CN111073872B

CN111073872B - Dna损伤修复体系、dna文库构建试剂盒及文库构建方法

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Publication number: CN111073872B
Application number: CN201911329714.6A
Authority: CN
Inventors: 汪彦荣; 姬晓勇; 潘晓西; 王建伟
Original assignee: Beijing Youxun Medical Devices Co ltd
Current assignee: Beijing Youxun Medical Devices Co ltd
Priority date: 2019-12-20
Filing date: 2019-12-20
Publication date: 2022-04-22
Anticipated expiration: 2039-12-20
Also published as: CN111073872A

Abstract

本发明提供了一种DNA损伤修复体系、DNA文库构建试剂盒及文库构建方法。该DNA损伤修复体系包括DNA损伤修复酶，DNA损伤修复酶为UDG。通过利用上述含有UDG的DNA损伤修复体系，在文库构建前先对损伤进行修复，对修复后的DNA进行文库构建，能够增加部分文库的转化，满足杂交捕获的用量，并且能够提高所构建得到的文库的质量，提高目的片段的测序深度，降低产出数据中的重复序列，从而提高检测准确性，降低上机成本。

Description

DNA损伤修复体系、DNA文库构建试剂盒及文库构建方法

技术领域

本发明涉及文库构建领域，具体而言，涉及一种DNA损伤修复体系、DNA文库构建试剂盒及文库构建方法。

背景技术

早在1948年，Mandel和Métais首次报道了人体血液中游离核苷酸(cfNA)的存在。在报道初期并未引起科学家们对cfNA存在的重视，直到在1994年一篇关于癌症患者的血液中检测到了RAS基因的突变，人们才意识到了cfDNA的重要性。随着细胞游离DNA(cell-freeDNA)在癌症患者的血液中被检测到了微卫星体变异，在过去的十几年中研究人员对于癌症病人血液中cfNAs(DNA,mRNA,microRNAs)研究的大量投入，cfDNA的潜在研究价值越来越显著。

液体活检(Liquid Biopsy)与传统的组织活检相比有着迅速、便捷、损伤性小等众多优点。临床医生可以用它来监测肿瘤对治疗的反应，预测肿瘤复发。从长远角度来看，液体活检还能够帮助医生在患者未出现任何症状的时候发现最初期的肿瘤。同时cfDNA的含量水平不单单只反映肿瘤生长进展，也可以在正常人体内呈现相关的波动性变化。一般来说，恶性肿瘤患者cfDNA的含量高于无肿瘤患者，但是人们依旧可以在良性病变、炎症、组织创伤中进行定量化来进行区分。到现今为止，是什么生理因素的改变导致癌症的发生和进展依旧没有研究彻底，但是可以通过对循环肿瘤细胞游离DNA(ctDNA)的研究就能对肿瘤的发生及其进展进行监测，了解其相关突变基因。此外，循环miRNAs最近也被证明是潜在的癌症生物标记物。

细胞游离DNA(Cell free DNA，缩写为cfDNA)通常是指长度为峰值约为167bp的双链DNA小片段，常出现在外周血或其它组织液中，主要来源于自身正常细胞的凋亡降解。循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA，缩写为ctDNA)是指人体血液循环系统中不断流动的肿瘤来源的DNA片段，这些片段携带了很多关于肿瘤的信息，包括基因突变、缺失、插入、重排、拷贝数异常及甲基化等。这些信息可用于检测肿瘤早期诊断、进展过程、预后判断及个性化用药指导，可见检测循环肿瘤DNA的信息对于临床的重要性。

不同肿瘤患者体内的cfDNA大部分由其本身正常细胞和癌细胞代谢凋亡释放产生，同时其体内的线粒体和病毒也会造成cfDNA的增多，这些波动都可以被不同的荧光检测(PicoGreen染色发光和紫外线光谱法)或定量PCR(SYBR Green染料法和TaqMan探针法)来进行检测区分。尽管癌症患者比正常健康人群体内的含有更多的cfDNA，但是彼此的血浆和血清中的cfDNA含量差异还是显著明显的。相关研究显示，对于癌症患者每毫升血液中可以得到最少0ng，最多大于1000ng的cfDNA，平均每毫升血液中含有180ng的cfDNA。而正常健康人群中每毫升血液最多可以提取到100ng的cfDNA，平均每毫升30ng。然而很难从这些研究中来确定人体内具体的cfDNA含量，毕竟这些研究调查的患者数量规模较小，而且对于cfDNA的定量方法也不尽相同。由于正常人和癌症患者体内的cfDNA含量有重叠，所以不能单单用cfDNA的含量来诊断受检者是否患有癌症，所以需要将其他肿瘤标志物和cfDNA的含量共同结合来评判。一般在进行手术治疗后，癌症患者体内的cfDNA含量会很快的降低到比正常健康人群平均cfDNA含量还低的水平，如果仍有大量的cfDNA存在，也可表明手术治疗后还有残留的肿瘤组织存在。

现有检测循环肿瘤DNA突变的方法有很多，但基于二代测序的方法应用最多，检测手段也最为丰富。在基于二代测序的方法中最为主要的技术实现手段有两种：一种为高深度测序的目标区域捕获或扩增方法，另一种为加分子条形码或分子标签的建库测序方法。这两种方法在实验上依据常规二代测序建库方法，不仅可以有效的检测到样本循环肿瘤DNA的高频突变，而且还能有效地检测到低频甚至超低频突变(>＝0.1％)。

然而，现有方法所提取的ctDNA(4mL血浆样本)所得到的ctDNA在10～1000ng范围内波动，为了满足一些用药位点的低频率检测，甚至肿瘤早筛的目的，有限的建库起始输入对ctDNA有效文库转化是及其重要的。目前的技术，检测想达到1％的检出率，稳定的建库起始用量在50ng以上是比较可靠的。即使提取达到50ng以上，有的样本依旧有不少样本无法构建出足够量的文库(至少1000ng的文库)，用于去做杂交捕获。而为了满足杂交捕获，需要增加循环数，导致后期生物信息分析结果的重复(Duplication)数值高，浪费上机数据量及其成本。何况依然有较高比例的样本低于50ng的建库起始量，在0.5％甚至更低的频率检测，结果的真实性不理想。

因此，仍需要提升ctDNA的文库的构建质量。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种DNA损伤修复体系、DNA文库构建试剂盒及文库构建方法，以解决现有技术中ctDNA文库构建质量低，无法满足检测某些低频突变的问题。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种DNA损伤修复体系，该DNA损伤修复体系包括DNA损伤修复酶，DNA损伤修复酶为UDG。

进一步地，DNA损伤修复体系还包括内切核酸酶IV及T4 PDG。

进一步地，在单位体积的DNA损伤修复体系中，UDG的酶活力单位为3～4U。

进一步地，在单位体积的DNA损伤修复体系中，内切核酸酶IV的酶活力单位为6～8U，T4 PDG的活力单位为6～8U。

根据本申请的第二个方面，提供了一种DNA文库构建试剂盒，该试剂盒包括DNA损伤修复体系，DNA损伤修复体系包括上述任一种DNA损伤修复体系。

进一步地，试剂盒还包括DNA末端修复体系，DNA末端修复体系包括T4 DNA聚合酶和PNK激酶，优选DNA末端修复体系中，T4 DNA聚合酶的浓度为50-100U/μL，PNK激酶的浓度为100～200U/μL。

进一步地，试剂盒中，DNA损伤修复体系与DNA末端修复体系按等体积配置。

进一步地，DNA末端修复体系还包括末端修复缓冲液。

根据本申请的第三个方面，提供了一种DNA文库的构建方法，该构建方法采用上述任一种试剂盒构建而成。

进一步地，构建方法包括：采用上述任一种试剂盒对片段化DNA进行修复，得到修复DNA；对修复DNA进行文库构建，得到DNA文库；优选地，在20℃～30℃温度下进行修复20～30min，得到修复DNA；优选地，片段化DNA为基因组DNA打断后的片段化DNA或cfDNA。

应用本发明的技术方案，通过利用上述含有UDG的DNA损伤修复体系，在文库构建前先对损伤进行修复，对修复后的DNA进行文库构建，能够增加部分文库的转化，满足杂交捕获的用量，并且能够提高所构建得到的文库的质量，提高目的片段的测序深度，降低产出数据中的重复序列，从而提高检测准确性，降低上机成本。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1示出了根据本发明的实施例1中采用ddPCR方法验证低频样本1的突变频率的结果图；以及

图2示出了根据本发明的实施例1中采用ddPCR方法验证低频样本2的突变频率的结果图。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。

如背景技术所提到的，现有的ctDNA的提取方法所得到的DNA的量有些无法满足低频突变检测的要求，为了改善这一状况，在一种典型的实施方式中，提供了一种DNA损伤修复体系，该DNA损伤修复体系包括DNA损伤修复酶，DNA损伤修复酶为UDG(Uracil-DNAGlycocasylase，尿嘧啶-DNA糖基化酶)。

本申请的发明人通过试验发现，ctDNA存在某种未知的损伤，在文库构建前先对损伤进行修复，利用上述含有UDG的DNA损伤修复体系，对修复后的DNA进行文库构建，能够增加部分文库的转化，满足杂交捕获的用量，并且能够提高所构建得到的文库的质量，提高目的片段的测序深度，降低产出数据中的重复序列，从而提高检测准确性，降低上机成本。

上述DNA损伤修复体系中，主要的修复酶为UDG，该UDG酶能够抓取DNA分子链中的碱基对，并用特定形状的“口袋”来进行检查，如果碱基对排列形状正确则将其放回原处，如果形状有误则将其清除，DNA分子链中留下的空白由体系中的其他修复机酶来修补。通过进一步对含有UDG的DNA修复体系进行筛选和优化，发现当UDG与内切核酸酶IV、T4 PDG形成修复体系时，对文库转化的增量效果最优。因此，在本申请一种优选的实施例中，上述DNA损伤修复体系还包括内切核酸酶IV和T4 PDG。

进一步优化发现，在单位体积的上述DNA损伤修复体系中，UDG的活力单位为3～4U，对ctDNA所能构建的文库的量的增加尤为明显，所构建的文库中的目的片段的测序深度较深，有效数据量也相对比较高，因而测序结果也更准确。

在一种优选的实施例中，在单位体积的DNA损伤修复体系中，内切核酸酶IV的的活力单位为6～8U、T4 PDG的的活力单位为6～8U。含有上述范围的酶形成的DNA损伤修复体系对cfDNA损伤修复的效果最佳。

在本申请第二种典型的实施例中，还提供了一种DNA文库构建试剂盒，该试剂盒包括DNA损伤修复体系，DNA损伤修复体系包括上述任一种DNA损伤修复体系。含有本申请上述DNA损伤修复体系的试剂盒所构建的文库的量不仅能够满足捕获文库所需量，而且所构建的文库产出的有效数据量高，能够实现对低频突变的检测。

为了进一步提高文库构建的便利性，在本申请另一种优选的实施例中，上述试剂盒还包括DNA末端修复体系，该DNA末端修复体系包括T4 DNA聚合酶和PNK激酶，优选DNA末端修复体系中，T4 DNA聚合酶的浓度为50～100U/μL，PNK激酶的浓度为100～200U/μL。

通过在试剂盒中同时含有传统文库构建所需要的末端修复体系，有助于在末端修复步骤中同时实现对DNA损伤的修复，进而提高所构建的文库的量，从而产出较多的有效数据量。

在一种优选的实施例中，上述试剂盒中，DNA损伤修复体系与DNA末端修复体系按等体积配置。等体积配置有利于修复反应的充分进行。

在另一种优选的实施例中，DNA末端修复体系还包括末端修复缓冲液，末端修复缓冲液可以选自现有的末端修复缓冲体系，也可以自行配制，本申请中采用的是自行配制的缓冲体系，其主要成分包括Tris-Hcl、dNTP、ATP、H₂O。

在本申请第三种典型的实施例中，还提供了一种DNA文库的构建方法，该构建方法采用上述任一种试剂盒构建而成。采用本申请的上述试剂盒所构建的文库的量能够满足文库捕获所需，且文库产出数据中重复序列小，有效数据量较高，能够实现低频突变的检测。

在上述构建方法中，可采用与现有方法相同的步骤进行。在一种优选的实施例中，上述构建方法包括：采用上述任一种试剂盒对片段化DNA进行修复，得到修复DNA；对修复DNA进行文库构建，得到DNA文库。更优选地，在20℃～30℃下进行修复20～30min，得到修复DNA。在该温度下进行修复上述时间范围，对损伤DNA的修复成功率高，且效率高。当试剂盒中仅含有DNA损伤修复体系时，上述DNA修复的步骤可以结合DNA末端修复体系一起进行。当试剂盒中同时含有DNA损伤修复体系和DNA末端修复体系时，对DNA的修复操作更方便。

需要说明的是，本申请的上述DNA损伤修复体系不仅适用于ctDNA，同样适用于基因组DNA打断后的DNA片段，或者其他方式受损伤的DNA片段。

下面将结合具体的实施例来进一步说明本申请的有益效果。

实施例1对DNA损伤修复体系进行筛选和优化

选取了以下具有修复功能的酶：

尿嘧啶-DNA糖基化酶(Uracil-DNAGlycosylase，UDG)、

DNA聚合酶I(DNA,E.coli)、

内切核酸酶VIII(Endonuclease VIII)、

内切核酸酶IV(Endonuclease IV)、

T7内切核酸酶I(T7 Endonuclease I)、

T4 PDG聚合酶I(又称T4 Endonuclease V)。分别进行不同的排列组合进行修复体系的测试，组合方式如下所示：

表1：非UDG酶+其他修复酶

表2：UDG酶+其他修复酶

表3：UDG酶+内切核酸酶IV+T4 PDG

*表示酶在保存或长时间使用过程中，酶活可能会下降，但如果降至其新鲜状态时的酶活的一半时则不能用于试验。

针对以上三种组合和一组不加修复酶体系的实验进行对比筛选，本实施例的临床样本来源于肺癌患者血浆样本中提取的cfDNA。提取后的cfDNA均按照20ng建库起始量进行建库，得到文库，然后进行上机测序，通过样本建库文库产出，数据产出、测序深度以及分析结果和突变频率等方面进行对比。

利用上述表1、2、3所示损伤修复酶体系进行DNA修复及文库构建，具体步骤如下：

1)末端修复及加A

先将末端修复缓冲液置于室温融化彻底后，Vortex 10s，瞬时离心3s；

(末端修复缓冲液-20℃冻存时为白色固体，室温彻底融化后为无色透明液体，如果液体中有白色晶体或者白色颗粒存在，需要进一步的延长室温平衡时间，可以Vortex处理加速晶体或颗粒溶解，保证修复缓冲液变为无色澄清的液体性状后方可使用)；

2)按照下表配制末端修复工作液：

表4：

3)向片段化DNA体系中加入末端修复工作液(每个样本13μL)，Vortex 10s，瞬时离心3s后，按照下表进行PCR仪器程序设定，进行末端修复反应温育；(PCR仪器热盖温度85℃)；

表5：

4)在末端修复反应进行时，将连接反应缓冲液(连接Buffer)静置于4℃冰箱进行融化；根据任务单拿出所需Adapter，静置于4℃冰箱；

5)在末端修复反应结束后，从PCR仪中拿出样本后，再按紧一下PCR管盖，Vortex4s，瞬时离心3s。

按下表配制连接反应工作液(连接反应缓冲液+连接酶)

表6：

配制好的连接工作液Vortex3s,瞬时离心3s后静置于冰上；

向末端修复反应体系中先加入Adapter；

表7：

加完Adapter之后，Vortex 10s，瞬时离心3s之后再加入配制好45μL的连接反应工作液；加完连接反应工作液后再Vortex10s，瞬时离心3s；

6)连接反应需要按照下表进行PCR仪器程序设置；

(PCR仪器热盖温度设置45℃)

表8：

7)用AMPure XP磁珠纯化连接产物，充分混匀AMPure XP Bead悬浮液，在1.5mL新的离心管中加入0.8x混匀的AMPure XP Bead悬浮液，转移70μL连接产物至离心管中，Vortex混匀5s，室温放置10min孵育；磁力架吸附3min，弃上清，80％的乙醇洗两次，晾干，加入23μL nuclease-free water洗脱DNA。

8)在洗脱的时候开始按照下表配制PCR扩增工作液：

表9：

配制好的PCR扩增工作液静置于冰上；

9)将离心管放入PCR仪,热盖温度105℃

按下表设置程序进行反应

表10：

10)用AMPure XP磁珠纯化连接产物，充分混匀AMPure XP Bead悬浮液，在1.5mL新的离心管中加入1.0x混匀的AMPure XP Bead悬浮液，转移50μL连接产物至离心管中，Vortex混匀5s，室温放置10min孵育；磁力架吸附3min，弃上清，80％的乙醇洗两次，晾干，加入23μL nuclease-free water洗脱DNA。

11)取1μL用

3.0Fluorometer检测DNA浓度，并吸取大约23μL上清到一个新的1.5ml管中，在此步可以丢弃磁珠。

12)进行上述文库上机测序，得到测序数据，对产出的数据量、测序深度、测序深度以及分析结果和突变频率等方面进行了检测，结果如下：

表11：

以上两例低频样本(EGFR:p.L858R)和(EGFR:p.T790M)突变分别进行了ddPCR验证，得到准确的突变频率为：样本1(0.333％，参见图1，根据分析软件自动计算得到)，样本2(0.302％，参见图2，根据分析软件自动计算得到)。因此，结合上表可知，采用UDG酶的损伤修复体系的文库出库量、测序深度都能满足检出和计算突变频率的要求，而采用非UDG酶的损伤修复体系的文库出库量和测序深度都较低，数据产出大多为重复序列，因而目标突变未能检出。而采用UDG酶+内切核酸酶IV+T4 PDG的损伤修复体系修复后的样本1和样本2不仅能检出结果，而且检出结果也更准确。

实施例2

针对上述表3所示的损伤修复体系进一步对其中三种酶的用量进行了筛选和优化，同时对反应温度进行了优化，我们选择了同样的上述两例血浆样本，然后进行了不同用量比例(体积比)和不同温度下的修复反应，具体如下：

表12：

	名称	比例1	比例2	比例3	比例4	比例5	比例6
								1	内切核酸酶IV	0.4	0.5	0.6	0.3	0.1	0.2
2	T4 PDG	0.3	0.4	0.2	0.3	0.4	0.2.
								3	UDG	0.3	0.1	0.2	0.4	0.5	0.6

将表12所示的比例形成的各种损伤修复体系，按照与实施例1相同的步骤，对同样的两例样本(EGFR:p.L858R和EGFR:p.T790M突变样本)进行文库构建和性能检测，检测结果见下表。

表13：

从表13可以看出，样本1和样本2均在比例1和比例4条件下的文库出库量和测序深度较优，且检出的突变频率也更接近真实的突变频率。而其他条件下有些尽管也能检出，但突变频率与实际的突变频率差异较大，结果可信度低。由此可见，当单位体积的酶体系中，三种酶的体积用量在0.3～0.4μL的范围内时(即三种酶的活力单位分别为内切核酸酶IV：6～8U；T4 PDG：6～8U；UDG：3～4U)，效果都较优。当比例为0.4:0.3:0.3.时(即三种酶的活力单位分别为内切核酸酶IV：8U；T4 PDG：6U；UDG：3U)，效果最优。

为进一步优化本申请的修复效果，我们进一步对末端修复步骤的温度进行了优化，分别设置了15℃、20℃、25℃、30℃、35℃5个温度条件，利用表12中效果最佳比例的损伤修复体系，分别在上述5个温度下进行修复、文库构建及上机测序和性能检测，检测结果见下表。

表14：

从表14可以看出，在20℃～30℃的范围内时，效果都较好，其中，在30℃下的样本测序有效深度最好。

从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：

1.本申请提供的DNA损伤修复体系，应用于ctDNA的文库构建，修复后的ctDNA可以对当前建库起始量的输入进行文库构建后，增加部分文库转化，满足杂交捕获的用量。

2.本申请改进的文库构建方法，能够在原先的工艺基础上降低1-2个Pre-PCR循环数。

3.采用本申请的酶修复体系进行的文库构建方案所构建的文库对产出数据后期的分析，降低了重复序列的占有量，提高有效数据量，降低上机成本。

4.采用本申请的酶修复体系进行的文库构建方案，能够有效的保证20ng的建库起始用量的结果真实性和可靠性。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种DNA文库的构建方法，其特征在于，所述构建方法采用试剂盒构建而成，所述剂盒包括DNA损伤修复体系，所述DNA损伤修复体系包括DNA损伤修复酶，所述DNA损伤修复酶为UDG，所述DNA损伤修复体系还包括内切核酸酶IV及T4 PDG，在单位体积的所述DNA损伤修复体系中，所述UDG的酶活力单位为3~4U，所述内切核酸酶IV的酶活力单位为6~8U，所述T4PDG的活力单位为6~8U。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述试剂盒还包括DNA末端修复体系，所述DNA末端修复体系包括T4 DNA 聚合酶和PNK激酶。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述DNA末端修复体系中，所述T4 DNA聚合酶的浓度为50-100U/μL，所述PNK激酶的浓度为100~200U/μL。

4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述试剂盒中，所述DNA损伤修复体系与所述DNA末端修复体系按等体积配置。

5.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述DNA末端修复体系还包括末端修复缓冲液。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：

采用所述试剂盒对片段化DNA进行修复，得到修复DNA；

对所述修复DNA进行文库构建，得到所述DNA文库。

7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，

在20℃~30℃温度下修复20~30min，得到所述修复DNA。

8.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述片段化DNA为cfDNA。