CN111094319A - 乙酰胆碱受体结合肽 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及乙酰胆碱受体结合肽，更具体地，涉及一种与乙酰胆碱起作用的乙酰胆碱受体结合来阻断乙酰胆碱的分泌，从而表现出改善皱纹效果的新型的肽。本发明的肽与乙酰胆碱受体的结合强度高，与乙酰胆碱进行强力结合来抑制乙酰胆碱的分泌。因此，包含本发明所述的肽作为有效成分的化妆品组合物及药学组合物表现出突出的皱纹改善效果。
Description
技术领域
本发明涉及乙酰胆碱受体结合肽，更具体地，涉及一种与乙酰胆碱起作用的乙酰胆碱受体结合来阻断乙酰胆碱的分泌，从而表现出改善皱纹效果的肽。
背景技术
近来，对健康生活的关心持续增加，由于生活水平的提升、女性社会出镜率的增加、人口老龄化的加速等，消费者对化妆品的要求由妆扮美丽的要求逐渐转变为功能性用途的要求。
为了防止皮肤老化现象，保持更加健康的有弹性的皮肤，一直以来，开发具有改善皱纹效果的生理活性物质的研究活动都在孜孜不倦地进行着。其中具有代表性的，1995年作为用来改善光辐射老化皮肤的治疗剂的维甲酸(trans-retinoic acid)得到美国食品药品监督管理局(FDA)的许可，比它副作用更小的视网醇在上世纪九十年代中后期开始使用于化妆品原料，使得改善皱纹的化妆品开始正式上市。之后，类雌激素、从各种植物中提取的抗氧化剂等作为改善皱纹的原料引入化妆品中。
但这些化妆品原料中的大部分具有效能欠缺，或诱发皮肤副作用等的问题。并且，即使具有较好效能的化妆品原料，对皮肤作用的范围也有限，与大部分胶原带白合成促进、胶原蛋白分解抑制、活性氧去除之类的带给皮肤的功效类似，无法满足那些需求更加新型的、更加强力地、更加根本性地改善皱纹的顾客的要求。因此，以最新皮肤科学理论为基础探查新的皮肤老化机制，并对其进行阻断或迟滞的原料和技术的研究，在化妆品产业中如火如荼地进行着。
最近，将肽成分适用于化妆品来改善皮肤皱纹的研究正在活跃地进行着。肽(peptide)为由两个以上的氨基酸结合形成的物质，通过化学合成、酶促反应或蛋白质水解来制备。
另外，乙酰胆碱在末梢神经系里参与骨骼肌和平滑肌的运动，在大脑中会给学习和记忆带来影响。在运动神经和肌肉相遇处妨碍作为神经递质的乙酰胆碱的分泌，会抑制肌肉的收缩使其麻痹从而使皱纹得到舒展，利用该机制的一例为肉毒杆菌素。肉毒杆菌素能够阻断运动神经末端作为肌肉收缩必需物质的乙酰胆碱的分泌过程。其结果为肌肉无法运动，从而消除因肌肉而诱发的皱纹。
由此可以预想，若以此原理开发出抑制乙酰胆碱分泌的肽，可期对皮肤皱纹的改善及预防。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：韩国授权专利公报第10-0553174号
发明内容
技术问题
本发明的目的为提供一种通过与乙酰胆碱受体结合来抑制乙酰胆碱分泌的肽。
解决问题的手段
为达成上述目的，本发明的一方面提供一种乙酰胆碱受体结合肽，包含由下列通式1～通式6中一个通式表示的氨基酸序列：
通式1：WTWKG-Xn，
通式2：TWKG-Xn，
通式3：WKG-Xn，
通式4：KG-Xn，
通式5：G-Xn，
通式6：Xn，
其中，上述Xn表示由1～6个任一氨基酸构成的序列。
在本发明中，术语“肽(peptide)或其片段”指由通过酰胺键(或肽键)连接的2个以上的氨基酸形成的聚合物，依据本发明的目的，指表现出改善皱纹效果的肽或其片段。
本发明的肽或其片段可以包括靶向序列、标签(tag)、被标记的残基、以增加半衰期或肽的稳定性为特定目标而研发出的追加氨基酸序列。
本发明的肽或其片段可通过该领域公知的多种方法获得。具体来说，可利用遗传基因的重组和蛋白质表达系统来制备，或者在试管通过肽的合成之类化学合成的方法，以及无细胞蛋白质合成法等来制备。
更具体地，可通过该领域熟知的方法，举例来说，可通过自动肽合成器来合成，还可通过遗传基因的操作技术来制备，但并不局限于这些。举例来说，可通过遗传基因的操作对融合配偶体与由本发明的肽来担当的融合蛋白质进行编码，来制备融合遗传基因，对宿主微生物进行形质转换后，从宿主微生物表达出融合蛋白质形态后，使用蛋白质分解酶或化合物从融合蛋白质中对本发明的肽进行切割、分离，来制备所需的肽。为此，举例来说，可将对通过凝血因子Xa(Factor Xa)或肠激酶之类的蛋白质分解酶、溴化氰(CNBr)或羟胺之类的化合物进行切割的氨基酸残基进行编码的DNA序列插入于融合配偶体与本发明的肽遗传基因之间。
在本发明所述的通过与乙酰胆碱受体结合来抑制乙酰胆碱分泌的肽中，上述Xn可以具有下列序列号1～序列号11中的一个氨基酸序列：
序列号1：KGTLNR，
序列号2：RKSLLR，
序列号3：EDKGKN，
序列号4：RDKLQM，
序列号5：QLGQLS，
序列号6：GRLSAS，
序列号7：RQLNNQ，
序列号8：DNLQNN，
序列号9：LYQRLG，
序列号10：NKQVKF，以及
序列号11：ETYDSK。
本发明所述的通过与乙酰胆碱受体结合来抑制乙酰胆碱分泌的肽可以包含下列序列号12～序列号22中的一个氨基酸序列：
序列号12：WTWKGKGTLNR，
序列号13：WTWKGRKSLLR，
序列号14：WTWKGEDKGKN，
序列号15：WTWKGRDKLQM，
序列号16：WTWKGQLGQLS，
序列号17：WTWKGGRLSAS，
序列号18：WTWKGRQLNNQ，
序列号19：WTWKGDNLQNN，
序列号20：WTWKGLYQRLG，
序列号21：WTWKGNKQVKF，以及
序列号22：WTWKGETYDSK。
在本发明所述的通过与乙酰胆碱受体结合来抑制乙酰胆碱分泌的肽中，上述乙酰胆碱受体结合肽的特征在于，可以包含由下列序列号23～序列号26表示的氨基酸序列中的一个序列。
序列号23：WTWKGKGTLNR，
序列号24：WTWKGRKSLLR，
序列号25：WTWKGEDKGKN，以及
序列号26：WTWKGRDKLQM。
在本发明所述的通过与乙酰胆碱受体结合来抑制乙酰胆碱分泌的肽中，上述乙酰胆碱受体结合肽的特征在于，可以包含由下列序列号27～序列号31表示的氨基酸序列中的一个序列。为使由下列序列号27～序列号31表示的氨基酸序列最优化，采用了由序列号23～序列号26表示的氨基酸序列中部分缺失的结构：
序列号27：TWKGKGTLNR，
序列号28：WKGKGTLNR，
序列号29：WTWKGKGTLN，
序列号30：WTWKGKGTL，以及
序列号31：KGTLNR。
并且，本发明再一方面提供一种乙酰胆碱受体结合肽的筛选方法，包括：步骤(1)：制作肽文库后，将上述肽文库插入于载体来制备重组噬菌体；
步骤(2)：将上述重组噬菌体与乙酰胆碱受体混合后，对于上述重组噬菌体与乙酰胆碱受体的混合物进行生物淘选(biopaning)，来筛选出与乙酰胆碱受体结合的噬菌体；
步骤(3)：对于上述步骤(2)中筛选出来的噬菌体实施乙酰胆碱受体、对照组的酶联免疫吸附测定(ELISA)；以及
步骤(4)：对上述酶联免疫吸附测定的结果进行分析，筛选出乙酰胆碱受体的结合信号强度为对照组的1.5倍以上的噬菌体。
在本发明所述的通过与乙酰胆碱受体结合来抑制乙酰胆碱分泌的肽的筛选方法中，制作肽文库后，插入于载体来制备重组噬菌体的步骤(1)中的上述肽文库可以利用由序列号1～序列号11中一个碱基序列组成的DNA文库来制备。
并且，本发明提供一种对本发明的肽进行编码的多聚核苷酸。并且，可以对能够对于上述活体结构物表现出结合活性的肽进行编码的，包含与上述碱基序列具有相同性的碱基序列的多聚核苷酸也可以包括在本发明提供的多聚核苷酸的范畴内，优选地，可以为包括具有80％以上的相同性的碱基序列的多聚核苷酸，更优选地，可以为包括具有90％以上的相同性的碱基序列的多聚核苷酸，最优选地，可以为包括具有95％以上的相同性的碱基序列的多聚核苷酸。
并且，本发明另一方面提供一种含有本发明的肽作为有效成分的用于改善皱纹的化妆品组合物。
并且，本发明还有一方面提供一种含有本发明的肽作为有效成分的用于改善皱纹的药学组合物。
根据本发明的用于改善皱纹的药学组合物可单独含有本发明的肽或其药学上可接受的盐，或者还可以含有一种以上的药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
在本发明中，术语“药学上可接受”指的是足以显现疗效且不引起副作用的充分的量，以便于本发明所属领域普通技术人员能够根据疾病的种类、患者的年龄、体重、健康状况、性别、患者对药物的敏感度、给药路径、给药方法、给药次数、疗程、配合程度以及同时使用的药物等医学领域内公知的要素来做决定。
作为药学上可接受载体，举例来说，还可以包括口服给药用载体或非口服给药用载体。
口服给药用载体可以包括乳糖、淀粉、纤维素衍生物、硬脂酸镁、硬脂酸等。并且，非口服给药用载体可以包括水、适当的油、生理盐水、水溶性葡萄糖以及乙二醇等，还可以包括稳定剂及保存剂。适当的稳定剂有亚硫酸氢钠、亚硫酸钠或抗坏血酸之类的抗氧化剂。适当的保存剂有苯扎氯铵、羟苯甲酯或羟苯丙酯及氯丁醇。此外，药学上可接受载体还可参照括号中文献中所记载的(Remington's Pharmaceutical Sciences，19th ed.，MackPublishing Company，Easton，PA，1995)。
本发明的用于改善皱纹的药学组合物可以通过任意方法向如人类的哺乳动物进行给药。举例来说，可以通过口服或非口服给药。非口服的给药方法不受限制，可在静脉内、肌肉内、动脉内、骨髓内、硬膜内、鞘内、经皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、肠管、局部、舌下或直肠内进行给药。优选地，本发明的药学组合物可经皮给药。上述的经皮给药指将本发明的药学组合物给药至细胞或皮肤，使本发明的组合物中含有的活性成分传递至皮肤内。举例来说，可以将本发明的药学组合物制成注射型剂型，使用30G(gauge)的极细的针头对皮肤进行极浅的扎刺(prick)的方法，或可以直接涂敷于皮肤的方法来进行给药。
本发明的药学组合物可根据上述的给药途径来进行口服给药用或非口服给药用制剂的剂型化。
在口服给药用制剂的情况下，本发明的组合物可以为粉末、颗粒、片剂、丸剂、糖衣片、胶囊剂、液剂、凝胶剂、糖浆剂、浆剂、悬浊液等利用该技术领域公知的方法进行剂型化。举例来说，口服给药用制剂可在将活性成分与固体赋形剂配合后，对其进行粉碎，添加适当的保存剂后，加工成颗粒混合物，而后制成片剂或糖衣片。作为适当的赋形剂，举例来说，可以为包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇及麦芽糖醇等的糖类，可以为包括玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉及土豆淀粉等的淀粉类，可以为包括纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羟丙甲基纤维素等的纤维素类，可以为包括明胶、聚乙烯吡咯烷酮等的填充剂。并且，还可以根据情况的不同来添加交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、褐藻酸或褐藻酸钠等崩解剂。
在非口服给药制剂情况下，可通过该领域公知的方法来剂型化成注射剂、霜剂、乳剂、外用软膏剂、油剂、保湿剂、凝胶剂、气雾剂及鼻腔吸入剂等形态。这些剂型都记载在作为所有制药化学普遍公知的处方书文献(Remington's Pharmaceutical Science，15thEdition，1975.Mack Publishing Company，Easton，Pennsylvania 18042，Chapter 87：Blaug，Seymour)中。
本发明的肽的总有效量可通过单次剂量(single dose)来向患者给药，还可以通过以多次剂量(multiple dose)来进行长期给药的分步治疗方法(fractionatedtreatment protocol)来进行给药。本发明的药学组合物的有效成分的含量可根据疾病程度的不同而不同。
附图说明
图1为示出根据本发明一实施例的随机肽DNA文库的制作结果。
图2为示出在根据本发明一实施例的生物淘选步骤中，对乙酰胆碱受体是否增加有特异性的确认结果。
图3为示在根据本发明一实施例的生物淘选步骤中作为回收的重组噬菌体的阴性对照组的卵白素(strepavidin)与乙酰胆碱受体对比进行酶联免疫吸附测定(ELISA)的结果。
图4为示出在本发明一实施例的酶联免疫吸附测定(ELISA)的结果中，根据乙酰胆碱受体/卵白素(strepavidin)的信号比率为1.5倍以上的重组噬菌体的排序筛选的肽的多重序列比对结果。
图5为示出本发明一实施例的作为阳性对照组的类蛇毒血清蛋白样肽(Synake)和维洛斯肽(Vialox)和筛选的肽的结合能的测定结果。
图6为示出本发明一实施例的作为阳性对照组的类蛇毒血清蛋白样肽(Synake)的结合能的测定结果。
图7为示出本发明一实施例的筛选的肽的结合能的测定结果。
图8为示出本发明一实施例的为最优化(optimization)而缺失(deletion)的肽的结合能的比较结果。
图9为示出本发明一实施例的缺失(deletion)的肽的结合能的测定结果。
具体实施方式
以下，通过实施例对本发明进行更加详细的说明。这些实施例仅用于说明本发明，而不能解释为要通过这些实施例对本发明的范围加以限制，这对本发明所属领域的普通技术人员应当是显而易见的。
实施例1、随机肽噬菌体文库制作
1.1、4mer、5mer、6mer随机肽制备及插入于载体
为制备随机肽文库(WTWKG(X)n，X＝随机氨基酸(random amino acids)，n＝4～6)，合成DNA文库4mer(TTCTATGCGGCCCAGCTGGCCTGGACATGGAAGGGANNKNNKNNKNNKGCGGCCGCAGAAACTGTT)、5mer(TTCTATGCGGCCCAGCTGGCCTGGACATGGAAGGGANNKNNKNNKNKKNNKGCGGCCGCAGAAACTGTT)、6mer(TTCTATGCGGCCCAGCTGGCCTGGACATGGAAGGGANNKNNKNNKNNKNKKNNKGCGGCCGCAGAAACTGTT)(Bioneer，大田，韩国(Bioneer，Daejeon，Korea))。
利用聚合酶链式反应(PCR)将两个单链(single strand)引物(TTCTATGCGGCCCAG，AACAGTTTCTGCGGC)扩增为双链嵌体(Double strand insert)。随机肽DNA文库的制作结果如图1所示。
为将随机肽DNA文库插入于噬菌粒载体(Phagemid Vector)(pIGT)，利用噬菌粒载体和聚合酶链式反应(PCR)通过限制酶对扩增的嵌体DNA进行处理。
将约10μg的嵌体DNA用限制性内切酶SfiI(New England Biolabs(NEB)，Ipswich)及限制性内切酶NotI(NEB，Ipswich)反应8小时后，利用聚合酶链式反应(PCR)纯化试剂盒得到纯化的DNA。并且，将约10μg的噬菌粒载体用限制性内切酶SfiI及限制性内切酶NotI处理8小时后，加入牛小肠碱性磷酸酶(CIAP，Calf Intestinal Alkaline Phosphatase)(NEB，Ipswich)反应1小时，而后利用聚合酶链式反应(PCR)纯化试剂盒进行纯化。纯化的结果如图1所示，4mer、5mer、6mer肽文库DNA各制备了1.8×109、3.2×108、5.9×108个。
利用T4 DNA连接酶(Bioneer，大田，韩国)对嵌体DNA(3μg)与噬菌粒载体(10μg)在18℃的温度下进行15小时的结合后，用酒精进行沉淀，之后用100μl的TE缓冲液对DNA进行溶解。
1.2、电穿孔
将在上述实施例1.1中制备的各含有4mer、5mer、6mer随机嵌体DNA的100μl的噬菌粒载体分为各为4μl的25份来进行电穿孔。
更具体地，将感受态细胞(competent cell)在冰上融化后，将200μl的感受态细胞与含有嵌体DNA的各个4μl的噬菌粒载体溶液进行混合后，放入经冷却准备好的0.2cm的试管中后，在冰上放置1分钟。
将电穿孔仪(BioRAD，Hercules，CA)的程序设置在200Ω、25μF及2.5kV的条件下，把准备好的试管除去水气后安置于电穿孔仪后，施加脉冲(时间常数为4.5～5msec)。之后立即放入在37℃的温度下准备好的含有20mM的葡萄糖的1ml的LB(Luria Bertani)液体培养基里，之后将得到的总共25ml的细胞都挪到100ml的试管里。以200rpm在37℃的温度下进行1小时的混合培养后，为测定文库的个数，按10μl进行分株后，稀释并涂抹至氨苄青霉素琼脂培养基。将分株后残留的细胞置入1L的含有20mM的葡萄糖及50μg/ml的氨苄青霉素的LB培养基里，在30℃的温度下培养一天。之后在4℃的温度下以4000rpm进行20分钟的离心，将除沉淀的细胞之外的所有上层液除去，用40ml的LB进行再悬浊后，放入最终浓度为20％以上的丙三醇，在-80℃的温度下进行保存。
1.3、从随机肽文库制备重组噬菌体
从在上述实施例1.2中在-80℃的温度下保存的4mer、5mer、6mer随机肽文库中制备重组噬菌体。
将在-80℃的温度下保管的1ml的文库添加至30ml的SB液体培养基里，在37℃的温度下以200rpm的速度进行混合培养。将辅助噬菌体(Helper phage)(1010pfu)和氨苄青霉素(最终浓度为50μg/ml)放入上述液体培养基中，在同样条件下再进行1小时的培养。然后将其挪至含有氨苄青霉素(50μg/ml)及卡那霉素(10μg/ml)的30ml的SB液体培养基中，在同样的条件下进行16小时以上的培养来制备重组噬菌体。将制备的重组噬菌体在4℃的温度下以5000rpm的速度进行10分钟的离心得到上层液，将上层液与PEG/NaCl溶液以5：1的体积比(v/v)混合后，置于冰中1小时，之后，在4℃的温度下以13000rpm的速度进行20分钟的离心，小心地将上层液去除后，用1ml的磷酸盐缓冲液(PBS，Phosphate bufferd saline)对其小颗粒进行再悬浊。
实施例2、对与乙酰胆碱受体结合的肽进行筛选的方法
2.1、乙酰胆碱受体的生物淘选
在96孔高结合力板(96well high binding plate)中的8个孔(well)中各放入50μl的乙酰胆碱受体(AchR)alpha 1(10μg/ml)后，在4℃的温度下放置过夜，次日用200μl的磷酸盐缓冲液(PBS)进行一次洗涤后，放入200μl的2％的牛血清蛋白(BSA，Bovine SerumAlbumin)并在常温下封闭2小时，之后将溶液全部去除后用200μl的磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次。
在此，将400μl的含有在上述实施例1.3中各制备的4mer、5mer、6mer随机肽重组噬菌体的溶液及400μl的2％的牛血清蛋白(BSA)混合后，每个孔(well)中各放入100μl并在常温下放置1小时。将8个孔(well)中的溶液全部除去后，用0.1％的PBST溶液(tween-20)进行三次洗涤，之后，在每个孔(well)中加入100μl的0.2M的甘氨酸(pH2.2)对噬菌体进行10分钟的洗脱，将其收集于800μl的E-tube中，加入200μl的1M的三羟甲基氨基甲烷(pH9.0)进行中和。
为测定各生物淘选的输入(input)噬菌体及输出(output)噬菌体的数量，将其与OD＝0.7的大肠埃希菌(E.coil)混合后涂抹在含有氨苄青霉素的培养基。为反复进行淘选，将500μl的输出噬菌体与5ml的大肠埃希菌进行混合，在4℃的温度下以200rpm的速度进行30分钟的混合培养后，添加氨苄青霉素(50μg/ml)及辅助噬菌体(1×1010pfu)以相同的方法进行30分钟的培养。然后，将其挪至含有氨苄青霉素(50μg/ml)和卡那霉素(10μg/ml)d1的50ml的SB培养基中以同样的方法培养1日。将培养液在4℃的温度下以5000rpm的速度进行10分钟的离心，在上层液中以5：1的比率添加PEG/NaCl溶液(20％的PEG(w/v)以及15％的NaCl(w/v))后，将其静置在冰中1小时。在4℃的温度下以13000rpm的速度进行20分钟的离心后，将上层液完全去除，用1ml的磷酸盐缓冲液(PBS)对噬菌体颗粒进行再悬浊，而后将其使用于第二次生物淘选。各淘选步骤使用与上述相同的方法，洗涤过程的次数为3次、5次、7次及10次，将6mer文库(S6)对乙酰胆碱受体蛋白质经过五次生物淘选的实施条件和输入噬菌体(Input phage)、输出噬菌体(Output phage)的结果如下列表1所示。
表1
2.2、乙酰胆碱受体(AchR)的输入噬菌体(Input phage)的酶联免疫吸附测定
对卵白素(Streptavidin)及乙酰胆碱受体(AchR)进行了上述文库中各输入噬菌体(Input phage)的酶联免疫吸附测定(ELISA)。
将10μg/ml的乙酰胆碱受体和卵白素各以50μl的量各加入96孔酶联免疫吸附测定(ELISA)板的10个孔中，在4℃的温度下放置1日。然后，用0.05％的PBST溶液对所有的孔进行3次洗涤，使用以磷酸盐缓冲液(PBS)稀释的2％的牛血清蛋白(BSA)在常温下进行2小时的封闭，之后，将溶液全部去除后用0.05％的PBST溶液进行3次洗涤。
将上述表1中的重组噬菌体中的800μl的第三(3rd S6)、第四(4th S6)及第五(5thS6)输入噬菌体及200μl的10％的牛血清蛋白(BSA)混合后，各以100μl的量分株于各3个乙酰胆碱受体和卵白素的孔中，在30℃的温度下静置1小时。在用0.05％的PBST溶液进行3次洗涤后，用酶标抗-M13抗体(GE Healthcare公司)进行1：1000的稀释后，在30℃的温度下反应1小时。在用0.05％的PBST溶液进行3次洗涤后，用作为过氧化物酶的基质的100μl的3，3'，5，5'-四甲基联苯胺(TMB)(BD Science公司)溶液进行分株来诱导发色反应后，添加100μl的1M的HCL来终止反应。此后，在450nm下进行吸光度的测定。吸光度测定的结果如图2所示。
2.3、检索对乙酰胆碱受体具有特异性的噬菌体(colony ELISA)
将上述表1中的第四(4th S6)及第五(5th S6)输出噬菌体接种到大肠埃希菌后，将其以每个培养板出现100～200个噬菌斑的程度来涂抹。用灭菌的拭子将50个噬菌斑接种到1ml的SB-氨苄青霉素(50μg/ml)的培养液后，在37℃的温度下进行振荡培养5小时，之后各添加30μl的辅助噬菌体，在37℃的温度下以200rpm的速度培养1日。将培养液以12000rpm的速度进行2分钟的离心后回收上层液，之后加入2％的牛血清蛋白(BSA)，将其用于噬菌体的检索。
将5μg/ml的乙酰胆碱受体、卵白素各以50μl的量各加入96孔酶联免疫吸附测定(ELISA)板的50个孔(well)中，在4℃的温度下放置1日。次日，将所有孔(well)的蛋白质去除后，使用2％的牛血清蛋白(BSA)在常温下进行2小时的封闭，之后，将所有溶液去除，用0.05％的PBST溶液进行洗涤。将各克隆扩增的噬菌体溶液以100μl的量分株于所有的孔(well)中，在30℃的温度下静置1小时。用0.05％的PBST溶液进行3次洗涤后，用酶标抗-M13抗体(GE Healthcare公司)进行1：2000的稀释后，以100μl的量进行分株，在30℃的温度反应1小时。用0.05％的PBST溶液进行3次洗涤后，分株100μl的TMB溶液来诱导发色反应后，添加100μl的1M的H2SO4来终止反应。此后，其结果如图3所示。
参照图3，将对比卵白素(Streptavidin)的乙酰胆碱受体信号高出1.5倍以上的噬菌体的质粒纯化后，委托(Bioneer公司，大田，韩国)进行排序。使用GATTACGCCAAGCTTTGGAGC作为排序引物。
通过排序得到的对乙酰胆碱受体具有特异性结合能力的肽的序列的整理如图4及下列表2所示。
表2
实施例3、所发现的肽的乙酰胆碱结合力的比较实验
通过多重序列比对(multiple alignment)合成出在上述表2中的肽中显出序列类似性的S6_1(WTWKGKGTLNR)、S6_2(WTWKGRKSLLR)、S6_3(WTWKGEDKGKN)、S6_4(WTWKGRDKLQM)。
为对它们对乙酰胆碱受体的结合力进行比较，利用生物传感器芯片进行表面等离子共振(surface plasmon resonance，SPR)实验(Biacore3000型，Biacore AB公司，乌普萨拉，瑞典)。将选择的乙酰胆碱受体蛋白质利用EDC/NHS固定于CM5芯片(Biacore)，对其交联(association)和分解(dissociation)进行最大至500秒钟的观察。在电泳缓冲液为20mM的Tris(pH 7.4)，速度为30μl/分钟，肽的浓度为10μM(S6_1、S6_2、S6_3、S6_4)的条件下进行观察。结合力比较实验的结果如图5所示。
实施例4、所发现的肽S6_1与阳性对照组的结合力比较实验
为将所发现的肽S6_1(WTWKGKGTLNR)和经过缺失(deletion)的形态(form)的Sc_1_C6(KGTLNR)与作为阳性对照组的类蛇毒血清蛋白样肽(Synake)和维洛斯肽(Vialox)对乙酰胆碱受体的结合力进行比较，利用生物传感器芯片进行表面等离子共振(surfaceplasmon resonance，SPR)实验(Biacore3000型，Biacore AB公司，乌普萨拉，瑞典)。
将选择的乙酰胆碱受体蛋白质利用EDC/NHS固定于CM5芯片(Biacore)，对其交联(association)和分解(dissociation)进行最大至500秒钟的观察。在电泳缓冲液为20mM的Tris(pH 7.4)，速度为30μl/分钟，肽的浓度为10μM(Synake、Vialox、S6_1、S6_1_C6)的条件下进行观察。结合力比较实验的结果如图6所示。
实施例5、S6_1肽及类蛇毒血清蛋白样肽(Synake)的亲和力的测定。
为确认所发现的肽S6_1(WTWKGKGTLNR)和作为阳性对照组的类蛇毒血清蛋白样肽(Synake)对乙酰胆碱受体的亲和力，利用生物传感器芯片进行表面等离子共振(surfaceplasmon resonance，SPR)实验(Biacore3000型，Biacore AB公司，乌普萨拉，瑞典)。将乙酰胆碱受体利用EDC/NHS固定于CM5芯片(Biacore)，对其交联(association)和分解(dissociation)进行最大500秒钟的观察。在电泳缓冲液为20mM的Tris(pH 7.4)，速度为30μl/分钟的条件下进行观察。在浓度为10～50μM(类蛇毒血清蛋白样肽(Synake))，浓度为0.1～10μM(肽S6_1)的条件下进行观察。各结果如图7(类蛇毒血清蛋白样肽(Synake))及图8(肽S6_1)所示。
实施例6、S6_1的肽的最优化及结合力比较实验
为了S6_1的最优化，在其N-末端和C-末端去除一个和两个氨基酸来合成肽S6_1_C10(TWKGKGTLNR)、S6_1_C9(WKGKGTLNR)、和S6_1_C10_end(WTWKGKGTLN)、S6_1_C9_end(WTWKGKGTL)。
为对这些肽对乙酰胆碱受体的结合力进行比较，利用生物传感器芯片进行表面等离子共振(surface plasmon resonance，SPR)实验(Biacore3000型，Biacore AB公司，乌普萨拉，瑞典)。
将选择的乙酰胆碱受体蛋白质利用EDC/NHS固定于CM5芯片(Biacore)，对其交联(association)和分解(dissociation)进行最大至500秒钟的观察。在电泳缓冲液为20mM的Tris(pH 7.4)，速度为30μl/分钟，肽的浓度为10μM(Synake、Vialox、S6_1、S6_1_C10、S6_1_C9、S6_1_C10_end、S6_1_C9_end、S6_1_C6)的条件下进行观察。结果如图9所示。
实施例7、S6_1_C9肽的亲和力测定
为对在上述实施例6中制备的最优化的S6_1_C9肽(WKGKGTLNR)对乙酰胆碱受体的亲和力进行确认，利用生物传感器芯片进行表面等离子共振(surface plasmonresonance，SPR)实验(Biacore3000型，Biacore AB公司，乌普萨拉，瑞典)。
将选择的乙酰胆碱受体蛋白质利用EDC/NHS固定于CM5芯片(Biacore)，对其交联(association)和分解(dissociation)进行最大至500秒钟的观察。在电泳缓冲液为20mM的Tris(pH 7.4)，速度为30μl/分钟，肽的浓度为0.1～0.5μM(肽S6_1_C9)的条件下进行观察。
对于肽的亲和力测定结果如图10所示。参照图10，可以确认S6_1_C9肽(WKGKGTLNR)对乙酰胆碱的结合能相对于类蛇毒血清蛋白样肽(Synake)高出100倍。
本发明的肽与乙酰胆碱受体的结合强度高，与乙酰胆碱进行强力结合来抑制乙酰胆碱的分泌。因此，包含本发明所述的肽作为有效成分的化妆品组合物及药学组合物表现出突出的皱纹改善效果。
以上，对本发明内容中特定的部分进行了详细的记述，本发明所属领域的普通技术人员应该明白，这样具体的记述只是优选的实施方式而已，不能因此而对本发明的范围加以限制。由此，本发明的实际范围应由附加的发明要求保护范围及其等同物来定义。
<110> 艾美科健有限公司
<120> 乙酰胆碱受体结合肽
<130> DP-2017-0081-KR
<160> 31
<170> KoPatentIn 3.0
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Claims (9)
1.一种乙酰胆碱受体结合肽，其特征在于，包含由下列通式1～通式6中一个以上的通式表示的氨基酸序列：
通式1：WTWKG-Xn，
通式2：TWKG-Xn，
通式3：WKG-Xn，
通式4：KG-Xn，
通式5：G-Xn，
通式6：Xn，
上述Xn表示由1～6个任意氨基酸构成的序列。
2.根据权利要求1所述的乙酰胆碱受体结合肽，其特征在于，上述Xn为选自由下列序列1～序列11组成的群组中的一个：
序列号1：KGTLNR，
序列号2：RKSLLR，
序列号3：EDKGKN，
序列号4：RDKLQM，
序列号5：QLGQLS，
序列号6：GRLSAS，
序列号7：RQLNNQ，
序列号8：DNLQNN，
序列号9：LYQRLG，
序列号10：NKQVKF，以及
序列号11：ETYDSK。
3.根据权利要求1所述的乙酰胆碱受体结合肽，其特征在于，上述肽包含序列号12～序列号22的序列中的一个氨基酸序列：
序列号12：WTWKGKGTLNR，
序列号13：WTWKGRKSLLR，
序列号14：WTWKGEDKGKN，
序列号15：WTWKGRDKLQM，
序列号16：WTWKGQLGQLS，
序列号17：WTWKGGRLSAS，
序列号18：WTWKGRQLNNQ，
序列号19：WTWKGDNLQNN，
序列号20：WTWKGLYQRLG，
序列号21：WTWKGNKQVKF，以及
序列号22：WTWKGETYDSK。
4.根据权利要求1所述的乙酰胆碱受体结合肽，其特征在于，上述乙酰胆碱受体结合肽包含由下列序列号23～序列号26表示的氨基酸序列中的一个序列：
序列号23：WTWKGKGTLNR，
序列号24：WTWKGRKSLLR，
序列号25：WTWKGEDKGKN，以及
序列号26：WTWKGRDKLQM。
5.根据权利要求1所述的乙酰胆碱受体结合肽，其特征在于，上述乙酰胆碱受体结合肽包含由下列序列号27～序列号31表示的氨基酸序列中的一个序列：
序列号27：TWKGKGTLNR，
序列号28：WKGKGTLNR，
序列号29：WTWKGKGTLN，
序列号30：WTWKGKGTL，以及
序列号31：KGTLNR。
6.一种多聚核苷酸，其特征在于，对权利要求1至5中任一项所述的乙酰胆碱受体结合肽进行编码。
7.一种用于改善皱纹的化妆品组合物，其特征在于，含有权利要求1至5中任一项所述的乙酰胆碱受体结合肽或权利要求6的多聚核苷酸作为有效成分。
8.一种用于改善皱纹的药学组合物，其特征在于，含有权利要求1至5中任一项所述的乙酰胆碱受体结合肽或权利要求6的多聚核苷酸作为有效成分。
9.一种乙酰胆碱受体结合肽的筛选方法，其特征在于，包括：
步骤(1)：制作肽文库后，藉由将上述肽文库插入于载体来制备重组噬菌体；
步骤(2)：将上述重组噬菌体与乙酰胆碱受体混合后，并对于上述重组噬菌体与乙酰胆碱受体的混合物进行生物淘选，来筛选出与乙酰胆碱受体结合的噬菌体；
步骤(3)：对于上述步骤(2)中筛选出来的噬菌体实施乙酰胆碱受体、对照组的酶联免疫吸附测定；以及
步骤(4)：对上述酶联免疫吸附测定的结果进行分析，筛选出乙酰胆碱受体的信号强度为对照组的1.5倍以上的噬菌体。
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