CN111110918B - 一种高强度植入级骨材料的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及骨移植技术领域，提供了一种高强度植入级骨材料的制备方法，其中依次使用包括等离子活化水和表面活性剂的第一处理液、包括等离子活化水和双氧水的第二处理液、包括等离子活化水和酒精的第三处理液和包括等离子活化水和A‑GAL蛋白酶的第四处理液对异种骨进行处理，得到高强度植入级骨材料。本发明提供的方法利用等离子活化水提供高活性的分子作用环境和介质，起到催化清除组织细胞及抗原成分的作用，有效减少化学试剂如酸碱试剂等对蛋白质结构和矿物质的破坏，保持了异种骨支架的高力学强度，并同时达到外科植入级的标准；进一步的，本发明提供的方法制备时间显著缩短，较传统的异种骨清洗工艺能够缩短数天。

Description

一种高强度植入级骨材料的制备方法
技术领域
本发明涉及骨移植技术领域，特别涉及一种高强度植入级骨材料的制备方法。
背景技术
针对由外伤、肿瘤等原因引起的骨缺损等情况，骨移植是常用的治疗方法。根据骨移植的材料可分为自体骨移植、同种异体骨移植和异种骨移植，其中自体骨和同种异体骨取材有限，而异种骨容易获得，来源广泛，并且哺乳动物源性异种骨是与人骨组织结构相似的天然支架材料，具有骨传导和骨诱导活性，使用异种骨作为骨移植材料，可以解决同种骨来源受限的问题。
异种骨具有明确的免疫原性，异种骨骨材料的制备主要是异种骨的处理，通过处理减少或去除异种骨中的抗原成分，降低异种骨移植引起的排斥反应。目前，常规的异种骨植骨材料处理方法都需要用到高强度的化学试剂(氢氧化钠等)长时间的处理，以去除材料中高浓度的异种细胞和强抗原成分，但是在处理的同时也会破坏骨材料中的胶原蛋白和矿物质结构，最终所得骨材料大部分都强度较低、承重不足。
发明内容
本发明目的在于提供一种高强度植入级骨材料的制备方法，利用本发明的方法对异种骨进行处理，不会对蛋白质结构和矿物质产生破坏，所得植入级骨材料具有较高的强度。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
一种高强度植入级骨材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)使用第一处理液对异种骨进行第一处理，得到第一处理后的异种骨；所述第一处理液中包括等离子活化水和表面活性剂；
(2)使用第二处理液对第一处理后的异种骨进行第二处理，得到第二处理后的异种骨；所述第二处理液中包括等离子活化水和双氧水；
(3)使用第三处理液对第二处理后的异种骨进行第三处理，得到第三处理后的异种骨；所述第三处理液中包括等离子活化水和酒精；
(4)使用第四处理液对第三处理后的异种骨进行第四处理，得到高强度植入级骨材料；所述第四处理液中包括等离子活化水和A-GAL蛋白酶。
优选的，所述第一处理液中表面活性剂的质量浓度为0.1～0.4％；
所述表面活性剂包括Triton试剂、脱氧胆酸钠和十二烷基磺酸钠中的一种或几种。
优选的，所述第一处理的时间为0.5～2h。
优选的，所述步骤(2)中双氧水的质量浓度≤1％；所述等离子活化水和双氧水的体积比为1:0.5～1。
优选的，所述第二处理的时间为0.5～2h。
优选的，所述步骤(3)中酒精的体积浓度为65～75％；所述等离子活化水和酒精的体积比为1:0.5～1。
优选的，所述第三处理的时间为0.5～2h。
优选的，所述第四处理液中A-GAL蛋白酶质量浓度为5～15U/mL。
优选的，所述第四处理的时间为0.5～1.5h。
优选的，所述第一处理液、第二处理液、第三处理液和第四处理液中等离子活性水的体积和异种骨的质量之比独立地为3～10mL:1g。
本发明提供了一种高强度植入级骨材料的制备方法，其中依次使用包括等离子活化水和表面活性剂的第一处理液、包括等离子活化水和双氧水的第二处理液、包括等离子活化水和酒精的第三处理液和包括等离子活化水和A-GAL蛋白酶的第四处理液对异种骨进行处理，处理后得到高强度植入级骨材料。本发明提供的方法利用等离子活化水提供高活性的分子作用环境和介质，起到催化清除组织细胞及抗原成分的作用，有效减少化学试剂如酸碱试剂等对异种骨蛋白质结构和矿物质的破坏，保持了异种骨支架的高力学强度，并同时达到外科植入级的标准；进一步的，本发明提供的方法制备时间显著缩短，较传统的异种骨清洗工艺能够缩短数天。实施例结果表明，本发明的方法制备得到的骨材料强度可达到21.4±3.8MPa，而传统方法处理后的骨材料强度仅为3.5±1.2MPa，并且本发明制备方法得到的骨材料免疫原性检测与阴性对照无明显差异。
附图说明
图1为新鲜牛骨染色切片后的光学显微镜图；
图2为对比例1处理后的骨材料染色切片后的光学显微镜图；
图3为实施例1处理后的骨材料染色切片后的光学显微镜图；
图4为免疫原性分析中阳性对照组、阴性对照组和实验组的淋巴细胞还原率。
具体实施方式
本发明提供了一种高强度植入级骨材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)使用第一处理液对异种骨进行第一处理，得到第一处理后的异种骨；所述第一处理液中包括等离子活化水和表面活性剂；
(2)使用第二处理液对第一处理后的异种骨进行第二处理，得到第二处理后的异种骨；所述第二处理液中包括等离子活化水和双氧水；
(3)使用第三处理液对第二处理后的异种骨进行第三处理，得到第三处理后的异种骨；所述第三处理液中包括等离子活化水和酒精；
(4)使用第四处理液对第三处理后的异种骨进行第四处理，得到高强度植入级骨材料；所述第四处理液中包括等离子活化水和A-GAL蛋白酶。
本发明对所述异种骨没有特殊要求，骨移植常用的异种骨均可使用本发明的方法处理，具体的如猪骨、牛骨或羊骨等。
在本发明中，所述等离子活化水优选通过对水进行等离子体处理后得到；所述水优选为去离子水；本发明优选使用等离子射频电场对水进行等离子体处理；所述等离子体处理的时间优选为1～5min，功率优选为60～80W；本发明对产生等离子射频电场的装置没有特殊要求，使用本领域技术人员熟知的装置即可。对水进行等离子体处理后，水中产生大量的活性物质(羟基自由基、氢自由基等)，本发明利用等离子体自由基含量较高的特点，为异种骨的处理过程提供高活性的分子作用环境，加快反应进程，催化清除异种骨的组织细胞及抗原成分。
本发明使用第一处理液对异种骨进行第一处理，得到第一处理后的异种骨。在本发明中，所述第一处理液中包括等离子活化水和表面活性剂；所述第一处理液中表面活性剂的质量浓度优选为0.1～0.4％，更优选为0.1～0.2％；所述表面活性剂优选包括Triton试剂、脱氧胆酸钠和十二烷基磺酸钠中的一种或几种；所述Triton试剂优选包括TritonX-100(聚乙二醇辛基苯基醚)或TritonX-114(聚氧乙烯单叔辛基苯基醚)；所述第一处理的时间优选为0.5～2h，更优选为0.5～1h，最优选为0.5h；在本发明中，所述表面活性剂起到清除异种骨表面脂质和细胞抗原的作用，并且由于等离子活性水具有较高的活性，能够促进表面活性剂对异种骨表面脂质和细胞抗原的反应，因而在较低浓度下进行短时间的处理即可达到清除效果，减小了对组织的损伤，在本领域的常规异种骨处理工艺中，一般需要使用高浓度表面活性剂处理72h，本发明的方法大大缩短了处理时间。
第一处理完成后，本发明使用第二处理液对第一处理后的异种骨进行第二处理，得到第二处理后的异种骨。在本发明中，所述第二处理液中包括等离子活化水和双氧水；所述双氧水的质量浓度优选≤1％，更优选为0.3～1％，进一步优选为0.3％；所述等离子活性水和双氧水的体积比优选为1:0.5～1，更优选为1:0.6～1，进一步优选为1:1；所述第二处理的时间优选为0.5～2h，更优选为0.5～1h，最优选为0.5h。在本发明中，所述双氧水起到清除抗原成分的作用，并且本发明使用的双氧水浓度低，处理时间短，在有效清除抗原成分的同时不会对异种骨中的胶原蛋白和矿物质产生破坏，因而可以保留较高的骨强度。
第二处理完成后，本发明使用第三处理液对第二处理后的异种骨进行第三处理，得到第三处理后的异种骨。在本发明中，所述第三处理液中包括等离子活化水和酒精；所述酒精的体积浓度优选为65～75％，更优选为70％；所述等离子活化水和酒精的体积比优选为1:0.5～1，更优选为1:0.6～1，进一步优选为1:1。本发明通过第三处理清除第一处理和第二处理中的试剂残留。
第三处理完成后，本发明使用第四处理液对第三处理后的异种骨进行第四处理，得到高强度植入级骨材料。在本发明中，所述第四处理液中包括等离子活化水和A-GAL蛋白酶；所述第四处理液中A-GAL蛋白酶的质量浓度优选为5～15U/mL，更优选为5U/mL；所述第四处理的时间优选为0.5～1.5h，更优选为0.5～1h，最优选为0.5h；在本发明中，A-GAL蛋白酶能够去除异种骨中的A-GAL抗原，进一步降低异种骨移植时的排斥反应。在本发明中，等离子活化水中存在大量不同电荷的自由基，能够促进A-GAL蛋白酶和抗原的作用，因而本发明在较短时间内即可完成A-GAL抗原的清除，传统的异种骨处理工艺中一般需要使用A-GAL蛋白酶对异种骨处理72h，本发明的方法大大缩短了处理时间，减小了对组织的损伤。第四处理完毕后，即得到本发明的高强度植入级骨材料，本发明得到的高强度植入级骨材料抗压强度能够达到21.4±3.8MPa。
在本发明中，所述第一处理液、第二处理液、第三处理液和第四处理液中等离子活性水的体积和异种骨的质量之比优选为3～10mL:1g，更优选为4～6mL：1g，进一步优选为5mL：1g。本发明对所述第一处理、第二处理、第三处理和第四处理的具体方式没有特殊要求，将异种骨浸没在处理液中进行处理即可。
下面结合实施例对本发明提供的方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
下述实施例及对比例中使用的异种骨均为牛骨。
实施例1
使用等离子射频电场对去离子水进行等离子体处理，处理时间为2min，功率为70W；得到等离子活性水；使用等离子活性水配制处理液，对牛骨进行处理，步骤如下：
(1)将等离子活性水和十二烷基磺酸钠混合，控制十二烷基磺酸钠的质量百分含量为0.1％，得到第一处理液，使用第一处理液处理牛骨0.5h；
(2)将等离子活性水和1wt.％的双氧水以体积比1:1混合，得到第二处理液，使用第二处理液处理牛骨0.5h；
(3)将等离子活性水和体积浓度70％的酒精以体积比1:1混合，得到第三处理液，使用第三处理液处理牛骨0.5h；
(4)将等离子活性水和A-GAL蛋白酶混合，得到第四处理液，控制第四处理液中A-GAL蛋白酶的质量浓度为5U/mL，使用第四处理液处理牛骨0.5h，处理完毕后，得到高强度植入级骨材料。
步骤(1)～(4)中，等离子活性水的体积和牛骨的质量比为5mL：1g。
实施例2
其他步骤和实施例1相同，仅将步骤(1)中的表面活性剂替换为脱氧胆酸钠。
实施例3
其他步骤和实施例1相同，仅将步骤(1)中十二烷基磺酸钠的质量百分含量为0.4％。
实施例4
其他步骤和实施例1相同，仅将步骤(2)中双氧水的质量浓度改为0.3wt.％。
实施例5
其他步骤和实施例1相同，仅将步骤(1)～(4)的处理时间改为1h；
实施例6
其他步骤和实施例1相同，仅将步骤(1)～(4)的处理时间改为1.5h。
实施例7
其他步骤和实施例1相同，仅将步骤(1)～(3)的处理时间改为2h。
对比例1
采用本领域常规方法处理异种骨，实验中使用和实施例1相同部位、相同尺寸的牛骨进行处理，配制处理液所用水为去离子水，具体处理步骤如下：
将牛骨处理浸泡在十二烷基磺酸钠溶液(质量浓度为1％)处理72h(脱脂)；使用双氧水溶液(双氧水质量浓度为30％)处理8h(脱蛋白)，最后使用A-GAL蛋白酶液(浓度为30U/mL)处理72h(脱A-GAL)，得到处理后的异种骨。
细胞残留测试
使用苏木素-伊红染色法(HE染色法)对新鲜牛骨、实施例1处理后的牛骨和对比例1处理后的牛骨进行处理，主要处理步骤如下：
(1)将标本浸没于10％甲醛溶液中(配方如下：36％甲酸溶液25mL，蒸馏水225mL)72小时；
(2)1mol/L盐酸溶液脱钙12小时；
(3)使用乙醇逐级脱水，然后进行二甲苯透明和石蜡包埋；
(4)不连续切片、苏木素-伊红染色；
(5)光学显微镜下观察，拍照。
所得结果如图1～3所示，其中图1为新鲜牛骨的光学显微镜图；图2为对比例1所得骨材料的光学显微镜图，图3为实施例1所得骨材料的光学显微镜图。根据图1～3可以看出：和新鲜牛骨相比，对比例1中的方法(传统方法)去除了大部分异种细胞，但仍有部分残留，而实施例1所得骨材料中异种细胞基本被完全去除。
对实施例2～7所得骨材料进行相同的检测，所得结果和实施例1相似，骨细胞基本被完全去除。
抗压强度测试：
使用RGT-20A微机控制电子万能材料试验机检测样品的抗压性能，试验条件为室温，湿度为30％，加载速度为5mm/min，试样尺寸为5mm*5mm*5mm，每组5个试样，分别测试实施例1～7及对比例1处理前后牛骨的抗压强度，实验结果用
Figure GDA0002567825550000071
表示，所得结果如表1所示：
表1实施例1～7及对比例1处理前后牛骨强度
项目 处理前牛骨抗压强度(MPa) 处理后牛骨抗压强度(MPa)
实施例1 28±1.6 21.4±3.8
实施例2 28±3.1 21.2±2.5
实施例3 27±1.6 20.5±1.2
实施例4 28±3.4 20.1±3.0
实施例5 25±2.2 18.4±2.1
实施例6 26±3.3 19.2±1.1
实施例7 25±1.6 18.1±1.8
对比例1 27±3.6 3.5±1.2
根据表1可以看出，实施例1～7处理后的骨材料均保持了较高的力学强度，而对比例1处理后的骨材料抗压强度仅为3.5±1.2MPa，强度大幅降低。
免疫原性分析
淋巴细胞转化实验作为测定机体免疫功能的重要实验，可以反映机体的细胞免疫水平。实验采用实施例1和对比例1制备的骨材料与人的淋巴细胞体外共同培养，通过检测淋巴细胞转化率的高低来说明组织材料能否引起淋巴细胞的变化，从而证明骨材料是否存在一定的免疫原性作用。
主要仪器及试剂：酶标仪、96孔板离心机、淋巴细胞计数仪、AlamarBlue、植物血球凝集素、淋巴细胞分离液、胎牛血清、L-谷氨酰胺、PBS缓冲液；
实验材料的准备：按要求准备对照和实验材料(均选用粉状样品，粒径200目，将处理后的骨材料粉碎后得到)待用；在无菌超净台内称质量分装；
实验分组：实验分为阳性对照组、阴性对照组和实验组，其中阳性对照组为植物血球凝集素，阴性对照组为对比例1制备的骨材料，实验组为实施例1制备的骨材料。
淋巴细胞的分离：将10支装有不同个体的4mL新鲜抗凝全血分别加入到装有4mL生理盐水的离心管内混匀，再分别将稀释全血加入到装有等量(4mL)淋巴细胞分离液的离心管内，在800g，20℃下离心30min，吸出中间层的淋巴细胞置于已标记好编号的10支离心管内，并加PBS缓冲液至10mL，混匀，540g离心10min，弃去上清，底层为淋巴细胞。各管内加含体积分数为10％胎牛血清的RPMI1640完全培养液至1.5mL，混匀悬浮细胞，使用4g/L锥虫蓝染色，测定细胞活性达95％以上。分别取100μL细胞悬液加入到有10mL电解液样品杯中，应用细胞计数仪进行计数，计数后将原细胞悬液浓度用含体积分数为10％胎牛血清的RPMI1640完全培养液调整为2×109L-1，待用。
淋巴细胞转化实验：①阳性对照组：人淋巴细胞与植物血球凝集素混合培养。②阴性对照组：人淋巴细胞与对比例1所得骨材料混合培养。③实验组:人淋巴细胞与实施例1所得骨材料混合培养；
与淋巴细胞混合培养的具体步骤如下：
材料混匀：向已经称重好的实验样品(即实施例1和对比例1制备的骨材料)中加入体积分数为10％胎牛血清及10g/L谷氨酰胺的RPMI1640培养液，振荡仪混匀，使骨材料的浓度分别为2g/L，使用前经振荡仪振荡使其完全分散均匀；
接种：按照上述分组在96孔板由上到下每一横排孔内分别加入实验材料悬液(2g/L)，植物血球凝集素(0.18g/L)，各100μL；再分别依次加入制备好的不同样本的淋巴细胞悬液100μL，每个样本的每个组设3个复孔，加板后最终使得板内实验样品的终浓度为1g/L，植物血球凝集素的终浓度为0.09g/L；于37℃、体积分数为5％CO2温箱中培养48h，再向除对照孔外各孔加入20μL的Alamarblue(阿尔玛蓝)，继续培养24h。
酶标仪测吸光度值：培养完成后取各孔悬液于离心机内3000r/min，4℃，离心10min，分别取上清150μL转移至新的96孔板相应位置后，在酶标仪570nm，600nm双波长下读取吸光度值，以计算细胞还原率(即AlamarBlue还原率)，即代表淋巴细胞转化率，从而分析淋巴细胞增殖的情况。
AlamarBlue还原率按照式I进行计算：
AlamarBlue还原率(％)＝(A570nm-A600nm×R)×100％式I；
式I中：R＝(Mab570nm-M570nm)/(Mab600nm-M600nm)；
A指吸光度值；Mab指的是培养液加Almarblue的吸光度值；M指培养液的吸光度值；R为校正系数。
使用SPSS
Figure GDA0002567825550000091
统计软件处理，实验结果用
Figure GDA0002567825550000092
表示，两组均数间比较采用两独立样本t检验；多个样本均数之间比较采用方差分析，以P<0.05认为差异有显著性意义；所得结果见图4，相关数据见表2。
表2淋巴细胞还原率
Figure GDA0002567825550000093
此外，统计结果显示实验组和阴性对照组相比具有显著性差异(P<0.05)，说明本发明的方法能够显著降低异种骨的抗原性，所得骨材料免疫原性低，能够达到外科植入级的标准，且效果优于传统方法。
对实施例2～7所得骨材料进行相同的免疫原性检测，所得结果相似，均显示处理后的骨材料具有较低的免疫原性。
由以上实施例可知，本发明提供的方法利用等离子活化水提供高活性的分子作用环境和介质，能够有效减少化学试剂如酸碱试剂等对蛋白质结构和矿物质的破坏，保持异种骨支架的高力学强度，同时能有效去除异种骨表面抗原，达到外科植入级的标准，且本发明提供的方法制备时间显著缩短，提高了制备效率。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种高强度植入级骨材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)使用第一处理液对异种骨进行第一处理，得到第一处理后的异种骨；所述第一处理液中包括等离子活化水和表面活性剂；
(2)使用第二处理液对第一处理后的异种骨进行第二处理，得到第二处理后的异种骨；所述第二处理液中包括等离子活化水和双氧水；
(3)使用第三处理液对第二处理后的异种骨进行第三处理，得到第三处理后的异种骨；所述第三处理液中包括等离子活化水和酒精；
(4)使用第四处理液对第三处理后的异种骨进行第四处理，得到高强度植入级骨材料；所述第四处理液中包括等离子活化水和A-GAL蛋白酶；
所述第一处理液、第二处理液、第三处理液和第四处理液中等离子活性水的体积和异种骨的质量之比独立地为3～10mL:1g。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述第一处理液中表面活性剂的质量浓度为0.1～0.4％；
所述表面活性剂包括Triton试剂、脱氧胆酸钠和十二烷基磺酸钠中的一种或几种。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述第一处理的时间为0.5～2h。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中双氧水的质量浓度≤1％；所述等离子活化水和双氧水的体积比为1:0.5～1。
5.根据权利要求1或4所述的制备方法，其特征在于，所述第二处理的时间为0.5～2h。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中酒精的体积浓度为65～75％；所述等离子活化水和酒精的体积比为1:0.5～1。
7.根据权利要求1或6所述的制备方法，其特征在于，所述第三处理的时间为0.5～2h。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述第四处理液中A-GAL蛋白酶质量浓度为5～15U/mL。
9.根据权利要求1或8所述的制备方法，其特征在于，所述第四处理的时间为0.5～1.5h。
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AU2001288585A1 (en) * 2000-08-30 2002-03-13 Wallace K. Dyer Methods and compositions for tissue augmentation
CN1230209C (zh) * 2003-11-05 2005-12-07 中国人民解放军第三军医大学野战外科研究所 一种异种脱细胞骨基质材料及制备方法
CN100496623C (zh) * 2006-06-14 2009-06-10 中国人民解放军第三军医大学第一附属医院 异种脱蛋白骨支架材料及其制备方法
WO2008127135A1 (fr) * 2007-04-11 2008-10-23 Olexandr Borisovich Zayika Procédé de traitement de l'eau et de solutions aqueuses par plasma de décharge gazeuse et dispositif de mise en oeuvre de ce procédé
WO2013138449A1 (en) * 2012-03-14 2013-09-19 Armour Technologies, Inc. Sterile site apparatus, system, and method of using the same
US9339572B2 (en) * 2013-03-15 2016-05-17 EP Technologies LLC Methods and solutions for killing or deactivating spores
US20170128906A1 (en) * 2015-11-09 2017-05-11 EP Technologies LLC Method and system for creating large volumes of highly concentrated plasma activated liquid using cold plasma
CN105999413A (zh) * 2016-06-13 2016-10-12 深圳市光明创博生物制品发展有限公司 一种制备骨诱导成骨制剂的方法
EP3415069A1 (en) * 2017-06-16 2018-12-19 Sanhua AWECO Appliance Systems GmbH Plasma activated water for disinfecting home appliances
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