CN111110704A - 一种益生菌菌剂、滴剂及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种益生菌菌剂、滴剂及其制备方法和应用。所述益生菌菌剂包含小牛葡萄球菌和两歧双歧杆菌，所述滴剂包含所述益生菌菌剂和苍耳子提取物。该菌剂和滴剂制备方法简单，菌剂制备成固体形式，可以有效保持菌剂的活菌数；该滴剂抗氧化性好，储存更稳定。该滴剂中益生菌和苍耳子可以发挥协同作用，利于益生菌黏附定植；采用呼吸道给药，可使益生菌深入呼吸道深处，起效迅速。

Description

一种益生菌菌剂、滴剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种益生菌菌剂、滴剂及其制备方法和应用，尤其涉及一种可制备为治疗呼吸道疾病药物的益生菌菌剂、滴剂及其制备方法和应用。

背景技术

人体呼吸道作为与外界的通道，是微生物的栖息地。传统观点认为下呼吸道是无菌的，近年来随着技术手段的进步，在下呼吸道乃至肺部都发现了丰富多样的菌群。微生物对于上下呼吸道的健康至关重要，呼吸道不同部位的共生菌群是抵御呼吸道病原体感染、过度生长和入侵的第一道防线。一旦呼吸道菌群结构遭到破坏，致病菌和条件致病菌就会大量繁殖，造成菌群失衡，导致呼吸道疾病发生。

受空气污染和雾霾的影响，呼吸道疾病久居不下，呼吸道疾病等传统用药一般为激素或抗组胺制品，长期使用可造成依赖性，反而会加剧呼吸道菌群失调，造成疾病反复发作。过早过度的使用抗菌药物，还会降低肠道菌群的多样性，进而导致免疫系统失衡，抗过敏反应能力削弱。

传统方法使用益生菌在治疗儿童反复呼吸道感染时药效较慢，这和多使用口服的补给方式也有关系，而且多选用调整肠道功能的菌种，而呼吸道和肠道是相对独立的系统，只有在鼻咽喉有交汇。肠道补充益生菌改善呼吸道炎症的机理，一是通过脑肠轴调节呼吸道，其路径长、见效慢；二是补充的肠道益生菌通过鼻咽喉交汇处迁移到呼吸道，虽然是直接用药、但是损耗很大。

传统中药中苍耳子可用于治疗鼻炎，有防风止痛，祛湿杀虫之效，但其具有一定的毒性，所含毒性成分较多，有毒蛋白、苍苷、毒苷等，主要作用于肝脏和胃肠，经鼻咽喉进入肠道，可引起一定的肠道菌群失调导致的不适，甚至使菌群屏障损伤导致肝肾毒性。因此，苍耳子在临床使用中受到一定限制。

发明内容

发明目的：本发明的第一目的是提供一种易于保存和使用方便的益生菌菌剂；第二目的是提供一种作用更直接和显著的益生菌滴剂；第三目的是提供一种所述益生菌菌剂、滴剂的制备方法；第四目的是提供所述益生菌菌剂、滴剂在制备治疗呼吸道疾病药物中的应用。

技术方案：本发明的益生菌菌剂包含小牛葡萄球菌和两歧双歧杆菌。

优选，所述两歧双歧杆菌的活菌数为总菌数的50～80％，小牛葡萄球菌的活菌数为总菌数的20～50％。

优选，所述益生菌菌剂的总菌数不低于10⁸cfu/g。

其中，小牛葡萄球菌的活菌数为10⁸～10¹¹cfu/g，两歧双歧杆菌的活菌数为10⁸～10¹¹cfu/g。

本发明的小牛葡萄球菌可以定植在上呼吸道，两歧双歧杆菌可以定植在下呼吸道，俩者在黏附、定植和排斥有害菌上有很好的补充协同作用，共同调节呼吸道健康。本发明的益生菌均在可食用菌种名单中，属于鼻炎喉处共有菌群，安全可靠，长期使用无毒副作用。

本发明的益生菌滴剂包含所述益生菌菌剂和苍耳子提取物。

优选，以质量分数计所述益生菌滴剂包含10～30％的所述益生菌菌剂和70～90％的苍耳子提取物。

优选，所述苍耳子提取物为苍耳子的芝麻油提取物，其中芝麻油的水活度不高于0.2。

苍耳子在治疗致病菌和蚜虫等引起的呼吸道疾病的同时，也会造成肠胃和肝脏损害，益生菌对于胃肠有很好的保护作用，通过降低肝脏脂肪积累和氧化应激，抑制血液中转氨酶和内毒素的增加，降低肝脏中炎症因子的升高，可以有效预防修复肝损伤；此外，苍耳子对菌群失调造成的疾病易感、免疫低下等作用有限，益生菌和苍耳子联合使用，互为补充，可以拓宽有效人群，对于预后恢复也有较好作用，避免反复感染。

苍耳子的抑菌性对于呼吸道菌群有一定抑制，使用后会使作用靶点菌群密度降低，从而使本发明的益生菌在定植过程中遇到的拮抗力相对较低，利于黏附定植。本发明的益生菌对苍耳子有一定的耐受性，在长期储藏过程中有较好的稳定性。

本发明所选用的芝麻油是益生菌的良好载体，比起其他油脂，有更优良的抗氧化性，在长期的货架期内，具有更好的稳定性；芝麻油滴入鼻腔后，迅速挥发，在呼吸道弥漫，夹带着益生菌气溶胶，深入呼吸道深处，益生菌也随之黏附定植在粘膜上，调整菌群结构，维护呼吸道健康；相比较固体制剂，芝麻油滴剂使用更方便快捷，减少了溶剂溶解环节，也避免了可能存在的污染。

本发明的益生菌滴剂的制备方法，包括以下步骤：

(1)益生菌培养；

(2)益生菌冻干；

(3)将步骤(2)制备的益生菌冻干粉粉碎、过筛；

(4)将步骤(3)过筛后的各益生菌菌粉混合，制备得到益生菌菌剂；

(5)苍耳子提取物制备；

(6)将步骤(4)制备的益生菌菌剂与步骤(5)制备的苍耳子提取物混合即得。

优选，步骤(5)苍耳子提取物的制备方法为将2～5质量份的苍耳子加入10质量份的芝麻油中，煎炸至枯干，滤取油状物即得。

步骤(3)的粉碎工序在低温下进行，有利于在该工序保持益生菌的活性；粉碎后过筛目数优选为80目，所得益生菌菌粉的粒度利于各菌粉之间均匀混合，制备所得的益生菌菌剂可均匀分散于苍耳子提取物中，形成均匀体系，并且该粒度更利于益生菌黏附定植，发挥疗效。

本发明的制备方法简便易行，将益生菌菌剂制备成粉末形式，易于保持菌剂中的活菌数；以芝麻油作为载体，使滴剂有更优良的抗氧化性，在长期的货架期内，具有更好的稳定性。

本发明的益生菌菌剂在制备治疗呼吸道疾病药物中的应用。

本发明的益生菌滴剂在制备治疗呼吸道疾病药物中的应用。

本发明的滴剂直接在呼吸道补充益生菌，所选用的益生菌为呼吸道优势菌群之一，可有效定植在呼吸道；将益生菌添加在芝麻油中，芝麻油具有很好的挥发性，可在蔓延到呼吸道深处，夹带着益生菌气溶胶，从而在病灶深处定植，起效快，能够有效发挥作用。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：

(1)益生菌菌剂安全可靠，可长期使用；

(2)益生菌滴剂易保持活性，货架期稳定，各成分发挥协同作用，治疗效果显著，起效迅速，使用方便；

(3)制备方法简便易行，原材料易得；

(4)采用呼吸道给药，可使益生菌在呼吸道上有效定植，起效迅速，作用更直接有效，所用益生菌为鼻咽喉共有菌株，适应力强，可有效缓解鼻炎、支气管炎等呼吸道疾病症状，配合其他药品使用也有良好的预后效果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步说明。

实验材料：

小牛葡萄球菌为小牛葡萄球菌ATCC 51145，两歧双歧杆菌为两歧双歧杆菌BB-G90，菌株均购于润盈生物有限公司；培养基为MARS培养基，购于青岛海博；芝麻油购于益海嘉里金龙鱼粮油食品股份有限公司，压榨法制取，水活度不高于0.2。

实验设备：

MIR-253生化培养箱(日本Sanyo公司)，GFL002恒温水浴箱(德国GFL公司)，GL10MA冷冻离心机(盐城凯特公司)，TF-SFD冷冻冻干机(上海田枫实业)。

实施例1：益生菌滴剂的制备

(1)益生菌的培养：选用二次活化的益生菌接种到培养基中进行培养20～50小时，所述益生菌为小牛葡萄球菌和两歧双歧杆菌，接种量为5％～10％；

(2)益生菌的冻干：将培养后的益生菌使用离心的方法收集菌体，冻干，水分低于5％，冻干粉在-18℃冰箱中备用；

(3)将益生菌冻干粉在低温下粉碎、过80目筛；

(4)将各益生菌菌粉按如下总菌数占比进行混合，即得益生菌菌剂；

益生菌	总菌数占比(％)
		小牛葡萄球菌	50
两歧双歧杆菌	50

(5)苍耳子提取物制备：4质量份的苍耳子，去刺，轻轻捶破，放入小锅内，加入10质量份的芝麻油，文火煎炸苍耳子，待苍耳子炸枯时，滤取药油，放至40℃以下备用；

(6)将步骤(4)制备的益生菌菌剂与步骤(5)制备的苍耳子提取物按照如下质量分数混合，即得益生菌滴剂。

组分	质量分数(％)
		益生菌菌剂	10
苍耳子提取物	90

实施例2

与实施例1的区别在于益生菌菌剂和益生菌滴剂组成分别如下，苍耳子提取物制备方法为将2质量份的苍耳子加入10质量份的芝麻油中，煎炸至枯干，滤取油状物即得。

(1)益生菌菌剂

益生菌	总菌数占比(％)
		小牛葡萄球菌	20
两歧双歧杆菌	80

(2)益生菌滴剂

组分	质量分数(％)
		益生菌菌剂	30
苍耳子提取物	70

实施例3

与实施例1的区别在于益生菌菌剂和益生菌滴剂组成分别如下，苍耳子提取物制备方法为将5质量份的苍耳子加入10质量份的芝麻油中，煎炸至枯干，滤取油状物即得。

(1)益生菌菌剂

(2)益生菌滴剂

组分	质量分数(％)
		益生菌菌剂	20
苍耳子提取物	80

对比例1

与实施例1的区别在于益生菌菌剂组成如下：

益生菌	总菌数占比(％)
		小牛葡萄球菌	60
两歧双歧杆菌	40

对比例2

与实施例1的区别在于益生菌菌剂组成如下：

(1)益生菌菌剂

益生菌	总菌数占比(％)
		小牛葡萄球菌	10
两歧双歧杆菌	90

对比例3

与实施例1的区别在于益生菌滴剂组成如下：

组分	质量分数(％)
		益生菌菌剂	5
苍耳子提取物	95

对比例4

与实施例1的区别在于益生菌滴剂组成如下：

组分	质量分数(％)
		益生菌菌剂	40
苍耳子提取物	60

实施例4：益生菌滴剂对鼻炎的效果评价

(1)实验材料

甲苯-2,4-二异氰酸甲苯酯(TDI)，橄榄油均购于国药集团化学试剂公司；乌拉坦购于国药集团化学试剂公司；甲醛购于西陇化工股份有限公司；豚鼠组胺ELISA检测试剂盒购于上海锐谷生物科技有限公司；益生菌胶囊(丹尼斯可美国公司，5×10⁹cfu/粒，25％嗜酸乳杆菌NCFM ATCC SD5221和75％乳双歧杆菌B1-07 ATCC SD5220)。

(2)模型判定

以体征和鼻部症状为主要观察指标，从给致敏药开始，依据鼻痒、喷嚏、流涕等出现的次数多少、时间长短、轻重程度为评分标准并记录评分。鼻痒轻度：轻擦鼻几次，记1分；重度：抓挠鼻、面不止，到处磨擦记2分。喷嚏：1～3个为1分，4～10个为2分，11个以上为3分。流涕：流至鼻前孔为1分，超过鼻前孔为2分，流涕满面为3分。其症状观察时间为每次给致敏物后20min内，并详细记录观察时间内的擦鼻次数及喷嚏次数。各症状记分叠加，总分数达到5分者为造模成功。

(3)变应性鼻炎豚鼠模型建立

将10只健康豚鼠为空白对照组，均雌雄各半，另外110只豚鼠用TDI橄榄油溶液处理。6％TDI橄榄油溶液10μL，用加样器滴入豚鼠双侧鼻孔(每侧5μL)，连续用7d，每日一次，模型判定成功后，改为每隔两日维持给6％TDI橄榄油溶液1次，每鼻侧5μL，直至观察药物结束；空白对照组，与造模组平行给药，仅给橄榄油滴入两侧鼻孔内，每侧每日5μL，判定模型是否成功。

(4)分组及给药

选取90只造模成功豚鼠随机分成9组，根据各动物的造模评分分数用Excel表进行随机区组分组，分为对照组、口服益生菌组、实施例1～3及对比例1～4的益生菌滴剂组，共9组，遵循雌雄各半原则。益生菌滴剂组以相应配方益生菌滴剂滴鼻，每次每只每鼻侧5μL，每日2次，连续8d；对照组以空白芝麻油滴鼻，每次每只每鼻侧5μL，每日2次，连续8d；口服益生菌组口服益生菌胶囊，每次每只1粒，每日2次，连续8d。

(5)项目观察

以体征和鼻部症状为主要观察指标，依据鼻痒、喷嚏、流涕等出现的次数多少、时间长短、轻重程度为评分标准并记录评分。鼻痒轻度：轻擦鼻几次，记1分；重度：抓挠鼻、面不止，到处磨擦记2分。喷嚏：1～3个为1分，4～10个为2分，11个以上为3分。流涕：流至鼻前孔为1分，超过鼻前孔为2分，流涕满面为3分。其症状观察时间为每次给致敏物后20min内，并详细记录观察时间内的擦鼻次数及喷嚏次数。鼻部症状的改善情况统计各组动物给药前后抓鼻次数、喷嚏次数及总评分，对各组给药后总评分进行组间比较。各动物于第8天给药后1h用6％TDI橄榄油溶液滴鼻致敏1次，每只每鼻侧5μL，并立即观察症状，结果见表1。

(6)血清组胺的测定

观察豚鼠的症状后，用25％乌拉坦在其腹腔注射进行全麻、消毒腹部、沿腹正中线切开、暴露腹主动脉、取血3mL，在3000r·min^-1条件下离心10min，提取血清样品。用检测豚鼠血清组胺含量的专用试剂盒，用双抗夹心EI ASA方法测定，用酶标仪在波长450nm处读OD值并绘制标准曲线。根据样品的OD值、标准曲线计算豚鼠血清样品组胺的含量，结果见表2。

表1豚鼠鼻部症状改善情况

表2豚鼠给药后血清组胺含量

组别	血清组胺含量(mg·L<sup>-1</sup>)
		对照组	12.1±2.1
口服益生菌组	8.1±1.6
		实施例1	5.5±2.0
实施例2	5.7±2.2
		实施例3	5.7±2.3
对比例1	6.8±1.5
		对比例2	7.1±1.8
对比例3	7.2±1.7
		对比例4	7.5±2.0

由表1和表2可见，与对照组和口服益生菌组相比，本发明的益生菌滴剂能显著减少慢性鼻炎模型动物的抓鼻次数和喷嚏次数，也能显著降低模型动物的血清组胺含量，疗效显著；与对比例的益生菌滴剂相比，本发明的益生菌滴剂疗效更显著，因此本发明的益生菌滴剂的组分和配比是经过筛选得到的优选方案。

实施例5：益生菌滴剂对支气管炎的效果评价

(1)实验设备

GL10MA冷冻离心机(盐城凯特公司)，UV754紫外可见分光光度计(上海佑科仪器仪表有限公司)，PT-MR3100D组织匀浆机(瑞士Polytron公司)，ELISA试剂盒(上海酶联生物)。

(2)实验材料

脂多糖(LPS)购自美国Sigma公司，用无菌注射用水配成200μg/200μL。

(3)支气管炎大鼠模型建立

选择Wistar大鼠110只，鼠龄12周，体重270g±20g，实验第1、14天将大鼠用1％戊巴比妥钠麻醉，麻醉剂量为50mg/kg，仰卧固定，拉出舌头，使声门暴露，用静脉导管针套管将0.1％脂多糖200μL快速注入气管；从第2天开始，将110只大鼠分置在自制的2个100cm×60cm×40cm的烟室中，每个55只，用烟叶、刨花、锯末各10g及硫磺1.5g混匀，点燃熏烟，每次lh，每天2次，持续到第28天(第14天除外)，判定模型是否成功。

(4)分组及给药

模型判定成功后，取90只支气管炎大鼠，随机分成9组，雌雄各半。将以上造模成功的大鼠混合并随机分为对照组、口服益生菌组、实施例1～3及对比例1～4的益生菌滴剂组，共9组，遵循雌雄各半原则。益生菌滴剂组以相应配方益生菌滴剂滴鼻，每次每只每鼻侧5μL，每日2次，连续8d；对照组以空白芝麻油滴鼻，每次每只每鼻侧5μL，每日2次，连续8d；口服益生菌组口服益生菌胶囊，每次每只1粒，每日2次，连续8d。

(5)支气管肺泡灌洗液IL-13、TL-8、TNF-α的测定

将处死大鼠暴露气管及肺部，结扎右主支气管，用注射器在隆突上穿刺至左肺，用生理盐水反复灌洗左肺3次，每次2mL，回收灌洗液约4.5mL，3000r/min离心15min，按试剂盒说明测定IL-13、TL-8、TNF-α含量，结果见表3。

表3对慢性支气管炎大鼠支气管肺泡灌洗液IL-13、TL-8、TNF-α的影响

组别	IL-l3(μg·L<sup>-1</sup>)	IL-8(μg·L<sup>-1</sup>)	IL-α(μg·L<sup>-1</sup>)
				对照组	154.7±28.7	6.54±1.42	180.61±28.9
口服益生菌组	133.6±25.2	5.40±1.21	157.2±27.5
				实施例1	115.1±20.7	3.78±0.87	124.7±27.6
实施例2	110.7±22.4	3.69±0.91	122.5±30.1
				实施例3	116.5±27.2	3.65±1.01	130.4±28.7
对比例1	130.2±31.0	4.54±1.90	156.7±25.4
				对比例2	129.6±28.8	4.49±1.22	149.2±28.6
对比例3	127.6±24.9	4.23±0.98	147.6±24.9
				对比例4	125.9±28.4	4.37±0.93	142.5±23.8

由表3可见，与对照组和口服益生菌组相比，本发明的益生菌滴剂可明显降低慢性支气管炎模型大鼠肺组织IL-13、TL-8、TNF-α水平；与对比例的益生菌滴剂相比，本发明的益生菌滴剂疗效更显著，因此本发明的益生菌滴剂的组分和配比是经过筛选得到的优选方案。

Claims (10)

1.一种益生菌菌剂，其特征在于，所述益生菌菌剂包含小牛葡萄球菌和两歧双歧杆菌。

2.根据权利要求1所述的益生菌菌剂，其特征在于，所述两歧双歧杆菌的活菌数为总菌数的50～80％，小牛葡萄球菌的活菌数为总菌数的20～50％。

3.根据权利要求1所述的益生菌菌剂，其特征在于，所述益生菌菌剂的总菌数不低于10⁸cfu/g。

4.一种益生菌滴剂，其特征在于，所述益生菌滴剂包含所述益生菌菌剂和苍耳子提取物。

5.根据权利要求4所述的益生菌滴剂，其特征在于，以质量分数计所述益生菌滴剂包含10～30％的所述益生菌菌剂和70～90％的苍耳子提取物。

6.根据权利要求4所述的益生菌滴剂，其特征在于，所述苍耳子提取物为苍耳子的芝麻油提取物，其中芝麻油的水活度不高于0.2。

7.一种权利要求4所述的益生菌滴剂的制备方法，包括以下步骤：

(1)益生菌培养；

(2)益生菌冻干；

(3)将步骤(2)制备的益生菌冻干粉粉碎、过筛；

(4)将步骤(3)过筛后的各益生菌菌粉混合，制备得到益生菌菌剂；

(5)苍耳子提取物制备；

(6)将步骤(4)制备的益生菌菌剂与步骤(5)制备的苍耳子提取物混合即得。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)苍耳子提取物的制备方法为将2～5质量份的苍耳子加入至10质量份的芝麻油中，煎炸至枯干，滤取油状物即得。

9.一种权利要求1～3任一所述的益生菌菌剂在制备治疗呼吸道疾病药物中的应用。

10.一种权利要求4～8任一所述的益生菌滴剂在制备治疗呼吸道疾病药物中的应用。