CN111116742B - 一种全人源化抗破伤风双特异性抗体及其构建方法和应用 - Google Patents

一种全人源化抗破伤风双特异性抗体及其构建方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111116742B
CN111116742B CN202010122406.2A CN202010122406A CN111116742B CN 111116742 B CN111116742 B CN 111116742B CN 202010122406 A CN202010122406 A CN 202010122406A CN 111116742 B CN111116742 B CN 111116742B
Authority
CN
China
Prior art keywords
chain
tetanus
bispecific antibody
expression
scfv
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010122406.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111116742A (zh
Inventor
李鑫
饶深铖
范铁炯
孙九如
柏伟
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Serum Bio-Technology Co ltd
Original Assignee
Shanghai Serum Bio-Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Serum Bio-Technology Co ltd filed Critical Shanghai Serum Bio-Technology Co ltd
Priority to CN202010122406.2A priority Critical patent/CN111116742B/zh
Publication of CN111116742A publication Critical patent/CN111116742A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111116742B publication Critical patent/CN111116742B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
    • C07K16/1267—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria
    • C07K16/1282—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria from Clostridium (G)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/35—Valency
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明提供了一种全人源化抗破伤风双特异性抗体，该双特异性抗体包括单链单元A和单链单元B，单链单元A和B都包含了单链可变片段(scFv)、人IgG1的铰链区和Fc片段，其中该单链单元A的scFv对破伤风类毒素的以Trp1289为中心的区域具有特异性结合能力，单链单元B的scFv对破伤风类毒素的以Arg1216为中心的区域具有特异性结合能力。本发明还提供了该双特异性抗体的构建方法及其应用。经过小鼠的中和实验，表明该抗体具有中和保护作用，该双特异性抗体可用于作为诊断试剂检测破伤风类毒素抗原的质量，也可以替代破伤风抗毒素、马破伤风免疫球蛋白或人破伤风免疫球蛋白，用于被动免疫。

Description

一种全人源化抗破伤风双特异性抗体及其构建方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术，涉及基因工程技术领域，更具体地，本发明公开了一类抗破伤风类毒素的双特异性抗体，尤其涉及一种全人源化抗破伤风双特异性抗体；此外，本发明还涉及该全人源化抗破伤风双特异性抗体的构建方法，以及该全人源化抗破伤风双特异性抗体在破伤风感染后的被动治疗中的应用。
背景技术
破伤风是由破伤风杆菌入侵创伤而引起的一种特异性感染，其主要致病原是破伤风杆菌产生的破伤风类毒素。破伤风类毒素是一个由1315个氨基酸组成的分子量约为150kDa的蛋白。该多肽在破伤风杆菌的蛋白水解酶作用后，在456和467氨基酸残基之间裂解成为分量大约为50KD轻链（LC）和100KD重链(LN)，LC和LN通过一对二硫键S439-S467连接。LC是锌依赖蛋白酶，在193-197位有一个锌指结合蛋白的功能域HELIH，375位的酪氨酸是一个催化活性位点。在864和863之间有一个木瓜蛋白酶(papin)切位点可以将重链进一步降解为N端（HCN）和C端（HCC或TTC）。HCN负责突触囊泡通过细胞质进入细胞质的膜，而TTC负责毒素结合神经元细胞。在TCC一段有两个区域，一是以Trp1289、His1271和Try1290为核心所形成的W pocket，其中Trp1289为中心。二是以Asp1147、Arg1226、Asn1216、Asp1214和Try1229为核心区域的R pocket，其中Arg1226为中心，这两个位点结合神经元的受体。当TTC结合神经元上神经节苷脂受体后，在HCN协助下，LC进入神经元后被运输到神经元胞质，在那里裂解可溶性NSF黏附蛋白(soluble NSF attachment protein (SNAP) receptor (SNARE)proteins)，通过水解突触囊泡蛋白Ⅱ而阻断神经抑制性介质的释放，阻断了神经元和运动神经元之间的信号传递，从而产生了破伤风特有的痉挛性瘫痪特征。表现为全身骨骼肌持续性强直和阵发性痉挛，重症患者可发生喉痉挛、窒息、肺部感染和器官功能衰竭，是一种极为严重的潜在致命性疾病。
目前对破伤风的认识是防重于治。破伤风在当下的预防措施包括注射破伤风类毒素主动免疫，正确处理伤口，以及在伤后采用被动免疫预防发病。最有效的方法是注射破伤风抗毒素(TAT)、马破伤风免疫球蛋白F(ab︐)2或人破伤风免疫球蛋白(TIG) 。破伤风抗毒素(TAT)和马破伤风免疫球蛋白F(ab︐)2均是用破伤风类毒素免疫马匹所制得的抗毒素，其纯度有所差异的，这两种形式的抗毒素来源于马匹，有一定程度过敏反应，而人破伤风免疫球蛋白(TIG)是破伤风类毒素免疫人体所制得的抗毒素，虽然无过敏性但具有较昂贵、来源少、制备复杂、供应不足等等缺点。我国临床上广泛使用的仍为TAT或马破伤风免疫球蛋白F(ab︐)2，只有在过敏试验阳性或者家属主动要求的情况下才会使用TIG。因此，人们希望找到一种无过敏性且价格低廉的完全人特异性抗体，可以替代目前的抗体来源。
随着杂交瘤单克隆技术和噬菌体展示技术使用以来，人们逐渐在该领域中使用这些技术进行研究，但是这些研究仍存在的一些问题,比如:①有的文章未报道筛选到的单克隆抗体序列或者未进行测序；②筛选到的序列未进行克隆表达，仅做了序列分析；③克隆表达的序列仅仅进行了体外ELLISA和(或)体外结合实验，未知体内的保护作用；④有的序列表达后进行了小鼠体内中和保护实验，一种常见的思路就是多种单抗混合类似“鸡尾酒”方式，这种思路常有两种方案，一是分别表达单抗，再混合；一是混合表达单抗。前者是重组单抗的生产成本两倍以上，不具有生产应用价值。而后者具有产物纯度低和得率低导致成本很高的缺点。
发明内容
本发明要解决的技术问题之一在于提供一种全人源化抗破伤风双特异性抗体。该抗体具有中和破伤风类毒素的功能。
本发明要解决的技术问题之二在于提供一种全人源化抗破伤风双特异性抗体的构建方法。
本发明要解决的技术问题之三在于提供一种全人源化抗破伤风双特异性抗体的应用。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
在本发明的一方面，提供一种全人源化抗破伤风双特异性抗体，该双特异性抗体包括单链单元A和单链单元B；单链单元A称为A链，单链单元B称为B链，A链和B链均为融合肽，融合肽的基本结构包含单链可变片段scFv、铰链区（人IgG1的铰链区）和Fc片段(cH2结构域和cH3结构域)；A链的单链可变片段scFv对破伤风类毒素的以Trp1289为中心的区域具有特异性结合能力，B链的单链可变片段scFv对破伤风类毒素的以Arg1216为中心的区域具有特异性结合能力。
作为本发明优选的技术方案，所述单链可变片段scFv由轻链可变区通过(GGGGs)n短肽和重链可变区相连接而成，其基本结构如VL一(GGGGs)3一VH；A链和B链的铰链区通过一个或多个二硫键相连接，优选为通过两对二硫键相连接；A链人IgG1 Fc片段和B链人IgG1Fc片段通过隆突一入一穴结构(knobs-into-holes)连接。
作为本发明优选的技术方案，所述A链、B链的scFv的轻链可变区和重链可变区是通过噬菌体展示技术筛选后获得的，是采用重组表达不同破伤风片段或突变体进行差异化筛选全人源化噬菌体免疫抗体库后得到的，获得如下序列：
Figure 301006DEST_PATH_IMAGE001
作为本发明优选的技术方案，所述A链的单链可变片段ScFv为如SEQ ID No.10所示的氨基酸序列；所述B链的单链可变片段ScFv为如SEQ ID No.12所示的氨基酸序列,并对CH3区域的氨基酸进行突变（以EU的重链Fc编码体系），一条链表达突变体(S354C/T366W)，一条链表达突变体(Y349C/T366S/L368A/Y407V),从而形成隆突一入一穴(knobs-into-holes)，提高了异源化的抗体形成。
在本发明的第二方面，提供所述的全人源化抗破伤风双特异性抗体的构建方法，所述的方法包括如下步骤：
(1)分别将A链构建到第一表达载体上，将B链构建到第二表达载体上；
(2)将两种表达载体一起共转染到细胞中，培养并取上清；
(3)将表达上清分离得到纯化后的双特异性抗体，所述的分离步骤包括：亲和层析柱从表达上清中捕获所有带Fc结构域的抗体，通过SP阳离子交换层析和Q柱纯化，最后超滤置换缓冲液。
作为本发明优选的技术方案，步骤（1）中，所述第一表达载体为pCHO1.0，所述第二表达载体为经过抗性改造后的pCHO1.0-潮霉素(Hygromycin)。
作为本发明优选的技术方案，步骤（2）中，所述细胞为CH0-S细胞。
作为本发明优选的方案，在步骤（1）之前包括如下步骤：所述A链、B链的scFv的轻链可变区和重链可变区是通过噬菌体展示技术筛选后获得的，是采用重组表达不同破伤风片段或突变体进行差异化筛选全人源化噬菌体免疫抗体库后得到的；所述筛选方法具体为：
首先，在大肠杆菌重组表达了带有His标签的融合破伤风类毒素864-1315段(Genbank: P04958)以及Y1290A突变体、R1226A突变体及Y1290A/R1226A双突变体的三种突变体，分别命名为TTC、(Y1290A)TTC、(R1226A)TTC和(Y1290A/R1226A)TTC。将这些表达产物使用Ni2+柱纯化后获得纯的产物。
其次，构建了全人源化的人破伤风ScFV噬菌体ScFV抗体库，先后利用TTC、(Y1290A/R1226A)TTC、(Y1290A)TTC和(R1226A)TTC筛选出，可以和(Y1290A)TTC和(R1226A)TTC特异性结合的ScFV，并对活性较好的16个克隆测序，得到以下五组序列，选取其中两组序列表达成双特异性抗体。
Figure 77201DEST_PATH_IMAGE002
最后，将获得的蛋白序列与人的IgG1的铰链区和Fc区链接起来表达，形成ScFV-铰链-Fc型的特异性双特异性抗体，并对FC的CH3区域突变，以便两条链形成隆突一入一穴(knobs-into-holes)，防止了单元A和B链的同源化聚合，提高了产品的纯度。将表达产物纯化后，用于小鼠中和实验测定效价，可达150000IU/克蛋白，显著高于药典的75000IU/克蛋白的标准。
在本发明的另一方面，提供该全人源化抗破伤风双特异性抗体在制备检测破伤风类毒素抗原的质量的诊断试剂中的应用，以及在制备预防和治疗破伤风的药物中的应用。经过小鼠的中和实验，表明该抗体具有中和保护作用，该抗体可用于作为诊断试剂检测破伤风类毒素抗原的质量，也可以替代破伤风抗毒素、马破伤风免疫球蛋白或人破伤风免疫球蛋白，用于被动免疫。
本发明的有益效果在于：获得了全人源化的双特异性抗体，相对于马抗破伤风抗毒素，克服了其异源性，会降低人体过敏性；相对于马破伤风免疫球蛋白F(ab’)2， 不但克服了其异源性，会降低人体过敏性，而且可以延长在人体内的半衰期；相对于人破伤风免疫球蛋白(TIG)，克服了其来源有限和生产成本高的缺点。相对于采用多个单抗混合的“鸡尾酒”方案，具有降低生产成本和减少临床实验数量的优点，该双特异性抗体可以结合破伤风类毒素的Y1290的W pocket和R1226的R pocket区域，可以有效阻止破伤风类毒素与神经元受体结合。
总之，在本发明中，采取重组表达了双特异性抗体，可以结合破伤风类毒素的两个表位中心，进一步优化生产工艺，产物纯度高和得率高（经实验验证，纯化后的双特异性抗体进行HPLC检测，纯度在90％以上，结果见图2），使成本接近于目前的生产人破伤风免疫球蛋白(TIG),大大降低了生产成本，具有显著的经济社会效益。
附图说明
图1是本发明实施例3中双特异性抗体分子示意图。
图2是本发明实施例3中特异性抗体的HPLC图谱。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特列举以下具体实施例分为三个部分详细说明。然而，具体实施例仅仅是用于举例说明，而不是对本发明的限制。
实施例1 破伤风类毒素及突变体的重组表达、纯化。
1.1 表达序列质粒构建
将破伤风类毒素(Genbank: P04958)的蛋白序列864-1315(如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列)一段命名为TTC，将相应的氨基酸经过突变，分别得到 (Y1290A)TTC、(R1226A)TTC和(Y1290A/R1226A)TTC突变体。以大肠杆菌密码子偏好性特点，将这些突变体优化成适合在大肠杆菌中表达密码子：TTC(如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列, 据大肠杆菌密码子偏爱性优化后的破伤风毒素重链C片段的核苷酸序列,5端的TGGCCA为MSCI酶切位点，3端的CTCGAG为XhoI酶切位点)、(Y1290A)TTC、(R1226A)和(Y1290A/R1226A)TTC，请上海捷瑞生物合成分别合成这些序列，然后在这些序列的5端加上MscI酶切位点和3端加上XhoI酶切位点，最后将这些序列装入PET32a载体并转入BL21(DE)3中，得到的产物分别命名为TTC、(Y1290A)TTC、(R1226A)TTC和(Y1290A/R1226A)TTC。
据大肠杆菌密码子偏爱性优化后的破伤风毒素重链C片段的核苷酸序列,5端加框的TGGCCA为MSCI酶切位点，3端加框的 CTCGAG为XhoI酶切位点。
1.2 融合蛋白表达
将从捷瑞转化好的菌株分别涂在含氨苄霉素抗性的LB培养基上，37℃培养过夜，再从平板上挑取6个单克隆菌株，加入到含100ug/ml氨苄霉素LB培养基5ml， 37℃ 220rpm震荡培养过夜。次日早上，按1％的接种量转接到5ml 含100ug/ml氨苄霉素LB培养基中，37℃ 220rpm震荡培养2~3小时左右，待培养物的OD600为 0.6~1之间，记录诱导起始点OD600值，并取样1ml，此为诱导前样品。在每个试管中加入1mM IPTG再将温度调为28℃、200rpm震荡培养诱导4小时.最后离心收集菌体，用适当体积的水重悬，使各样品的菌浓度一致。进行SDS－PAGE检测。
1.3 重组蛋白纯化
1）取50毫升Ni Sepharose™ 6 Fast Flow(GE, 货号：17-5318-02)装入2.6x10cm层析柱，凝胶先后用2体积1M NaCl, 2体积0.5 N NaOH清洗后，用pH为8.0的lysis buffer(20mM,Tris-HCl 、100mM NaCl buffer),平衡。
2）四个2000毫升三角烧瓶，每个含500毫升LB培养基，均接种筛选到的最佳TCC表达克隆，各接种1%种子液至500mL LB/500mL锥形瓶，37℃摇床培养至OD600=0.6-0.8，加入0.4mM IPTG诱导，30℃，220rpm，6hr。
3）离心收集菌体，加入100mL裂解液(20mM,Tris-HCl,100mM NaCl buffer)重悬菌体，然后进行超声破碎10min。于4℃，12000×g离心20min,取上清,弃沉淀。上清用0.45uM微孔滤膜过滤至一新的离心管中。
4）无菌条件下各加上样完毕，层析柱用10-15倍柱体积的Wash buffer（20mMTris-HCl buffer, 100mM NaCl，20mM imidazole）洗涤至OD值低于0.05，然后使用Elutionbuffer:（20mM Tris-HCl buffer, 100mM NaCl 250mM imidazole）洗脱，收集洗脱获得的蛋白峰，这个蛋白峰即为高纯度重组破伤风毒素重链C片段。SDS-PAGE中在65KD处有一蛋白条带，未见其它蛋白条带。2000毫升培养上清可以获得200毫克破伤风毒素重链C片段。
5）将纯化产物用30KD超滤管(millopore) 3500rpm*20min超滤,将其缓冲液更换为20mM PB。
6）将纯化后的样品，用SDS-PAGE检测
1.4 参考nano (Thermo公司)操作手则，测定得TTC、(Y1290A)TTC、(R1226A)TTC和(Y1290A/R1226A)TTC的蛋白浓度。
实施例2 全人源化的噬菌体免疫抗体库的构建、筛选和测序
2.1 全人源化的噬菌体免疫抗体库的构建
1）人破伤风VH和VL基因的PCR 扩增
依据invitrogen的RNA抽提试剂盒说明书，从3名破伤风抗体滴度较高的健康献浆员外周血淋巴细胞中提取总RNA。以纯化的RNA为模板，用OligodT引物通过逆转录酶逆转录合成cDNA。根据人抗体序列，采用抗体轻重链可变区框架引物（nature biotechnology 14:309-314 (1996)），引物涵盖了7 种VH家族基因、7 种Vκ家族基因、8 种Vλ家族基因，抗体基因覆盖了人抗体基因多样性的95%以上。PCR 条件: 94℃预变性5 min， 94℃变性30s，57℃退火30 s，72℃ 延伸50 s，30个循环后72℃延伸5 min,然后胶回收试剂盒分别回收VL、VH片段。
2）重叠PCR 法拼接扩增scFv 片段
单链抗体采用VL-Linker-VH形式，Linker 为(GGGGS)3形式。设计引物在VL基因5'端及VH基因3'端分别引入SfiⅠ和NotI酶切位点，并在VL反向引物和VH正向引物中设计Linker重叠区域。分别以回收的VH、VL片段为模板，进行PCR 扩增: 94℃ 预变性5 min，94℃ 变性30 s，55℃ 退火30 s，72℃ 延伸1 min， 30 个循环后72℃延伸10min，获得VL-Linker和Linker-VH片段。分别以VL-Linker和Linker-VH片段为模板，拼接获得scFv 片段，反应条件: 94℃ 预变性5 min，94℃变性30s，55℃退火30s,72℃延伸1 min，5个循环后加入VL-Linker片段5'端引物和Linker-VH片段3'端引物，继续反应，共30个循环。
3）人破伤风免疫噬菌体单链抗体库的构建
将上述PCR 产物用SfiⅠ和NotⅠ双酶切，克隆入噬粒pCANTAB5E中，以连接产物电转化大肠TGl感受态，共转化5次。转化产物涂于SOC平板经37℃培养过夜，根据长出的克隆数测定库容量。取少量抗体库于SOC培养液中稀释至OD600 = 0.25，于37℃，220r/min培养至对数生长期，按照感染复数(MOI)= 20:1加入辅助噬菌体M13K07,37℃缓慢摇动1 h。离心弃上清，取沉淀于2×YT( AKG) 培养液重悬，30℃，200 r /min 培养过夜。次日，离心取上清，计入1 /5 体积PEG8000, 缓冲液(含2.5 mol/L NaCl)，沉淀噬菌体3h。将以上混合液于4℃,12000rpm，离心25 min，去上清，沉淀用2 ml PBS 缓冲液重悬，即获得噬菌体抗体悬液。
取10 μl 制备好的噬菌体抗体悬液，用LB 培养液进行10 倍梯度稀释，加入对数生长期的XL1-Blue菌， 37℃缓慢摇动培养1 h，取少量涂于含四环素抗性的LB平板，37℃培养过夜。次日，取出平板推算噬菌体库滴度。
4）抗体库重组率检测及多样性鉴定
从含四环素抗性的LB平板上随机挑取20个克隆，以载体 pCANTAB5E 通用引物S1和S6 为引物，通过菌落PCR 鉴别scFv连入载体的重组率。随机挑选20个克隆送上海生工测序。
2.2噬菌体库的筛选和测序
1）噬菌体单链抗体库的富集筛选共进行3轮筛选。采用pH 9.6 的0.05 mol /LNa2CO3-NaHCO3包被液稀释TTC包被免疫板。3 轮筛选，TTC包被量依次降低，分别为10、5 和1 ug/ml。次日用PBS 洗涤免疫管，加入噬菌体单链抗体库，37℃作用1 h。3 轮洗涤条件依次加强，分别为10次PBS、10 次PBS + 5次PBST、10次PBST + 15次PBST。免疫管经洗涤后，采用pH 3.2 的0.1 mol/L盐酸甘氨酸缓冲系统(Gly-CL)洗脱抗体，并经1 mol/L Tris中和至pH 7.4。将免疫管和洗脱液均用对数生长期的大肠XL1-Blue 菌直接感染。取部分涂板计算筛选产出量。将剩余菌液浓缩、涂板37℃培养过夜。次日将培养板上的菌落刮下，取部分呈现并经PEG8000 缓冲液沉淀噬菌体抗体后，检测滴度。
2）阳性克隆的筛选挑取第3 轮筛选获得的克隆于含2×YT( AG) 培养液的96孔深孔板中，培养至D600=0.5，加入辅助噬菌体M13K07，培养1 h，加入等体积含四环素抗性和0.2 mmol/L IPTG的2 ×YT( AK) 培养液，30℃培养过夜。次日上清加入到提前包被有1μg/ml TTC的96孔板中， 37℃孵1h，PBST(0.1% Tween20)洗涤，加入HRP/Anti-M13抗体，37℃静置40 min，PBST 洗涤后显色。酶标仪450 nm 单波长测定光密度值。
3）阳性克隆特异性结合活性鉴定挑取结合活性较高者( D450值高者) 验证单链抗体对TTC的特异结合活性。分别以TTC、(Y1290A)TCC、(R1226A)TCC和(Y1290A/R1226A)TCC一同包被到96孔板中，包被浓度为1μg/ml，100μl /孔，4℃包被过夜。ELISA 检测操作过程同阳性克隆筛选。
4）阳性克隆scFv 抗体基因序列测定选取下列两组特异性结合活性好的阳性克隆：① 和TTC和(Y1290A)TCC反应且活性好，和(Y1290A/R1226A)TCC无反应；② 和TTC和(R1226A)TCC反应且活性好，和(Y1290A/R1226A)TCC无反应；将这两组的克隆分别接种于5ml 2×YT培养液中，37℃、220r/min 振摇培养过夜，抽取质粒，送上海生工测序。
经过ELLISA鉴定后，高于阴性对照(OD450=0.18)3倍以上克隆数为30个，其中每组的活性最好的前8个克隆OD450读数见表1，将表1中16个阳性克隆测序，经过Blast分析，有4、6、12和16号为无效克隆，其余序列的CDR3区见表2。
表1 噬菌体抗体库克隆的ELLISA检测结果（活性最好的各8个克隆的ELLISA值(OD450)）
Figure 856939DEST_PATH_IMAGE003
备注：“-”代表未测定
Figure DEST_PATH_IMAGE004
实施例3 双特异性抗体表达、纯化和鉴定
3.1载体pCHO 1.0-潮霉素构建
取pcDNA3.1/Hygro的2118-3141一段核苷酸序列（编码潮霉素基因的核苷酸序列,如SEQ ID No.3所示），替换载体pCHO 1.0的8860-9459一段，使其PGK启动子(phosphoglycerate kinase promotor)表达潮霉素(Hygromycin)。
3.2 双特异性表达载体
3.2.1 Fc+铰链区knob突变体(或hole突变体)序列
人IgG1(IMGT命名为IGHG1)的氨基酸序列221-446一段(EU编码体系)包含了三区域:221-234为Hinge区域，234-341为CH2区域和342-446为CH3区域.在本发明中，借鉴文献(nature biotechnology(1998),16(7):677-681)对CH3区域的氨基酸进行突变，一条链表达S354C、T366W的knob突变体（其多肽序列见SEQ ID No.6(即铰链区+Knob突变体(S354C、T366W)的Fc氨基酸序列)，相应的核苷酸序列见SEQ ID No.7（即编码铰链区+Knob突变体(S354C、T366W)的Fc的核苷酸序列）），一条链表达Y349C、T366S、L368A和Y407V的hole突变体(其多肽序列见SEQ ID No.8（即铰链区+Hole突变体(Y349C、T366S、L368A和Y407V)的Fc氨基酸序列），相应的核苷酸序列见SEQ ID No.9（铰链区+Hole突变体(Y349C、T366S、L368A和Y407V)的Fc核苷酸序列)。
3.2.2 单元A链ScFV和单元B链ScFV序列
单元A和B链的信号均用鼠kappa链的信号肽（其多肽序列见SEQ ID No.4，相应的核苷酸序列见SEQ ID No.5）
根据阳性克隆测序结果及分析，2、3和7号序列完全相同，选取2、3和7号组作为单元A链ScFV进一步研究(其多肽序列见SEQ ID No.10，相应的核苷酸序列见SEQ ID No.11）;13、14和15号序列完全相同，选取13、14和15号组作为单元B链ScFV进一步研究(其多肽序列见SEQ ID No.12，相应的核苷酸序列见SEQ ID No.13）。
3.2.3双特异性表达载体的组成
在本实例中，A链由序列SEQ ID No.5、序列SEQ ID No.11、序列SEQ ID No.7组成，B链由序列SEQ ID No.5、序列SEQ ID No.13、序列SEQ ID No.9组成。将A、B链的序列及序列SEQ ID No.3一起送安徽通用公司合成并构建双特异性表达载体。双特异性抗体分子见图1，其中，A、B分别表示特异性结合Y1289、R1216区域的单元A和B，A和B链CH3链可以形成隆突-入-穴（knobs-into-holes）结构，可以是A形成隆突且B链成穴，也可以是A形成穴且B链成隆突。
3.3 双特异性抗体表达
参考质粒抽提试剂盒说明书，利用无内毒素大提试剂盒(CW2107 北京康为世纪)进行质粒大提。同时，参考说明书，将CHO-S细胞培养在CD CHO培养基(Gibco，10743-029)中，置于37℃，5％C02细胞培养箱中进行培养，准备好细胞后，使用伯乐电转仪将质粒pCH01.0-A与pCH01.0-潮霉素-B一起共转染到CHO-S细胞中。
参考说明书(Freedom CHO-S kit user guide P32-35)，采用两轮筛选法建立稳定表达细胞系，分别在转染后第2天，培养温度下调到32℃，并每3-4天更换一次培养基且抗生素按照50-200mg/ml浓度递加，筛选8周后，获得了稳定表达株。
将筛选得到的高表达克隆株用无血清培养基扩大培养，1000g离心收获表达上清。
3.4 双特异性抗体的纯化
利用MabSelect Sure亲和层析柱(GE公司，美国)从表达上清中捕获所有带Fc结构域的抗体。用平衡缓冲液(20mM PB，pH7.0)平衡层析柱后，表达上清用0.22μM滤膜过滤，过亲和层析柱，上样完毕后用平衡缓冲液洗涤至OD280小于0.05后用洗脱缓冲液(20mM 甘氨酸/盐酸，pH3.0)洗脱。洗脱的蛋白通过SP-琼脂糖凝胶阳离子交换层析(上海博格隆公司)，实现目标双特异性抗体与副产物的分离。SP-用平衡缓冲液A(20mM PB，pH 6.0)平衡层析柱后，样品用注射用水稀释电导至3．0—3.5ms之间，过SP柱子结合后，用洗脱缓冲液B(20mMPB,1.5M NaCL pH 6.0)线性洗脱；最后超滤浓缩并置换成缓冲液50 mM枸橼酸钠， 0.15NaCL pH 5.5。
经过测定，每升可以表达3g表达产物，经过纯化后每升培养基可以获得2g双特异性抗体。
3.5 HPLC检测
参考安捷伦1200 Infinity II的说明书及中国药典2015版，使用色谱柱G3000SW(TOSOH公司，日本) 。
1.开启HPLC，待仪器自检，进入工作站，选择方法（设置波长280nm，柱温25℃，流速0.6ml/min，运行时间为40min）。
2. 走基线：先用10%乙腈冲洗，再换上流动相含（含1%异丙醇的pH7.0、0.2mol/L磷酸盐钠缓冲液），平衡走基线。
3. 供试品溶液的制备：用流动相将供试品稀释至每1ml含蛋白质12mg的溶液。
4. 各取20μl稀释后的供试品溶液注入高效液相色谱仪进行分析，运行时间为40min，以保留时间定性，用面积归一法计算含量。
纯化后的双特异性抗体进行HPLC检测，纯度在90％以上（结果见图2）。参考nano(Thermo公司)操作手则，测定双特异性抗体的蛋白浓度。
实施例4 小鼠法测定双特异性抗体的效价
本实施例参考中国药典2015版通则3508，使用小鼠实验法执行。
1、 破伤风抗毒素标准品（购自中国食品药品检定研究院）配制： 用硼酸盐缓冲盐水（pH 7.2, 50 mM硼酸，0.15 M氯化钠）稀释，使每ml含0.5 IU，当与毒素等量混合后，每0.4 ml混合溶液注射量中含0.1 IU。
2、破伤风毒素标准品（购自中国食品药品检定研究院）配制：用硼酸盐缓冲盐水稀释，使每ml含5个试验量（0.5 L+，L+为破伤风毒素使小鼠100%死亡的最低致死剂量），即与抗毒素等量混合后每0.4 ml注射量中含1个试验量（0.1 L+）。
将待检供试品用硼酸盐缓冲盐水稀释成数个稀释度，使每ml约含0.5IU（即0.5IU）或其上下，即与毒素等量混合后每0.4 ml注射量中约含0.1IU或其上下。稀释度之间间隔约为5%。
3、将破伤风抗毒素标准品及不同稀释度的待检供试品分别加入等量的稀释试验毒素，混合均匀，置水浴箱中于37℃结合1小时，立即注射。
注射时，由高稀释度向低稀释度依次注射，每个稀释度各注射0.4ml于17-19g小鼠腹部或大腿根部皮下，每个稀释度各注射小鼠至少3只。
4、结果观察，试验小鼠至少应每日上、下午各观察一次，连续5日，并记录发病及死亡情况。
结果判定，对照小鼠应于72 ～120小时之内全部死亡。待检供试品之效价应为与对照小鼠同时死亡或出现破伤风神经毒症状最重者的最高稀释度。
实验结果表明：该双特异性抗体的效价可达150000IU/g，显著高于药典的75000IU/克的标准。
序列表
<110>上海赛伦生物技术股份有限公司
<120>一种全人源化抗破伤风双特异性抗体及其构建方法和应用
<130>WH-NP-19-100499
<160>23
<170>PatentIn version 3.5
<210> 1
<211>451
<212>PRT
<213>人工序列(未知)
<400> 1
KNLDCWVDNE EDIDVILKKS TILNLDINND IISDISGFNS SVITYPDAQL VPGINGKAIH 60
LVNNESSEVI VHKAMDIEYN DMFNNFTVSF WLRVPKVSAS HLEQYGTNEY SIISSMKKHS 120
LSIGSGWSVS LKGNNLIWTL KDSAGEVRQI TFRDLPDKFN AYLANKWVFI TITNDRLSSA 180
NLYINGVLMG SAEITGLGAI REDNNITLKL DRCNNNNQYV SIDKFRIFCK ALNPKEIEKL 240
YTSYLSITFL RDFWGNPLRY DTEYYLIPVA SSSKDVQLKN ITDYMYLTNA PSYTNGKLNI 300
YYRRLYNGLK FIIKRYTPNN EIDSFVKSGD FIKLYVSYNN NEHIVGYPKD GNAFNNLDRI 360
LRVGYNAPGI PLYKKMEAVK LRDLKTYSVQ LKLYDDKNAS LGLVGTHNGQ IGNDPNRDIL 420
IASNWYFNHL KDKILGCDWY FVPTDEGWTN D 451
<210> 2
<211> 1399
<212> DNA
<213>人工序列(未知)
<400> 2
tggccatcatcaccaccaccacgacgacgacgacaagaagaacttggattgttgggtgga 60
taacgaagaagatatcgatgtgattttgaagaagagcaccatcttgaacttggatatcaa 120
caacgatatcatcagcgatatcagcggcttcaacagctctgtgattacctatccggatgc 180
gcaattggtgccgggcatcaacggcaaagcgattcatttggtgaacaatgaatctagcga 240
agtgattgtgcataaagcgatggatatcgaatacaacgatatgttcaataactttaccgt 300
gagcttctggttgcgtgtgccgaaagtgagcgcgagccatttggaacaatatgataccaa 360
cgagtatagcatcattagctctatgaagaagtatagcttgagcattggcagcggctggag 420
cgtgagcttgaaaggcaataacttgatttggaccttgaaagatagcgcgggcgaagtgcg 480
tcaaatcaccttccgtgatttgtctgataagttcaacgcgtacttggcgaacaagtgggt 540
gttcattaccattaccaacgatcgtttgtctagtgcgaacttgtatatcaacggcgtgtt 600
gatgggctctgcggaaatcaccggcttgggcgcgatccgtgaggataacaacatcacctt 660
gaagttggatcgttgtaacaataacaatcaatatgttagtatcgataagtttcgcatctt 720
ctgtaaagcgttgaacccgaaagagatcgaaaagttgtataccagttacttgagtatcac 780
cttcttgcgcgatttctggggcaacccgttgcgctacgataccgaatactacttgatccc 840
ggttgcgtatagttccaaagatgttcagttgaagaacatcaccgattacatgtatttgac 900
gaacgcgccgagttacacgaacggcaagttgaacatctactatcgccgcctttactcagg 960
ccttaagttcatcatcaaacgctacacgccgaacaatgaaatcgactcattcgttcgctc 1020
aggcgactttatcaaactttacgtttcatacaacaataacgagcatatcgttggttaccc 1080
gaaagacggtaacgccttcaacaatcttgaccgcatccttcgcgttggttacaacgcccc 1140
aggtatcccactttacaagaagatggaagccgttaagcttcgcgaccttaagacgtactc 1200
cgtccaacttaagctttacgatgacaaagatgcctctttaggtcttgtcggtacgcataa 1260
cggtcagatcggtaacgacccaaaccgggacatcttgatagcatcgaactggtacttcaa 1320
tcacctgaaagacaagactttgacttgcgactggtactttgtacctacagacgaagggtg 1380
gacaaatgactaactcgag 1399
<210> 3
<211> 1024
<212> DNA
<213>人工序列(未知)
<400> 3
atgaaaaagcctgaactcaccgcgacgtctgtcgagaagtttctgatcgaaaagttcgac 60
agcgtctccgacctgatgcagctctcggagggcgaagaatctcgtgctttcagcttcgat 120
gtaggagggcgtggatatgtcctgcgggtaaatagctgcgccgatggtttctacaaagat 180
cgttatgtttatcggcactttgcatcggccgcgctcccgattccggaagtgcttgacatt 240
ggggaattcagcgagagcctgacctattgcatctcccgccgtgcacagggtgtcacgttg 300
caagacctgcctgaaaccgaactgcccgctgttctgcagccggtcgcggaggccatggat 360
gcgatcgctgcggccgatcttagccagacgagcgggttcggcccattcggaccgcaagga 420
atcggtcaatacactacatggcgtgatttcatatgcgcgattgctgatccccatgtgtat 480
cactggcaaactgtgatggacgacaccgtcagtgcgtccgtcgcgcaggctctcgatgag 540
ctgatgctttgggccgaggactgccccgaagtccggcacctcgtgcacgcggatttcggc 600
tccaacaatgtcctgacggacaatggccgcataacagcggtcattgactggagcgaggcg 660
atgttcggggattcccaatacgaggtcgccaacatcttcttctggaggccgtggttggct 720
tgtatggagcagcagacgcgctacttcgagcggaggcatccggagcttgcaggatcgccg 780
cggctccgggcgtatatgctccgcattggtcttgaccaactctatcagagcttggttgac 840
ggcaatttcgatgatgcagcttgggcgcagggtcgatgcgacgcaatcgtccgatccgga 900
gccgggactgtcgggcgtacacaaatcgcccgcagaagcgcggccgtctggaccgatggc 960
tgtgtagaagtactcgccgatagtggaaaccgacgccccagcactcgtccgagggcaaag 1020
gaat 1024
<210> 4
<211> 20
<212> PRT
<213>人工序列(未知)
<400> 4
METDTLLLWV LLLWVPGSTG 20
<210> 5
<211> 60
<212> DNA
<213>人工序列(未知)
<400> 5
atggagacagacacactcctgctatgggtactgctgctctgggttccaggttccactggt 60
<210>6
<211> 227
<212> PRT
<213>人工序列(未知)
<400>6
DKTHTCPPCP APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD 60
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK 120
GQPREPQVYT LPPCRDELTK NQVSLWCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS 180
DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK 227
<210>7
<211>1104
<212> DNA
<213>人工序列(未知)
<400>7
gacaaaactcacacatgcccaccgtgcccaggtaagccagcccaggcctcgccctccagc 60
tcaaggcgggacaggtgccctagagtagcctgcatccagggacaggccccagccgggtgc 120
tgacacgtccacctccatctcttcctcagcacctgaactcctggggggaccgtcagtctt 180
cctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatg 240
cgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacgg 300
cgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccg 360
ggtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtg 420
caaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagg 480
tgggacccgtggggtgcgagggccacatggacagaggccggctcggcccaccctctgccc 540
tgagagtgaccgctgtaccaacctctgtcctacagggcagccccgagaaccacaggtgta 600
caccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggt 660
caaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaa 720
caactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaa 780
gctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgca 840
tgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatgagt 900
gcgacggccggcaagccccgctccccgggctctcgcggtcgcacgaggatgcttggcacg 960
taccccctgtacatacttcccgggcgcccagcatggaaataaagcacccagcgctgccct 1020
gggcccctgcgagactgtgatggttctttccacgggtcaggccgagtctgaggcctgagt 1080
ggcatgagggaggcagagcgggtc 1104
<210>8
<211> 227
<212> PRT
<213>人工序列(未知)
<400>8
DKTHTCPPCP APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD 60
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK 120
GQPREPQVCT LPPSRDELTK NQVSLSCAVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS 180
DGSFFLVSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK 227
<210>9
<211>1104
<212> DNA
<213>人工序列(未知)
<400>9
gacaaaactcacacatgcccaccgtgcccaggtaagccagcccaggcctcgccctccagc 60
tcaaggcgggacaggtgccctagagtagcctgcatccagggacaggccccagccgggtgc 120
tgacacgtccacctccatctcttcctcagcacctgaactcctggggggaccgtcagtctt 180
cctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatg 240
cgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacgg 300
cgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccg 360
ggtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtg 420
caaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagg 480
tgggacccgtggggtgcgagggccacatggacagaggccggctcggcccaccctctgccc 540
tgagagtgaccgctgtaccaacctctgtcctacagggcagccccgagaaccacaggtgta 600
caccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggt 660
caaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaa 720
caactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaa 780
gctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgca 840
tgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatgagt 900
gcgacggccggcaagccccgctccccgggctctcgcggtcgcacgaggatgcttggcacg 960
taccccctgtacatacttcccgggcgcccagcatggaaataaagcacccagcgctgccct 1020
gggcccctgcgagactgtgatggttctttccacgggtcaggccgagtctgaggcctgagt 1080
ggcatgagggaggcagagcgggtc 1104
<210>10
<211> 219
<212> PRT
<213>人工序列(未知)
<400>10
QVQLQESGSG LVKPSQTLSL TCAVSGGSIM TYSWSWIRQT PGKGLEWIGY IYHSGSTSYN 60
PSLESRVTIS VDRFKNQLSL QLTAADTGVY YCARNAKQWL VTNAFDVGGG GSGGGGSGGG 120
GSDIQMTQSP SSLSASVGDR VTITCRASQS ISSYLNWYQQ KPGKAPKLLI YAASSLQSGV 180
PSRFSGSGSG TDFTLTISSL QPEDFATYYC HQYGSLPRT 219
<210>11
<211>657
<212> DNA
<213>人工序列(未知)
<400>11
caggtgcagctgcaggagagcggcagcggcctggtgaagcctagccagaccctgagcctg 60
acctgcgccgtgagcggcggcagcatcatgacctacagctggagctggatcaggcagacc 120
cctggcaagggcctggagtggatcggctacatctaccacagcggcagcaccagctacaac 180
cctagcctggagagcagggtgaccatcagcgtggacaggttcaagaaccagctgagcctg 240
cagctgaccgccgccgacaccggcgtgtactactgcgccaggaacgccaagcagtggctg 300
gtgaccaacgccttcgacgtgggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcggcggcggc 360
ggcagcgacatccagatgacccagagccctagcagcctgagcgccagcgtgggcgacagg 420
gtgaccatcacctgcagggccagccagagcatcagcagctacctgaactggtaccagcag 480
aagcctggcaaggcccctaagctgctgatctacgccgccagcagcctgcagagcggcgtg 540
cctagcaggttcagcggcagcggcagcggcaccgacttcaccctgaccatcagcagcctg 600
cagcctgaggacttcgccacctactactgccaccagtacggcagcctgcctaggacc 657
<210>12
<211> 218
<212> PRT
<213>人工序列(未知)
<400>12
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFS RYGMTWLRQA PGQGPEWMGW ISGYNGNTNY 60
AQKVEGRVTI TTDTSTSTAY MELRSLKSDD TAVYYCARGR YYYFDVGGGG SGGGGSGGGG 120
SDIQMTQSPS SVSASVGDRV TITCRASQGI SSWLAWYQQK PGKAPKLLIY AASSLQSGVP 180
SRFSGSGSGT DFTLTISSLQ PEDFATYYCQ QYGNSPLT 218
<210>13
<211>654
<212> DNA
<213>人工序列(未知)
<400>13
caggtgcagctggtgcagagcggcgccgaggtgaagaagcctggcgccagcgtgaaggtg 60
agctgcaaggccagcggctacaccttcagcaggtacggcatgacctggctgaggcaggcc 120
cctggccagggccctgagtggatgggctggatcagcggctacaacggcaacaccaactac 180
gcccagaaggtggagggcagggtgaccatcaccaccgacaccagcaccagcaccgcctac 240
atggagctgaggagcctgaagagcgacgacaccgccgtgtactactgcgccaggggcagg 300
tactactacttcgacgtgggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcggcggcggcggc 360
agcgacatccagatgacccagagccctagcagcgtgagcgccagcgtgggcgacagggtg 420
accatcacctgcagggccagccagggcatcagcagctggctggcctggtaccagcagaag 480
cctggcaaggcccctaagctgctgatctacgccgccagcagcctgcagagcggcgtgcct 540
agcaggttcagcggcagcggcagcggcaccgacttcaccctgaccatcagcagcctgcag 600
cctgaggacttcgccacctactactgccagcagtacggcaacagccctctgacc 654
<210>14
<211>13
<212> PRT
<213>人工序列(未知)
<400>14
NAKQWLVTNA FDV 13
<210>15
<211>5
<212> PRT
<213>人工序列(未知)
<400>15
HQYGSLPRT 9
<210>16
<211>6
<212> PRT
<213>人工序列(未知)
<400>16
GVTLDY 6
<210>17
<211>11
<212> PRT
<213>人工序列(未知)
<400>17
ATWGDALNGP V 11
<210>18
<211>13
<212> PRT
<213>人工序列(未知)
<400>18
NGKQWLVANA FDI 13
<210>19
<211>11
<212> PRT
<213>人工序列(未知)
<400>19
SSYTSSSTLH S 11
<210>20
<211>8
<212> PRT
<213>人工序列(未知)
<400>20
GRYYYFDV 8
<210>21
<211>10
<212> PRT
<213>人工序列(未知)
<400>21
QERSGSPPLT 10
<210>22
<211>12
<212> PRT
<213>人工序列(未知)
<400>22
DYYHSGSYYF DY 12
<210>23
<211>9
<212> PRT
<213>人工序列(未知)
<400>23
QQYGNSPLT 9

Claims (6)

1.一种全人源化抗破伤风双特异性抗体，其特征在于，该双特异性抗体包括单链单元A和单链单元B；单链单元A称为A链，单链单元B称为B链，A链和B链均为融合肽，融合肽的基本结构包含单链可变片段scFv、铰链区和Fc片段；A链的单链可变片段scFv对破伤风类毒素的以Trp1289为中心的区域具有特异性结合能力，B链的单链可变片段scFv对破伤风类毒素的以Arg1216为中心的区域具有特异性结合能力；所述单链可变片段scFv由轻链可变区通过(GGGGs)n短肽和重链可变区相连接而成，其基本结构如VL一(GGGGs)3一VH；A链和B链的铰链区通过一个或多个二硫键相连接；A链人IgG1 Fc片段和B链人IgG1 Fc片段通过隆突一入一穴结构连接；所述A链的单链可变片段ScFv为如SEQ ID No.10所示的氨基酸序列；所述B链的单链可变片段ScFv为如SEQ ID No.12所示的氨基酸序列,并对Fc片段的CH3区域的氨基酸进行突变，一条链表达突变体S354C/T366W，一条链表达突变体Y349C/T366S/L368A/Y407V,从而形成隆突一入一穴，提高了异源化的抗体形成。
2.根据权利要求1所述的全人源化抗破伤风双特异性抗体的构建方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：
(1)分别将A链构建到第一表达载体上，将B链构建到第二表达载体上；
(2)将两种表达载体一起共转染到细胞中，培养并取上清；
(3)将表达上清分离得到纯化后的双特异性抗体，所述的分离步骤包括：亲和层析柱从表达上清中捕获所有带Fc结构域的抗体，通过SP阳离子交换层析和Q柱纯化，最后超滤置换缓冲液。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，所述第一表达载体为pCHO1.0，所述第二表达载体为经过抗性改造后的pCHO1.0-潮霉素。
4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，所述细胞为CH0-S细胞。
5.根据权利要求1所述的双特异性抗体在制备检测破伤风类毒素抗原的质量的诊断试剂中的应用。
6.根据权利要求1所述的双特异性抗体在制备预防和治疗破伤风的药物中的应用。
CN202010122406.2A 2020-02-27 2020-02-27 一种全人源化抗破伤风双特异性抗体及其构建方法和应用 Active CN111116742B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010122406.2A CN111116742B (zh) 2020-02-27 2020-02-27 一种全人源化抗破伤风双特异性抗体及其构建方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010122406.2A CN111116742B (zh) 2020-02-27 2020-02-27 一种全人源化抗破伤风双特异性抗体及其构建方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111116742A CN111116742A (zh) 2020-05-08
CN111116742B true CN111116742B (zh) 2021-11-02

Family

ID=70493312

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010122406.2A Active CN111116742B (zh) 2020-02-27 2020-02-27 一种全人源化抗破伤风双特异性抗体及其构建方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111116742B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111961136B (zh) * 2020-07-13 2022-07-08 厦门医学院 一种全人源化中和破伤风毒素的三价特异性抗体及其制备方法
CN112225813B (zh) * 2020-10-21 2021-12-21 北京智仁美博生物科技有限公司 针对破伤风毒素的抗体及其用途
CN114835806A (zh) * 2022-02-25 2022-08-02 上海赛伦生物技术股份有限公司 一种抗破伤风单克隆抗体组合物的制备方法及应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104829726A (zh) * 2015-01-21 2015-08-12 武汉友芝友生物制药有限公司 一种双特异性抗体cd19xcd3的构建及应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104829726A (zh) * 2015-01-21 2015-08-12 武汉友芝友生物制药有限公司 一种双特异性抗体cd19xcd3的构建及应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Construction of scFv library of human antibodies against tetaus toxin;Hamideh rouhani Nejad等;《Hum antibodies.》;20141231;第23卷(第1-2期);21-26 *
Tetanus neurotoxin neutralizing antibodies screened from a human immune scFv antibody phage display library;Han Wang等;《Toxins》;20160911;第8卷(第9期);第13页最后1段至第14页第5段 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN111116742A (zh) 2020-05-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109734806B (zh) 一种全人源抗huTIGIT单克隆抗体及其应用
CN111116742B (zh) 一种全人源化抗破伤风双特异性抗体及其构建方法和应用
CN108473987B (zh) 具有改变的多样性支架结构域的结合成员
EP2989204B1 (en) Isolation of therapeutic target specific vnar domains to icosl
JP5744937B2 (ja) 血栓症の処置のための抗糖タンパク質ｖｉ ｓｃｆｖフラグメント
EP3130607A2 (en) Muc1* antibodies
US20020137897A1 (en) A method for altering antibody light chain interactions
EP3850007A2 (en) Engineered bispecific proteins
CN107614762B (zh) 一种由噬菌体表达的单链变异片段抗体库
WO2007108152A1 (ja) 高機能性二重特異性抗体
JP2006333825A (ja) 標的物質捕捉用タンパク質の製造方法及びその構成材料の選択方法
Juárez-González et al. Directed evolution, phage display and combination of evolved mutants: a strategy to recover the neutralization properties of the scFv version of BCF2 a neutralizing monoclonal antibody specific to scorpion toxin Cn2
CN111138537B (zh) 一种抗人血清白蛋白抗体片段、制备方法和应用
KR20220123072A (ko) 신규 폴리펩티드 복합체
CN110964113B (zh) 介导结合免疫球蛋白的单域抗体、由其构建的双功能抗体及其应用
CN114340668A (zh) 结合于cd38和cd3的异源二聚抗体
EP3440110B1 (en) Monovalent inhibitor of hutnfr1 interaction
WO2008152537A2 (en) Humanized monoclonal antibodies against human epidermal growth factor receptor, use and method thereof
CN111961136B (zh) 一种全人源化中和破伤风毒素的三价特异性抗体及其制备方法
Tadokoro et al. Thermostability and binding properties of single-chained Fv fragments derived from therapeutic antibodies
Cupit et al. Neutralisation and binding of VHS virus by monovalent antibody fragments
US20240035020A1 (en) Fast-track humanisation of specific binding molecules
CN115772218B (zh) 两种靶向新冠病毒s蛋白受体结合区的泛变异株广谱中和纳米抗体及其潜在应用
CN114369165B (zh) 一种牛源抗金黄色葡萄球菌毒力因子GapC的单链抗体、制备方法及其应用
WO2023011614A1 (zh) 抗pd-l1纳米抗体及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant