，去上清，用PBS润洗一次，每孔加入150μl RIPA及1x蛋白酶抑制剂混合物于冰上裂解细胞30min，每10min振荡一次。
4离心机21000g/min 4℃离心15min，取上清，-20℃保存，用于后续实验。
2.13BCA法测定蛋白浓度
1将实验2.11及2.12的细胞上清及裂解液蛋白用蒸馏水稀释5倍，将BCA蛋白定量试剂盒中的A液和B液按50:1混匀。
2取100μl混合液及20μl稀释后的蛋白裂解液混匀，配置标准曲线，37℃孵育30min，用酶标仪测定吸光度值，按照标准曲线计算蛋白浓度。
2.14Western blot
1配置电泳缓冲液和转膜缓冲液，成分如下：
Figure BDA0002375011270000141
5x电泳缓冲液定容至1L后，于4℃保存。
Figure BDA0002375011270000142
Figure BDA0002375011270000151
2配置分离胶(5mL)。配胶所需的10％过硫酸铵应新鲜配制，成分如下：
Figure BDA0002375011270000152
Figure BDA0002375011270000153
搅拌混匀后，立即加入玻璃板中，1mm厚的玻璃板大约加入3mL分离胶。在分离胶上再加入超纯水用于排除气泡。
3大约30min后，分离胶凝固，再配置浓缩胶(2mL)，成分如下：
Figure BDA0002375011270000154
搅拌混匀，倒掉分离胶上的超纯水，用滤纸吸干，再加入浓缩胶直至整个玻璃板被填满。插上梳子，静置30分钟，待浓缩胶凝固后便可上样电泳。
4将玻璃板固定于支架上，向电泳槽及玻璃板加入1x电泳缓冲液并拔下梳子，分别加入5μl蛋白marker以及18μl样品。空孔需补加一定量上样缓冲液，以防止蛋白条带不整齐。
5设置电泳仪电压值70V并电泳70min，当溴酚蓝条带移动到分离胶与浓缩胶交界处时，将电压转变为100V，再电泳40min左右，当溴酚蓝条带接近玻璃板底部时，即可终止电泳。
6转膜。在转膜夹上，以黑色面朝下，依次铺海绵及三层滤纸，浸泡于转膜液中。剪取比分离胶稍大的PVDF膜，先浸于无水甲醇约1min，再浸于转膜液中数分钟。
7取下电泳后的玻璃板，切除浓缩胶部分，仅保留分离胶。短暂浸泡转膜液后，置于转膜夹的滤纸上，并将PVDF膜覆盖其上，注意胶与膜间不能有气泡，并用转膜液保持湿润。在PVDF膜上再覆盖三层滤纸及海绵，夹紧转膜夹，插入转膜槽，添加转膜液。将转膜槽周围添加冰块用于散热。
8设置电泳仪电压为90V，转膜50min。
9封闭。配制0.5％脱脂奶粉，摇匀。取出转膜槽中的PVDF膜，加入0.5％脱脂牛奶，于摇床上室温慢摇1h。
10孵育一抗。将封闭完的PVDF膜，按目的蛋白大小，剪取含目的蛋白的PVDF膜，孵育一抗。本实验的目的蛋白为caspase-1和IL-1β的前体和活化的剪切体以及内参蛋白α-Tubulin。一抗由抗体稀释液稀释。本实验所用抗体如下：
Figure BDA0002375011270000161
Figure BDA0002375011270000171
PVDF膜于摇床上4℃孵育过夜。
11孵育二抗。将PVDF膜用PBST(PBS+Tween-20)润洗三次，每次震荡10min。用封闭液稀释二抗，本实验所用二抗为goat anti-rabbit IgG，稀释比例为1:1000。加入二抗，摇晃均匀，室温震荡1h。
12孵育二抗结束后，用PBST再次润洗膜三次，每次10min。用超纯水浸润PVDF膜5min。
13配置ECL化学发光液。将PVDF置于化学发光成像仪中，在PVDF膜上均匀滴加配置好的ECL发光液，反应1min，拍摄图片。
2.15CCK-8细胞活性检测
1将THP-1分化巨噬细胞培养在96孔板中，细胞量为1x105，培养基为含10％血清的DMEM完全培养基100μl，加入100ng/mL LPS于培养基中于37℃孵育16h。PBS漂洗3次后，将培养基换为150μl不含FBS的DMEM完全培养基。实验组各组先加入1μM至5μM A967079培养30min，再加入5mM ATP培养2小时或仅加入100μM至5mM ATP培养2小时。
2向各孔加入10μl CCK-8试剂，于37℃处理3h，酶标仪测定吸光度值。
2.16LDH细胞毒性检测
1将THP-1分化巨噬细胞培养在96孔板中，细胞量为8x104，培养基为含10％血清的DMEM完全培养基100μl，加入100ng/mL LPS于培养基中于37℃孵育16h。PBS漂洗3次后，将培养基换为150μl不含FBS的DMEM完全培养基。实验组各组先加入10μM A740003(CAS No.:861393-28-4)，10μM MCC950(CAS No.:210826-40-7)，10μM mitoTEMPO(CAS No.:1334850-99-5)或10μM HC030031培养30min，再加入100μM BzATP培养1h 30min。
2离心机400g/min离心5min，每孔取120μl上清加入一新的96孔板中，每孔加入60μl LDH检测溶液，混匀后室温处理30min，酶标仪检测吸光度值。
2.17统计学处理
本研究使用GraphPad Prism 8软件对数据进行统计分析及作图，各统计数据的平均值及误差用平均数加减标准误(±SEM)表示。统计学意义运用单因素方差分析中的Newman-Keuls进行评估，显著性差异性的判定为当p值小于0.05时具有显著性。
3结果
3.1TRPA1与P2X7在THP-1来源巨噬细胞上具有相互作用
3.1.1TRPA1和P2X7间的共定位
免疫荧光检测了TRPA1和P2X7在THP-1来源巨噬细胞上的共定位以及HEK293T细胞中的共定位情况(图1)。结果显示：TRPA1和P2X7在THP-1来源的巨噬细胞上具有共定位现象(图1A)。图片的灰度值随位置变化的统计结果(图1B)以及三维图像(图1C)揭示TRPA1和P2X7间具有显著的共定位现象。瞬时转染TRPA1及P2X7的HEK293T细胞进一步验证了这一结果(图1D)。
3.1.2TRPA1参与BzATP诱导的细胞内钙离子内流
钙离子成像检测细胞质及线粒体钙离子变化(图2)的结果显示：BzATP能显著促进THP-1来源巨噬细胞中细胞质以及线粒体的钙离子内流，TRPA1抑制剂AP-18或A967079能抑制大部分细胞质及线粒体钙离子内流，P2X7抑制剂A740003能抑制几乎所有钙离子内流(图2A)。BzATP能持续刺激细胞质以及线粒体的钙离子内流，这一趋势能够被TRPA1抑制剂所抑制(图2B和2C)。经统计分析，与单独受BzATP刺激相比，TRPA1抑制剂对细胞质及线粒体的钙离子内流的抑制作用具有显著性(****p<0.0001)(图2D和2E)。
3.2TRPA1参与调节THP-1来源巨噬细胞线粒体损伤以及线粒体活性氧产生
3.2.1TRPA1参与调节THP-1来源巨噬细胞线粒体活性氧产生
荧光检测THP-1来源巨噬细胞线粒体活性氧产生(图3)的结果表明：ATP能显著促进线粒体活性氧生成，用TRPA1抑制剂A967079，HC030031或P2X7抑制剂A438079能明显抑制线粒体活性氧的生成(图3A)。经统计分析，与单独受ATP刺激相比，TRPA1抑制剂对线粒体活性氧的抑制作用具有显著性(****p<0.0001)(图3B)。
3.2.2TRPA1参与调节THP-1来源巨噬细胞线粒体膜电位降低
荧光检测THP-1来源巨噬细胞线粒体膜电位降低(图4)的结果表明：BzATP能显著降低线粒体膜电位，用TRPA1抑制剂HC030031，P2X7抑制剂A740003或用130mM KCl抑制钾离子外流能明显抑制线粒体膜电位降低这一趋势(图4A)。经统计分析，与单独受BzATP刺激相比，TRPA1抑制剂对线粒体膜电位降低的抑制作用具有显著性(**p<0.01，***p<0.001)(图4B)。ATP对诱导线粒体膜电位的降低具有时间依赖性，用TRPA1抑制剂A967079能显著抑制这一趋势(图4C)。
3.2.3TRPA1参与调节THP-1来源巨噬细胞线粒体损伤
流式细胞术检测THP-1来源巨噬细胞线粒体损伤(图5)的结果表明：ATP能显著改变线粒体的正常结构，用TRPA1抑制剂A967079，HC030031或P2X7抑制剂A438079能明显抑制线粒体损伤发生(图5)。
3.3TRPA1参与活化caspase-1以及促进IL-1β分泌
ELISA检测ATP或BzATP刺激THP-1来源巨噬细胞分泌IL-1β(图5)的结果表明：ATP或BzATP能显著促进IL-1β分泌，用TRPA1抑制剂A967079或AP-18能显著抑制IL-1β的分泌。且经统计分析，与单独受BzATP或ATP刺激相比，TRPA1抑制剂对IL-1β释放的抑制作用具有显著性(*p<0.05，**p<0.01)(图6A和6B)。Western blot检测caspase-1活化以及IL-1β分泌(图6C)的结果表明：ATP显著促进caspase-1以及IL-1β活性剪切体的形成，用TRPA1抑制剂HC030031或AP-18能显著抑制caspase-1的活化以及IL-1β的分泌(图6C)。
3.4TRPA1参与调节THP-1来源巨噬细胞毒性的产生
CCK-8检测ATP诱导THP-1来源巨噬细胞活性降低(图7A)的结果表明：低浓度(10μM和100μM)ATP对THP-1来源巨噬细胞的活性没有显著影响，高浓度(1mM和5mM)ATP可显著降低THP-1来源巨噬细胞的活性。用TRPA1抑制剂A967079能明显抑制细胞活性降低且其具有浓度依赖性。经统计分析，TRPA1抑制剂对THP-1来源巨噬细胞活性降低的抑制作用具有显著性(*p<0.05，#p<0.05，##p<0.01；*versus ATP，#versus control group；NC表示nosignificance)(图7A)。LDH检测ATP诱导THP-1来源巨噬细胞毒性增加(图7B)的结果表明：BzATP可显著增加THP-1来源巨噬细胞的毒性。通过抑制TRPA1，P2X7，线粒体活性氧以及炎症小体NLRP3都能显著抑制THP-1来源巨噬细胞毒性增加(图B)。经统计分析，TRPA1抑制剂对THP-1来源巨噬细胞毒性增加的抑制作用具有显著性(****p<0.0001)(图7B)。
结论：本研究通过建立基于THP-1来源巨噬细胞的细胞炎症模型，探究TRPA1与P2X7间的相互作用以及TRPA1参与ATP诱导的炎症反应。研究结果表明，TRPA1能够与P2X7间相互作用，TRPA1参与ATP或BzATP引起的THP-1来源巨噬细胞钙离子内流，线粒体活性氧产生，线粒体膜电位降低，线粒体损伤，caspase-1活化，IL-1β的分泌，细胞活性降低以及细胞毒性增加。这些结果表明TRPA1可能在ATP诱导的炎症反应及相关疾病中具有重要作用，可作为治疗ATP引起的相关疾病的潜在靶标。

Claims (6)

1.TRPA1的抑制剂在制备治疗炎症药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的治疗炎症药物是治疗ATP诱导的炎症的药物。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的TRPA1的抑制剂为A967079、HC030031或AP-18。
4.一种治疗炎症药物，其特征在于，其包含TRPA1的抑制剂作为活性成分。
5.根据权利要求4所述的治疗炎症药物，其特征在于，所述的治疗炎症药物是治疗ATP诱导的炎症的药物。
6.根据权利要求4或5所述的治疗炎症药物，其特征在于，所述的TRPA1的抑制剂为A967079、HC030031或AP-18。
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