CN111077254A

CN111077254A - 一种薄膜固相微萃取涂层材料及其制备方法和应用、呕吐毒素的高通量检测方法

Info

Publication number: CN111077254A
Application number: CN202010013486.8A
Authority: CN
Inventors: 赵慧宇; 王新全; 齐沛沛; 徐浩; 汪志威; 狄珊珊
Original assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2020-01-07
Filing date: 2020-01-07
Publication date: 2020-04-28
Anticipated expiration: 2040-01-07
Also published as: CN111077254B

Abstract

本发明提供了一种薄膜固相微萃取涂层材料及其制备方法和应用、呕吐毒素的高通量检测方法，属于有机污染物检测技术领域。本发明提供了一种薄膜固相微萃取涂层材料，组成上包括聚丙烯腈材料和石墨化羧基多壁碳纳米管。本发明提供的薄膜固相微萃取涂层材料对光照、温度变化和化学试剂的耐受力强；石墨化羧基多壁碳纳米管具有极高的强度和韧性，表面键合了羧基后增加其对于极性化合物的萃取能力，两者配合使用得到的薄膜固相微萃取涂层材料具有萃取性能优异、形态均一、重现性好且使用寿命长的特点。应用于呕吐毒素的薄膜固相微萃取法检测时，能够实现待测样品的高通量分析，检测准确度和灵敏度高且重现性好。

Description

一种薄膜固相微萃取涂层材料及其制备方法和应用、呕吐毒素的高通量检测方法

技术领域

本发明涉及有机污染物检测技术领域，具体涉及一种薄膜固相微萃取涂层材料及其制备方法、呕吐毒素的高通量检测方法。

背景技术

呕吐毒素又名脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，简写为DON，结构式如下)是一种B型单端孢霉烯族化合物，主要由禾谷镰刀菌和大刀镰刀菌产生，具有较强的热抵抗力和耐酸性，一般不会在加工、贮存以及烹调过程中被破坏，即使在pH 4.0条件下，120℃条件下加热60min仍然稳定存在。

DON对人和动物均有很强的毒性。人类食用含有一定量DON粮油食品后，会出现胃部不适、恶心呕吐、头晕头痛、手脚发麻、全身无力等症状以及食物中毒性白细胞缺乏症，急性中毒症状为血压不稳、呼吸衰竭、体温异常、步态不稳、四肢发软等；长期摄入DON可能会引起神经毒性、免疫抑制、致畸毒性和遗传毒性等毒副作用。DON是动物成长过程中有效的抑制剂，猫、狗、畜禽等动物摄入了被DON污染的饲料后，会引起呕吐反应，严重时损害造血系统造成死亡。

DON广泛存在于动物饲料和谷物类农作物中，如小麦、玉米、燕麦和大麦等谷物类农作物中，以及利用这些谷物类农作物加工的啤酒、饼干、面包、麦制点心等中，此外在牛奶和鸡蛋中也有检出DON。

目前对于DON的检测方法主要有薄层色谱法(TLC)、气相色谱法(GC)、酶联免疫吸附法(ELISA)、免疫亲和柱-高效液相色谱法(HPLC)、高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS)等，但是上述方法普遍存在成本高、耗时长、难以满足高通量筛查的需求的缺陷。

薄膜固相微萃取(TFME)集富集和净化于一体，具有操作简便、溶剂用量少、灵敏度高、可重复使用、可自动化操作的优点，在食品安全和环境检测领域迅速发展，成为样品前处理技术中最为重要的方法之一。薄膜固相微萃取装置上分别配置有可以用于活化、萃取、清洗、洗脱(氮吹)的加热震荡模块(见图1)，萃取装置由96根带有涂层的薄片构成梳子结构，在机械臂的带动下实现对96个样品的高通量前处理分析。其中，萃取薄片上的涂层材料对于薄膜固相微萃取的检测效果影响很大。目前，商品化的萃取涂层材料主要有碳十八(C₁₈)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)，二乙烯基苯(DVB)和碳吸附剂(CAR)等。然而，由于呕吐毒素的水溶解度大且极性强，导致上述涂层材料对于呕吐毒素萃取还存在一定的困难，限制了薄膜固相微萃取在检测呕吐毒素中的应用。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种薄膜固相微萃取涂层材料及其制备方法、呕吐毒素的高通量检测方法。本发明提供的薄膜固相微萃取涂层材料具有萃取性能优异、形态均一、重现性好且使用寿命长的特点。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种薄膜固相微萃取涂层材料，组成上包括PAN材料和石墨化羧基多壁碳纳米管。

优选地，所述石墨化羧基多壁碳纳米管材料和聚丙烯腈的质量比为1：(0.2～4.0)。

优选地，所述石墨化羧基多壁碳纳米管的直径为10～20nm，长度为10～100μm，纯度>99.9％，羧基含量为0.1～2wt％。

本发明提供了上述技术方案所述薄膜固相微萃取涂层材料的制备方法，包括以下步骤：

将聚丙烯腈材料、有机溶剂和石墨化羧基多壁碳纳米管混合，得到悬浮液；

将所述悬浮液涂覆于基底表面后干燥，在基底表面得到薄膜固相微萃取涂层材料。

优选地，所述聚丙烯腈材料和有机溶剂的质量比为1：(10～20)；

所述溶剂包括N,N'-二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、二甲基丙酰胺、二乙基甲酰胺或二乙基乙酰胺。

本发明提供了上述技术方案所述薄膜固相微萃取涂层材料或上述技术方案所述制备方法制备的薄膜固相微萃取涂层材料在高通量检测呕吐毒素中的应用。

本发明还提供了一种呕吐毒素的高通量检测方法，(i)当检测固态含呕吐毒素原料时，包括以下步骤：

将固态含呕吐毒素原料和水混合后离心，得到待测液；

将所述待测液置于多孔板中进行第一薄膜固相微萃取；

(ii)当检测液态含呕吐毒素原料时，包括以下步骤：

将液态含呕吐毒素原料和氯化钠混合后离心，得到待测液；

将所述待测液置于多孔板中进行第二薄膜固相微萃取；

(i)和(ii)中，所述第一薄膜固相微萃取和第二薄膜固相微萃取采用的薄膜固相微萃取涂层材料独立地为上述技术方案所述薄膜固相微萃取涂层材料或上述技术方案所述制备方法制备的薄膜固相微萃取涂层材料。

优选地，(i)中，所述固态含呕吐毒素原料和水的用量比为1g：(1～5)mL；所述固态含呕吐毒素原料包括谷物、谷物制品或鸡蛋。

优选地，(ii)中，所述液态含呕吐毒素原料和氯化钠的质量比为1:(0.01～0.1)；所述液态含呕吐毒素原料包括液态谷物制品或牛奶。

优选地，萃取薄片的活化溶液为甲醇水溶液；震荡萃取频率为700～1300r/min；直接浸入萃取的时间为10～60min；洗脱液为乙腈、甲醇、乙腈水溶液或甲醇水溶液，洗脱时间为10～70min；氮吹的时间为20～180min；将氮吹所得浓缩液用乙腈定容至1mL，过膜后进行仪器分析。

本发明提供了一种薄膜固相微萃取涂层材料，组成上包括聚丙烯腈材料和石墨化羧基多壁碳纳米管。本发明提供的薄膜固相微萃取涂层材料中聚丙烯腈材料(PAN)的大分子链中的丙烯腈单元是接头-尾方式相连，稳定性好，对于环境中光照和温度变化的耐受力强，且耐化学试剂，特别是无机酸、漂白粉、过氧化氢性能好；石墨化羧基多壁碳纳米管是由C＝C键组成了石墨圆柱形管状结构，组成碳纳米管的C＝C共价键使得碳纳米管具有极高的强度和韧性，表面键合了羧基后增加其对于极性化合物的萃取能力，两者配合使用得到的薄膜固相微萃取涂层材料具有优异萃取性能、形态均一、重现性好且使用寿命长，应用于呕吐毒素的薄膜固相微萃取法检测时，能够实现待测样品的高通量分析，检测准确度和灵敏度高且重现性好。

本发明提供的制备方法，操作简单，适宜规模化生产。

本发明提供的呕吐毒素的高通量检测方法，采用的薄膜固相微萃取涂层材料具有优异萃取性能、形态均一、重现性好且使用寿命长，以该涂层材料对呕吐毒素的检测过程中，能够实现待测样品的高通量分析，检测准确度和灵敏度高且重现性好。

附图说明

图1为高通量自动化薄膜固相微萃取仪器图；

图2为96样品高通量薄膜固相微萃取模式图，其中a)为薄膜固相微萃取顶板，局部放大部分为萃取薄片；b)为96孔板；

图3为实施例1制备的薄膜固相微萃取涂层材料的实物图；

图4为实施例1制备的薄膜固相微萃取涂层材料放大3000倍的SEM图；

图5为0.05ppm的DON乙腈溶剂标样的液-质联用色谱图；

图6为5.0ppm的DON乙腈溶剂标样的液-质联用色谱图；

图7为空白小麦粉的质谱图；

图8为DON添加量为0.1mg/kg的小麦粉的质谱图；

图9为空白啤酒的质谱图；

图10为DON添加量为0.05ppm的啤酒的质谱图；

图11为DON溶液的标准曲线图；

图12为小麦粉中DON添加浓度线性图；

图13为啤酒中DON的添加浓度线性图。

具体实施方式

在本发明中，若无特殊说明，所有的原料组分均为本领域技术人员熟知的市售商品。

在本发明中，所述石墨化羧基多壁碳纳米管(简写为XFM42)的直径优选为10～20nm，更优选为10nm、12nm、14nm、15nm、18nm或20nm；长度优选为10～30μm，更优选为10μm、15μm、20μm、25μm或30μm；纯度优选>99.9％；羧基含量优选为0.1～2.0wt％，更优选为0.5～1.5wt％，最优选为1.0wt％；所述石墨化羧基多壁碳纳米管优选购买于南京先丰纳米材料科技有限公司。在本发明中，所述石墨化羧基多壁碳纳米管和PAN材料的质量比优选为1：(0.2～4)，更优选为1：(0.2～2.5)，最优选为1：(0.4～1.5)。

本发明将聚丙烯腈材料、有机溶剂和石墨化羧基多壁碳纳米管混合，得到悬浮液。

在本发明中，所述PAN材料和溶剂的质量比优选为1：(10～20)，更优选为1：(12～18)，最优选为1:(12:～15)。

在本发明中，所述有机溶剂优选包括N,N'-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基乙酰胺、二甲基丙酰胺、二乙基甲酰胺或二乙基乙酰胺，更优选为二甲基甲酰胺。

在本发明中，所述聚丙烯腈材料、有机溶剂和石墨化羧基多壁碳纳米管混合的方式优选为将聚丙烯腈材料和有机溶剂第一混合后加热，得到PAN胶状溶液；将所述PAN胶状溶液和石墨化羧基多壁碳纳米管第二混合。本发明对于所述第一混合和第二混合的方式没有特殊限定，采用本领域熟知的混合方式即可；在本发明的实施例中，优选采用磁力搅拌方式；所述的磁力搅拌时间为2h～48h，更为优选为8～24h，所述磁力搅拌速率优选为500rpm～1000rpm，更优选为700～900rpm。本发明对于所述加热的方式没有特殊限定，采用本领域熟知的加热方式即可，具体如在烘箱中加热；所述加热的温度优选为50～150℃，更优选为70～90℃；所述加热的时间优选为20～40min，更优选为25～35min，最优选为30min。本发明在上述条件下制备的PAN胶状溶液粘稠度适中、透明均一、稳定性好，加入石墨化羧基多壁碳纳米管后分散均匀，增加了涂层材料对极性化合物的萃取能力，进而提高了薄膜固相微萃取涂层材料的萃取性能优异、形态均一、重现性好，且使用寿命长。具体如搅拌混合。

在本发明中，所述PAN胶状溶液和石墨化羧基多壁碳纳米管的质量比优选为(5～40)：1，更优选为5:1、10:1、15:1、20:1、25:1、30:1、35:1、或40:1，最优选为10:1。

得到悬浮液后，本发明将所述悬浮液涂覆于基底表面后干燥，在基底表面得到薄膜固相微萃取涂层材料。

在本发明中，所述基底优选为不锈钢基底；所述基底使用前优选进行预处理，所述预处理优选包括依次进行的酸洗、水洗、烘干和隔绝空气处理。在本发明中，所述酸洗采用的酸优选为盐酸、硝酸，更优选为盐酸；所述盐酸优选为浓盐酸，所述浓盐酸的浓度优选为36～38wt％。在本发明中，所述酸洗优选在超声条件下进行，所述超声的温度优选为20～35℃，更优选为25～30℃；所述超声的时间优选为30～90min，更优选为50～70min，最优选为60min。在本发明中，所述水洗采用的水优选为去离子水或超纯水，所述水洗优选在超声条件下进行，所述超声的时间优选为20～40min，更优选为25～35min，最优选为30min。在本发明中，所述酸洗、水洗的重复次数优选为2～3次。本发明对于所述烘干的温度和时间没有特殊限定，能够将基底表面的水分去除干净即可。在本发明中，隔绝空气处理的方式优选为将干燥后的基底用铝箔包起来，置于干燥皿内，向干燥皿中充入氮气，备用。

本发明对于所述基底的尺寸没有特殊限定，优选根据固相微萃取系统的搭载仪器进行设计。在本发明中，所述固相微萃取系统优选为CONCEPT 96自动固相微萃取系统(德国PAS基团公司)。在本发明中，所述基底的尺寸优选为10cm×5cm，所述基底的厚度优选为0.5～0.6mm。

在本发明中，所述悬浮液的涂覆方式优选为喷涂或浸入提拉涂敷。在本发明中，所述喷涂的方法优选包括以下步骤：将悬浮液置于喷瓶中，调节氮气压力，在基底表面均匀喷涂，然后将所得薄片干燥去溶剂；多次重复喷涂和干燥操作制备成薄膜固相微萃取涂层材料。在本发明中，所述氮气压力优选为0.01～0.05MPa，更优选为0.02MPa。在本发明中，所述干燥的温度优选为80～150℃，更优选为90～120℃，时间优选为30～180s，更优选为60s。本发明对于所述反复喷涂的次数没有特殊限定，采用本领域熟知的喷涂次数即可。

在本发明中，所述浸入提拉涂敷的方法优选包括以下步骤：将悬浮液置于烧杯或者96孔板中，提拉速度优选为0.2～2mm/s，更优选为0.3～0.8mm/s；所述提拉后将所得使薄片在空气中放置1～3min以使表面溶剂挥发掉，然后进行干燥。在本发明中，所述干燥的温度优选为80～150℃，更优选为90～120℃，时间优选为30～180s，更优选为60s，通过干燥能够使得悬浮液在基底表面固化。本发明对于所述反复浸入提拉的次数没有特殊限定，采用本领域提拉次数即可。

在本发明中，所述薄膜固相微萃取涂层材料的厚度优选为40～100μm。

本发明提供的薄膜固相微萃取涂层材料具有优异萃取性能、形态均一、重现性好且使用寿命长，可制成萃取薄片用于进行薄膜固相微萃取。

本发明提供了一种呕吐毒素的高通量检测方法，(i)当检测固态含呕吐毒素原料时，包括以下步骤：

将固态含呕吐毒素原料和水混合后离心，得到待测液；

将所述待测液置于多孔板中进行第一薄膜固相微萃取；

(ii)当检测液态含呕吐毒素原料时，包括以下步骤：

将液态含呕吐毒素原料和氯化钠混合后离心，得到待测液；

将所述待测液置于多孔板中进行第二薄膜固相微萃取；

将固态含呕吐毒素原料和水混合后离心，得到待测液；

将所述待测液置于多孔板中，利用薄膜固相微萃取涂层材料对所述待测液进行第一薄膜固相微萃取；

所述薄膜固相微萃取涂层材料为上述技术方案所述薄膜固相微萃取涂层材料或上述技术方案所述制备方法制备的薄膜固相微萃取涂层材料。

本发明将固态含呕吐毒素原料和水混合后离心，得到待测液。

在本发明中，所述固态含呕吐毒素原料包括优选谷物、面点或鸡蛋，所述谷物优选包括小麦、玉米、燕麦或大麦；所述面点优选为采用谷物制备得到，更优选包括饼干、面包、麦制点心。在本发明中，所述固态含呕吐毒素原料和水的用量比优选为1g：(1～5)mL，更优选为1g：2mL。

在本发明中，所述固态含呕吐毒素原料和水混合的方式优选为涡旋振荡混合，所述混合涡旋振荡混合的转速和时间没有特殊限定，能够保证混合均匀即可。

在本发明中，所述离心的转速优选为6000～8000r/min，更优选为7000r/min；离心时间优选为4～6min，更优选为5min，离心后所得上清液即为待测液。

在本发明中，所述第一薄膜固相微萃取的条件优选包括活化条件、萃取条件和洗脱条件。

在本发明中，所述萃取条件包括：活化溶液优选为甲醇水溶液，所述甲醇水溶液中甲醇和水的体积比优选为1:1；所述萃取薄片的活化时间优选为20～40min，更优选为25～35min，最优选为30min，所述活化的震荡速率优选为700～900r/min，更优选为800r/min。

在本发明中，直接浸入萃取的时间优选为1060min，更优选为30～50min，最优选为40～50min；所述萃取的震荡速率优选为700～1300r/min，更优选为800r/min。

在本发明中，所述洗脱条件包括：洗脱液优选为洗脱液为乙腈、甲醇、乙腈水溶液或甲醇水溶液，所述乙腈水溶液中的体积分数优选为70％～100％，所述甲醇水溶液中甲醇的体积分数优选为70～100％；洗脱时间优选为10～70min，更优选为50～70min，最优选为60min，所述洗脱的震荡速率优选为700～1300r/min，更优选为1100～1300r/min，最优选为1200r/min；氮吹的时间优选为20～40min，更优选为25～35min，最优选为30min；氮吹所得浓缩液优选用乙腈定容至1mL，过膜后进行仪器分析。在本发明中，所述萃取薄片上的涂层材料即为上述技术方案所述的薄膜固相微萃取涂层材料。

在本发明中，所述多孔板优选为96孔板，具有96孔板的薄膜固相微萃取模式图如图2所示，其中a)薄膜固相微萃取顶板，局部放大部分为萃取薄片；b)为96孔板。本发明采用96孔板能够实现96个样品的高通量分析，本发明提供的检测方法可实现自动化操作，缩短了样品分析时间，而且灵敏度和重现性均能满足分析要求。

本发明提供了一种呕吐毒素的高通量检测方法，(ii)液态含呕吐毒素原料中呕吐毒素的检测方法，包括以下步骤：

将液态含呕吐毒素原料和氯化钠混合后离心，得到待测液；

本发明将液态含呕吐毒素原料和氯化钠混合后离心，得到待测液。

在本发明中，所述液态含呕吐毒素原料优选包括啤酒、玉米汁或牛奶。在本发明中，所述液态含呕吐毒素原料和氯化钠的质量比优选为1:(0.01～0.1)，更优选为1:(0.03～0.07)，最优选为1:0.05。

在本发明中，当所述液态含呕吐毒素原料为啤酒时，优选先将啤酒进行冷藏、超声脱气和离心。在本发明中，所述冷藏优选在冰箱中进行，所述冷藏的温度优选为4℃，时间优选为30min。在本发明中，所述超声的温度优选为25～40℃，时间优选为25～35min。所述固态含呕吐毒素原料和水混合的方式优选为超声混合，所述超声混合的转速和时间没有特殊限定，能够保证混合均匀即可。在本发明中，所述离心的转速优选为3000～10000r/min，更优选为10000r/min；离心时间优选为3～10min，更优选为10min，离心后所得上清液即为待测液。

在本发明中，所述第二薄膜固相微萃取的条件优选包括活化条件、萃取条件和洗脱条件。

在本发明中，所述活化条件包括：活化溶液优选为甲醇水溶液，所述甲醇水溶液中甲醇和水的体积比优选为1:1；所述萃取薄片的活化时间优选为20～40min，更优选为25～35min，最优选为30min，所述活化的搅拌速度优选为700～900r/min，更优选为800r/min；

在本发明中，所述萃取条件包括：萃取的时间优选为10～60min，更优选为30～50min，最优选为30～40min，所述萃取的震荡频率优选为700～1300r/min，更优选为1100～1300r/min，最优选为1200r/min。

在本发明中，所述洗脱条件包括：洗脱液优选为乙腈，洗脱时间优选为10～60min，更优选为50～70min，最优选为55～65min，所述洗脱的搅拌速度优选为700～1300r/min，更优选为1100～1300r/min，最优选为1200r/min；氮吹的时间优选为20～40min，更优选为25～35min，最优选为30min；氮吹所得浓缩液优选用乙腈定容至1mL，过膜后进行仪器分析。在本发明中，所述萃取薄片上的涂层材料即为上述技术方案所述的薄膜固相微萃取涂层材料。

在本发明中，所述多孔板优选为96孔板。本发明采用96孔板能够实现96个样品的高通量分析，本发明提供的检测方法可实现自动化操作，缩短了样品分析时间，而且灵敏度和重现性均能满足分析要求。

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

将不锈钢基底薄片置于浓盐酸(37wt％)中超声1h，将擦干净的薄片放入超纯水中超声30min，重复两次酸洗、水洗操作，将所得薄片置于干燥的烧杯内，在95℃烘箱中干燥2h，将干燥的薄片分别用铝箔包起来，放入干燥皿内，充入氮气备用。

将PAN材料和DMF按照质量比为1：15的比例搅拌混匀，置于95℃烘箱中加热30min，得到PAN胶状溶液；将石墨化羧基多壁碳纳米管(XFM42，直径为10nm，长度为70μm，纯度>99.9％；羧基含量为1.0wt％与PAN胶状溶液按照质量比为1:10混合，得到悬浮液；

将所述悬浮液置于喷瓶中，调节氮气压力为0.02MPa，在基底薄片上进行喷涂，喷涂后将所得基底薄片置于在90℃烘箱中干燥60s，然后取出继续上述喷涂-干燥步骤，至涂层厚度为60～80μm，在不锈钢基底表面得到薄膜固相微萃取涂层材料，即得到萃取薄片(简写为PAN-XFM42)。

薄膜固相微萃取涂层材料的实物图如图3所示，其中，基底上相邻两萃取薄片之间的距离优选为7nm，萃取薄片的长度优选为5cm，宽度优选为2mm，所述薄膜固相微萃取涂层材料的高度优选为1～1.5cm。从图3可知，制备的黑色固相微萃取涂层材料可以紧密均匀地附着在不锈钢薄片表面。

薄膜固相微萃取涂层材料放大3000倍的SEM图如图4所示。由图3～4可知，多壁碳纳米管的长度约为70μm。

实施例2～23

按照实施例1的方法制备萃取薄片。实施例1～23的实验条件如表1所示。

表1实施例1～23的实验条件

实施例24

配制浓度分别为0.05ppm和5.0ppm的DON乙腈溶剂标样，利用液相色谱-质谱联用法进行检测，0.05ppm的DON溶液标样的液质联用色谱图如图5所示，5.0ppm的DON溶液标样的液质联用色谱图如图6所示。

将10.0g的小麦粉置于50mL离心管中，添加浓度为0.1mg/kg的DON后静置20min，加入5g超纯水，涡旋振荡混匀1min后在7000r/min条件下离心5min，取1mL上层清液置于至96孔板，利用实施例11制备的萃取薄片进行薄膜固相微萃取。薄膜固相微萃取(SPME)条件：萃取薄片活化溶液甲醇水溶液(甲醇和水的体积比为1:1)，活化时间为30min，活化频率为800r/min；萃取时间为45min，萃取频率为800r/min；洗脱溶液为纯乙腈，洗脱时间为60min，洗脱频率为800r/min，氮吹时间为30min，氮吹频率为1200r/min，将氮吹后的溶液，用乙腈定容至1mL，过0.2μm滤膜后装入进样小瓶中，利用液相色谱-质谱联用法进行检测。其中，空白小麦粉的质谱图如图7所示，DON添加量为0.1mg/kg的小麦粉的质谱图如图8所示。

由图5～8可知，小麦粉和啤酒基质对呕吐毒素无干扰，仪器灵敏度可以满足检测小麦粉添加浓度为0.1mg/kg或啤酒添加浓度为0.1ppm。

其中，液相色谱-质谱联用法的检测条件如下：

采用液相色谱-质谱联用仪为岛津LCMS-8050配有岛津NexeraX2液相系统；色谱柱为ACQUITYBEH C₁₈(2.1×100mm，1.7μm)；流动相为甲醇:水＝30:70(v/v)；柱温为40℃；进样量为5μL；流动相流速为0.3mL/min。

质谱条件：毛细管电压为4.5kV(-)，雾化气压力为40psi，辅助气压力为40psi，气帘气压力为40psi，离子源温度为550℃；定量模式为MRM多反应监测模式，电离方式为-ESI；定量：定量离子295>265，DP(去簇电压)-27V，CE(碎裂电压)-15.4；定性：定性离子295>138，DP(去簇电压)-27V，CE(碎裂电压)-25.6。

实施例25

将10g啤酒4℃冰箱，冷藏30min后取出，利用超声仪在25℃、80Hz频率条件下超声120min以脱气，在7000r/min条件下离心3～10min，加入质量百分比为5％的氯化钠，待氯化钠溶解后，取1mL该啤酒溶液放入96孔板，利用实施例12制备的萃取薄片进行薄膜固相微萃取。

其中，TFME条件：萃取薄片活化溶液甲醇水溶液(甲醇:水体积比＝1:1)，活化时间为30min，活化频率为800r/min；萃取时间为30min，萃取频率为1200r/min；洗脱溶液为纯乙腈，洗脱时间为60min，洗脱频率为1200r/min；氮吹时间为30min，氮吹频率为1200r/min；将氮吹后的溶液，用乙腈定容至1mL，过0.2μm滤膜后装入进样小瓶中，利用液相色谱-质谱联用法进行检测。其中，空白啤酒的质谱图如图9所示，DON添加量为0.1ppm的啤酒的质谱图如图10所示。

液相色谱-质谱联用法的检测条件与实施例24相同。

实施例26

采用外标法对DON进行定量分析。

(1)DON溶剂标样的标准曲线测定：用乙腈配置浓度分别为0.05ppm、0.10ppm、0.50ppm、1.0ppm、2.0ppm和5.0ppm的DON溶液，利用液相色谱-质谱联用法进行检测，以峰面积对DON标准溶液的浓度进行拟合分析，DON标准曲线如图11所示，回归方程y＝2000000x-377962，R²＝0.9972。表明仪器对于呕吐毒素的响应在浓度范围0.05ppm～5.0ppm内，呈现良好线性关系。

(2)小麦粉基质标准曲线测定：称取2.50g的小麦粉，添加一定浓度的呕吐毒素标准溶液，使得最终小麦粉中添加浓度分别为0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.5mg/kg、1.0mg/kg、2.0mg/kg、5.0mg/kg，静置30min后，再分别加入5mL超纯水，涡旋振荡混匀，7000r/min离心5min。提取上清液，每个加标水平设置3个平行样，加入96孔方孔板中，利用实施例11～16制备的萃取薄片进行薄膜固相微萃取和液相色谱-质谱联用法进行分析(TFME条件和液相色谱-质谱联用法检测条件与实施例24相同)，以峰面积对小麦粉中DON的添加浓度进行拟合分析，结果如图12所示，回归方程y＝14888x-17.243，R²＝0.9978，定量限LOQ为0.1mg/kg，表明该线性方程可以用于定量计算含有DON浓度范围0.1mg/kg～5.0mg/kg的小麦粉样品。

(3)啤酒基质标准曲线测定：将啤酒样品先置于4℃冰箱冷藏30min后取出，利用超声仪在30℃、80Hz频率条件下超声1h以脱气，取5组啤酒溶液，DON的添加情况如表2所示，取各组的啤酒溶液，每个加标水平设置3个平行样，加入到96孔方孔板中，利用实施例17～22制备的萃取薄片进行薄膜固相微萃取和液相色谱-质谱联用法进行分析(TFME条件和液相色谱-质谱联用法检测条件与实施例25相同)，以峰面积对啤酒中DON的添加浓度进行拟合分析，结果如图13所示，回归方程y＝30999x-3488.7，R²＝0.9841，定量限LOQ为0.05ppm。

表2啤酒样品添加情况

由图13可知，该线性方程可以用于定量计算含有DON浓度范围0.05mg/kg～5.0mg/kg的啤酒样品，峰面积和浓度的线性关系良好。

实施例27

配制浓度为0.416ppm的DON水溶液放入96孔板，利用实施例1～23制备的萃取薄片进行薄膜固相微萃取，利用液相色谱-质谱联用法检测DON的浓度，测试结果如表3所示，其中，TFME条件和液相色谱-质谱联用法检测条件与实施例24相同。

表3 DON水溶液的测试结果

由表3可知，利用本发明提供的萃取薄片对于0.416ppm的DON水溶液进行薄膜固相微萃取后，加标回收率在65.4％～79.5％，RSD为4.59％，表明本发明提供的方法回收率和重现性好。

对比例1

根据《食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定免疫亲和层析净化高效液相色谱法(GB/T 23503-2009)》分别检测小麦粉和啤酒中的DON，测试结果如表4所示。

表4谷物中薄膜固相微萃取与免疫亲和柱净化法检测DON结果比较

由表4可知，与免疫亲和柱净化法相比，本发明提供的薄膜固相微萃取的方法灵敏度高、溶剂使用量少、单个样品分析时间短，可同时分析96个样品，满足了高通量风险筛查的技术要求。此外该方法能够实现自动化操作，分析成本大大降低。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种薄膜固相微萃取涂层材料，其特征在于，组成上包括聚丙烯腈材料和石墨化羧基多壁碳纳米管。

2.根据权利要求1所述的薄膜固相微萃取涂层材料，其特征在于，所述石墨化羧基多壁碳纳米管材料和聚丙烯腈的质量比为1：(0.2～4.0)。

3.根据权利要求2所述的薄膜固相微萃取涂层材料，其特征在于，所述石墨化羧基多壁碳纳米管的直径为10～20nm，长度为10～100μm，纯度>99.9％，羧基质量含量为0.1～2wt％。

4.权利要求1～3任一项所述薄膜固相微萃取涂层材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述聚丙烯腈材料和有机溶剂的质量比为1：(10～20)；

所述有机溶剂包括N,N'-二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、二甲基丙酰胺、二乙基甲酰胺或二乙基乙酰胺。

6.权利要求1～3任一项所述薄膜固相微萃取涂层材料或权利要求4～5任一项所述制备方法制备的薄膜固相微萃取涂层材料在高通量检测呕吐毒素中的应用。

7.一种呕吐毒素的高通量检测方法，其特征在于，

(i)当检测固态含呕吐毒素原料时，包括以下步骤：

将固态含呕吐毒素原料和水混合后离心，得到待测液；

将所述待测液置于多孔板中进行第一薄膜固相微萃取；

(ii)当检测液态含呕吐毒素原料时，包括以下步骤：

将液态含呕吐毒素原料和氯化钠混合后离心，得到待测液；

将所述待测液置于多孔板中进行第二薄膜固相微萃取；

(i)和(ii)中，所述第一薄膜固相微萃取和第二薄膜固相微萃取采用的薄膜固相微萃取涂层材料独立地为权利要求1～3任一项所述薄膜固相微萃取涂层材料或权利要求4～5任一项所述制备方法制备的薄膜固相微萃取涂层材料。

8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，(i)中，所述固态含呕吐毒素原料和水的用量比为1g：(1～5)mL；所述固态含呕吐毒素原料包括谷物、谷物制品或鸡蛋。

9.根据权利要求7所述的高通量检测方法，其特征在于，

(ii)中，所述液态含呕吐毒素原料和氯化钠的质量比为1：(0.01～0.1)；所述液态含呕吐毒素原料包括液态谷物制品或牛奶。

10.根据权利要求7所述的高通量检测方法，其特征在于，所述第一薄膜固相微萃取和第二薄膜固相微萃取的条件独立地包括：

萃取薄片的活化溶液为甲醇水溶液；震荡萃取频率为700～1300r/min；直接浸入萃取的时间为10～60min；洗脱液为乙腈、甲醇、乙腈水溶液或甲醇水溶液，洗脱时间为10～70min；氮吹的时间为20～180min；将氮吹所得浓缩液用乙腈定容至1mL，过膜后进行仪器分析。